基于活性的探針化合物、組合物及其使用方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 相關(guān)申請的交叉引用
[0002] 本申請要求2013年3月15日遞交的美國臨時(shí)申請No. 61/794, 296的權(quán)益，其公 開內(nèi)容通過引用的方式全部納入本文。
[0003] 政府支持說明
[0004] 本發(fā)明是在政府支持的項(xiàng)目編號(hào)為5R01NS045684-07(由美國國立衛(wèi)生研究院頒 發(fā)）的項(xiàng)目下作出的。政府對本發(fā)明擁有特定的權(quán)利。
【背景技術(shù)】
[0005] 目前正在開發(fā)各種技術(shù)以用于分子成像和疾病監(jiān)測的領(lǐng)域。特別是，光學(xué)熒光成 像是一種由于其敏感性、特異性和非侵入性而開始呈現(xiàn)出作為臨床工具潛力的方法。熒光 光學(xué)探針的特異性在某些情況下可以通過生物靶標(biāo)來提供。例如，如果探針的熒光只在酶 反應(yīng)的情況下釋放時(shí)，在生物樣品中通過酶靶標(biāo)識(shí)別的光學(xué)探針往往產(chǎn)生非常特異性的信 號(hào)。理想情況下，即使在熒光信號(hào)已經(jīng)通過酶反應(yīng)被激活的情況下，探針的熒光部分也與 它的酶靶標(biāo)保持相連。已經(jīng)公開了將這樣的基于熒光活性的探針（ABP)用于蛋白酶靶標(biāo)。 Blum 等，（2009) PLoS One 4: e6374;doi :10.1371/journal, pone. 0006374。通過 ABP 與酶 的活性部分催化殘基之間的反應(yīng)而生成的永久性共價(jià)鍵，從而能夠從簡單的熒光底物中區(qū) 分出ABP。雖然由于由靶標(biāo)酶進(jìn)行的催化反轉(zhuǎn)而導(dǎo)致的信號(hào)放大使得熒光底物可能似乎是 有利的，但是已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，APB由于對靶標(biāo)酶的共價(jià)修飾，示出了增加的組織攝入動(dòng)力學(xué)和在 靶組織中延長的探針保持期。
[0006] 其中，所關(guān)注的與基于熒光的光學(xué)探針一起使用的靶標(biāo)酶是蛋白酶，特別是 半胱氨酸蛋白酶。該半胱氨酸蛋白酶是在健康與疾病中起到重要作用的蛋白酶家族。 Reiser等，（2010) J. Clin. Invest. 120:3421-31。雖然它們的功能已經(jīng)主要描述為限 制于胞內(nèi)體途徑中，然而越來越多的證據(jù)證明它們是基質(zhì)降解的主要調(diào)節(jié)子，表明了它 們也在細(xì)胞外發(fā)揮作用。_&^請榭0嫌；[18011(2011)1?0160；1^05^七6；[1160&1：116口8；[118；[11 Extracellular Proteolysis.Biology of Extracellular Matrix Volume 2 23-510 此外，已經(jīng)示出，半胱氨酸組織蛋白酶家族是幾種類型的癌癥的發(fā)展和進(jìn)程的主要參與 者。Mohamed&Sloane (2006) Nat. Rev. Cancer (2006) 6 : 764-75 ;Palermo&Joyce (2008) Trends Pharmacol. Sci. 29:22-8。此外，已在癌癥觀察到半胱氨酸組織蛋白酶內(nèi)源抑制 劑（半胱氨酸蛋白酶抑制劑）表達(dá)的改變。Cox(2009)Cystatins and cancer.Front. Biosci. 14:463-74。這些觀察，與胞內(nèi)和胞外環(huán)境的潛在變化聯(lián)合，強(qiáng)調(diào)了允許在天然腫瘤 微環(huán)境的情況中，直接評估這些蛋白酶的活性的工具的重要性。已經(jīng)合成了針對半胱氨酸 組織蛋白酶家族的幾種 ABP。Edgington 等，（2011)Curr.0pin.Chem. Biol. 15:798-805。特 別地，熒光淬滅ABP(qABP)已被證明是在組織水平、細(xì)胞水平和蛋白水平上，用于癌癥的非 侵入性光學(xué)成像以及隨后表征靶組織蛋白酶的強(qiáng)有力的工具。Blum等，（2007)Nat. Chem. Biol. 3:668-77 ;Verdoes 等·（2012)Chem. Biol. 19:619-28。
[0007] 已經(jīng)報(bào)道了基于2, 3, 5, 6-四氟苯氧基芳基甲基酮反應(yīng)性基團(tuán)的基于活性的二肽 肽酶I的抑制劑（Deu等，（2010)Chem Biol. 17:808-819)，但是這些抑制劑是非肽的，并且 不包括可檢測的基團(tuán)。
[0008] 還報(bào)道了用于含有活性蛋白酶（如組織蛋白酶）的細(xì)胞的熒光成像的淬滅的基于 活性的肽抑制劑。參見，例如，美國專利申請公開No. 2007/0036725。這些探針采用了酯連 接的酰氧基甲基酮反應(yīng)性基團(tuán)來結(jié)合蛋白酶活性部位。在一些情況中，基于活性的熒光探 針是非肽探針。參見，例如，PCT國際公開No. W0 2012/118715。在一些情況中，基于活性的 探針用于放射性標(biāo)記其靶標(biāo)酶。參見，例如，PCT國際公開No. W0 2009/124265。
[0009] 然而，在該領(lǐng)域仍然需要新型的基于活性的半胱氨酸蛋白酶的熒光探針，其具有 更高的細(xì)胞攝取率，靶向更廣譜的半胱氨酸蛋白酶活性，并且提供提高的檢測靈敏性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明通過提供用于標(biāo)記半胱氨酸蛋白酶的化合物、組合物以及所述化合物和組 合物的使用方法，從而解決了上述問題和其它問題。
[0011] 特別地，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供一種由結(jié)構(gòu)式（I)表示的化合物：
[0013] 其中
[0014] L是醚連接的離去元件；
[0015] T是靶標(biāo)元件；
[0016] D是可檢測元件。
[0017] 在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，該D基團(tuán)是熒光標(biāo)記、放射性標(biāo)記或螯合劑。
[0018] 在特定的實(shí)施方案中，D基團(tuán)是熒光標(biāo)記，甚至更具體的說是熒光素、俄勒岡綠 (Oregon green)、氟硼焚染料、羅丹明或花菁標(biāo)記。在還更特定的實(shí)施方案中，焚光標(biāo)記是 花菁標(biāo)記，如Cy5。
[0019] 在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，T基團(tuán)將化合物靶向半胱氨酸蛋白酶。在某些實(shí)施 方案中，T基團(tuán)是非肽靶標(biāo)元件（例如包含三唑結(jié)構(gòu)的元件），包括（例如）各種特定的包 含三唑結(jié)構(gòu)的元件。在某些其它實(shí)施方案中，T基團(tuán)是肽靶標(biāo)元件。
[0020] 在一些化合物的實(shí)施方案中，D-T-基團(tuán)是
[0022] 其中1^是接頭；
[0023] AA^氨基酸側(cè)鏈；
[0024] U 是 0、N 或 S ;
[0025] 是烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、雜芳基、雜芳烷基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、環(huán)烷基燒 基、雜環(huán)基、雜環(huán)基烷基或保護(hù)基，并任選地由1個(gè)至3個(gè)A基團(tuán)所取代；和
[0026] 各A獨(dú)立地是烷基、烯基、炔基、烷氧基、燒醜基、燒氣基、芳基、芳氧基、芳基氣基、 芳烷基、芳烷氧基、芳烷酰基、芳烷氨基、雜芳基、雜芳氧基、雜芳基氨基、雜芳烷基、雜芳烷 氧基、雜芳烷?；㈦s芳烷氨基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、環(huán)烷基烷基、環(huán)烷氧基、環(huán)烷?；?、環(huán)烷氨 基、雜環(huán)基、雜環(huán)氧基、雜環(huán)基氨基、雜環(huán)基烷基、雜環(huán)基烷氧基、雜環(huán)基烷?；?、雜環(huán)基烷氨 基、羥基、硫代基、氨基、烷酰基氨基、芳?；被?、芳烷酰基氨基、烷基羧基、碳酸酯、氨基甲 酸酯、胍基、脲基、鹵基、三鹵代甲基、氰基、硝基、磷?；⒒酋；⒒前被虔B氮基。
[0027] 在特定化合物的實(shí)施方案中，1^是任選取代的烷基接頭，其中各碳原子任選地被 雜原子置換。
[0028] 在其它特定化合物的實(shí)施方案中，A4是芳烷基氨基酸側(cè)鏈并任選地被1個(gè)至3個(gè) A基團(tuán)所取代。
[0029] 在還一其它特定化合物的實(shí)施方案中，U是0。
[0030] 在一些實(shí)施方案中，D基團(tuán)是熒光標(biāo)記、放射性標(biāo)記或螯合劑。
[0031] 在特定的實(shí)施方案中，D基團(tuán)是熒光標(biāo)記，甚至更具體的說是熒光素、俄勒閃綠，、 氟硼熒染料、羅丹明或花菁標(biāo)記。在還更特定的實(shí)施方案中，熒光標(biāo)記是花菁標(biāo)記，如Cy5。
[0032] 在一些化合物的實(shí)施方案中，L基團(tuán)包含淬滅劑，在更特定的實(shí)施方案中，L是 L2-L3-Q，其中L2是苯氧基，L 3是接頭，和Q是泮滅劑.
[0033] 在特定的實(shí)施方案中，L是
[0035] 其中各Y獨(dú)立地是吸電子基團(tuán)或氫。
[0036] 在更特定的實(shí)施方案中，各Y獨(dú)立地是鹵素或氫，在還更特定的實(shí)施方案中，L是
[0038] 1^是任選取代的烷基接頭，其中各碳原子任選地被雜原子置換。
[0039] 在還更特定的實(shí)施方案中，L是
[0041] R是QSY淬滅劑，且η是1至16的整數(shù)。
[0042] 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，QSY淬滅劑是親水性QSY淬滅劑，更具體地說，親水性QSY淬 滅劑是磺基-QSY淬滅劑。
[0043] 在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，化合物是由結(jié)構(gòu)式（II)表示的化合物：
[0045] 其中D是焚光標(biāo)記，L3是接頭，且Q是泮滅劑。
[0046] 在更特別的實(shí)施方案中，化合物是由結(jié)構(gòu)式（III)表示的化合物：
[0048] 其中R是QSY淬滅劑，D是花菁染料，且m和η獨(dú)立地是1至16整數(shù)。在一些實(shí) 施方案中，R基團(tuán)可以是QSY21或磺基-QSY21，且D基團(tuán)可以是Cy5。
[0049] 本發(fā)明特定的化合物包括以下化合物：
[0051] 其中 R = QSY21 且 η = 6 ;
[0052] R =磺基-QSY21 且 η = 6 ;
[0053] R = QSY21 且 η = 2 ;和
[0054] R =橫基-QSY21 且 η = 2。
[0055] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明化合物和藥學(xué)上可接受的載體 的組合物，其用于在動(dòng)物體內(nèi)標(biāo)記蛋白酶。
[0056] 根據(jù)本發(fā)明的還另一方面，本發(fā)明提供了一種在動(dòng)物體內(nèi)標(biāo)記蛋白酶的方法，該 方法包括以下步驟：
[0057] 向動(dòng)物施用本發(fā)明的組合物。
[0058] 本發(fā)明還提供了一種使動(dòng)物體內(nèi)的腫瘤可視化的方法，該方法包括以下步驟：
[0059] 向動(dòng)物施用本發(fā)明的組合物，并測定在動(dòng)物體內(nèi)，由于組合物與組織蛋白酶半胱 氨酸蛋白酶之間的反應(yīng)所產(chǎn)生的可檢測的信號(hào)，其中該可檢測的信號(hào)與動(dòng)物體內(nèi)的腫瘤有 關(guān)。
[0060] 在特定的方法實(shí)施方案中，可檢測的信號(hào)是熒光信號(hào)。在其它特定的方法實(shí)施方 案中，熒光信號(hào)是在腫瘤邊緣產(chǎn)生的。
【附圖說明】
[0061] 圖1. a)在這項(xiàng)工作中合成的qABP GB137 (1)和探針2至8的結(jié)構(gòu)。b)在活RAW 細(xì)胞中1 μΜ的探針1至8的標(biāo)記圖譜。c)在活RAW細(xì)胞中探針1和8的濃度依賴性標(biāo)記。 d)在活RAW細(xì)胞中探針1-8相對于5 μΜ GB 137(1)的總組織蛋白酶標(biāo)記強(qiáng)度。
[0062] 圖2. a)在pH 5. 5下，探針8對RAW細(xì)胞裂解物的濃度依賴性標(biāo)記。b)在活RAW 細(xì)胞中，〇. 5 μ Μ探針8的標(biāo)記時(shí)間進(jìn)程。c)在活RAW細(xì)胞中，利用JPM-OEt (50 μ Μ)進(jìn)行預(yù) 處理對探針1和8的標(biāo)記抑制和血清穩(wěn)定性。d)暴露于1 μ Μ探針8的RAW細(xì)胞的活細(xì)胞 熒光顯微圖（上排圖）或與溶酶體示蹤劑（lysotracker)共定位的顯微圖（第二排圖，比 例尺：10 ym)。
[0063] 圖3. a)注射有探針8和1 (右圖）的荷瘤小鼠的非侵入性光學(xué)成像的時(shí)間-過程 圖。底下的圖表示各時(shí)間點(diǎn)的最佳熒光對比。b)用探針1或8(n = 3 ;數(shù)據(jù)代表平均值土 標(biāo)準(zhǔn)誤差）處理的小鼠時(shí)間依賴性的腫瘤特異性熒光（腫瘤-背景）。c)在進(jìn)行SDS-PAGE 之后通過凝膠內(nèi)熒光掃描而可視化的離體腫瘤熒光（上圖）和體內(nèi)熒光標(biāo)記的蛋白質(zhì)（下 圖）。d)在非侵入性光學(xué)成像（在a中示出）、離體腫瘤成像以及凝膠內(nèi)熒光標(biāo)記（在c中 示出）的結(jié)束點(diǎn)的熒光強(qiáng)度。示出了相對于探針1的強(qiáng)度（η = 3 ;數(shù)據(jù)代表平均值土標(biāo) 準(zhǔn)誤差）。e)探針8處理（左圖）的腫瘤組織切片熒光的顯微圖，其中進(jìn)行了 CD68免疫染 色（中圖）和核染色（DAPI-右圖，比例尺：50 μπι)。f)探針8(紅色）處理的腫瘤組織切 片的CLSM的三維重構(gòu)，其中進(jìn)行了⑶68免疫染色（綠色）和核染色（DAPI -藍(lán)色）。
[0064] 圖4. a)BMV109標(biāo)記的半胱氨酸組織蛋白酶的免疫沉淀。b、c)在活的RAW細(xì)胞中， 探針1-8的濃度依賴性標(biāo)記。b)和c)中的圖分別是在相同的凝膠上進(jìn)行電泳的。
[0065] 圖5.a)注射探針1、2、6或8達(dá)到8小時(shí)后的荷瘤小鼠的非侵入性光學(xué)成像圖。底 下的圖表示各時(shí)間點(diǎn)的最佳熒光對比。b)用探針1、2、6或8 (η = 3 ;數(shù)據(jù)代表平均值土標(biāo) 準(zhǔn)誤差）處理的小鼠的時(shí)間依賴性的腫瘤特異性熒光（腫瘤-背景）。c)在進(jìn)行SDS-PAGE 之后通過凝膠內(nèi)熒光掃描而可視化的離體腫瘤熒光（上圖）和體內(nèi)熒光標(biāo)記的蛋白質(zhì)（下 圖）。d)在非侵入性光學(xué)成像（在a中示出）、離體腫瘤成像以及凝膠內(nèi)熒光標(biāo)記（在c中 示出）的結(jié)束點(diǎn)的熒光強(qiáng)度。示出了相對于探針1的強(qiáng)度（η = 3 ;數(shù)據(jù)代表平均值土標(biāo)準(zhǔn) 誤差）。e)探針8處理（第一、第三和第四列）的腫瘤組織切片的熒光顯微圖，其中進(jìn)行了 ⑶68免疫染色（第二、第三和第四列）以及核染色（DAPI，第三和第四列，比例尺：50 μπι)。 示出了無探針對照（中間行的圖）和進(jìn)行免疫染色的異型對照（下圖）。f)探針8(Cy5) 和⑶68(FITC)的共定位圖。
【具體實(shí)施方式】
[0066] 半胱氨酸組織蛋白酶是在正常細(xì)胞生理學(xué)中，以及在許多人類疾病的病理學(xué)中發(fā) 揮重要作用的蛋白酶家族。因此，已開發(fā)出了許多底物和基于活性的探針（ABP)類別來研 究這些酶的功能。本文提供一類基于淬滅熒光活性的探針，在一些實(shí)施方案中，其包含苯氧 基甲基酮（PMK)親電體。與先前的的報(bào)道ABP相比，這些試劑顯示出對于半胱氨酸組織蛋 白酶增強(qiáng)的光譜反應(yīng)性，從而導(dǎo)致體外和體內(nèi)的標(biāo)記性能大幅度地提高。本文中，進(jìn)一步地 證明了探針在小鼠體內(nèi)以空前的信號(hào)強(qiáng)度和對比度顯示腫瘤。這些新的試劑能夠在人類疾 病的多種模型中以機(jī)體水平、組織水平、細(xì)胞水平和蛋白質(zhì)水平研究半胱氨酸組織蛋白酶。
[0067] 化合物
[0068] 因此，在一些方面，本發(fā)明提供了一種用于標(biāo)記蛋白酶，特別是組織蛋白酶的新型 化合物。本發(fā)明的化合物可以是式（I)的化合物：
[0070] 其中
[0071] L是醚連接的離去元件；
[0072] T是靶標(biāo)元件；和
[0073] D是可檢測元件。
[0074] 本發(fā)明化合物的靶標(biāo)元件T可以是肽或非肽結(jié)構(gòu)，優(yōu)選使化合物靶向半胱氨酸蛋 白酶。
[0075] 以這些目的而納入本發(fā)明化合物中使用的非肽結(jié)構(gòu)元件的非限制性實(shí)例的是PCT 國際公開NO.W02012/118715中所描述的那些，它的全部內(nèi)容通過引用納入本文。在優(yōu)選的 實(shí)施方案中，非肽靶標(biāo)元件包括三唑結(jié)構(gòu)。
[0076] 具有非肽靶標(biāo)元件的本發(fā)明化合物的特定例子為：
[0078] 用于將化合物靶向半胱氨酸蛋白酶（特別是半胱氨酸組織蛋白酶）的可用于納入 本發(fā)明化合物的肽結(jié)構(gòu)元件的非限制性例子是PCT國際公開No. W02009/124265中所描述 的那些，它的全部內(nèi)容通過引用納入本文。
[0079] 在本發(fā)明化合物的一些實(shí)施方案中，D-T-是
[0080]
[0081] 其中1^是接頭；
[0082] 六六1是氨基酸側(cè)鏈；
[0083] U 是 0、N 或 S ;
[0084] 是烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、雜芳基、雜芳烷基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、環(huán)烷基燒 基、雜環(huán)基、雜環(huán)基烷基或保護(hù)基，并任選地由1個(gè)至3個(gè)A基團(tuán)所取代；和
[0085] 各A獨(dú)立地是烷基、烯基、炔基、烷氧基、燒醜基、燒氣基、芳基、芳氧基、芳基氣基、 芳烷基、芳烷氧基、芳烷酰基、芳烷氨基、雜芳基、雜芳氧基、雜芳基氨基、雜芳烷基、雜芳烷 氧基、雜芳烷?；?、雜芳烷氨基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、環(huán)烷基烷基、環(huán)烷氧基、環(huán)烷酰基、環(huán)烷氨 基、雜環(huán)基、雜環(huán)氧基、雜環(huán)基氨基、雜環(huán)基烷基、雜環(huán)基烷氧基、雜環(huán)基烷?；㈦s環(huán)基烷氨 基、羥基、硫代基、氨基、烷酰基氨基、芳?；被⒎纪轷；被?、烷基羧基、碳酸酯、氨基甲 酸酯、胍基、脲基、鹵基、三鹵代甲基、氰基、硝基、磷酰基、磺?；?、磺氨基或疊氮基。
[0086] 如本文所使用的術(shù)語"烷基"是指飽和脂肪族基團(tuán)，其包括直鏈烷基、支鏈烷基、環(huán) 烷基（脂環(huán)族）、烷基取代的環(huán)烷基和環(huán)烷基取代的烷基。在一些實(shí)施方案中，直鏈或支鏈 烷基在其骨架中具有30個(gè)以下的碳原子（例如，直鏈CfC3。，支鏈C3-C3。)，更具體地20個(gè) 以下。同樣地，一些環(huán)烷基在其環(huán)結(jié)構(gòu)中具有3至10個(gè)碳原子，更具體地環(huán)結(jié)構(gòu)中具有5、 6或7個(gè)碳。
[0087] 此外，如在整個(gè)說明書、實(shí)施例和權(quán)利要求書中所使用的術(shù)語"烷基"（或"低級(jí) 烷基"）旨在包括"未取代的烷基"和"取代的烷基"，取代的烷基是指烷基部分具有取代了 烴骨架上的一個(gè)或多個(gè)碳上的氫的取代基。這樣的取代基可（例如）包括鹵基、羥基、羰 基（例如酬基、駿基、烷氧基幾基、甲醜基或醜基）、硫代幾基（