一種貝殼杉烷類二萜化合物及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于藥物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及從小豆蔻的干燥成熟果實(shí)中分離得到的一種 具有肝臟保護(hù)作用的貝殼杉烷類二萜化合物及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 植物小豆蔻為多年生草本。根莖粗壯，棕紅色。葉兩列，葉片狹長(zhǎng)披針狀，葉鞘具棕 黃色柔毛。穗狀花序由莖基部抽出?；ㄐ蝻@著伸長(zhǎng)，花排列稀疏，花冠白色。果實(shí)長(zhǎng)卵圓形， 果皮質(zhì)韌，不易開裂。種子團(tuán)分3瓣，每瓣種子5~9枚，種子氣味芳香而峻烈。主產(chǎn)越南、斯里 蘭卡和印度南部的馬拉巴(Malabar)海岸。實(shí)成熟時(shí)收采，除去殘留的果柄，曬干。使用部分 為姜科植物小豆蔻的干燥果實(shí)。
[0003] 藥材小豆蔻為姜科植物小豆蔻Elettaria cardamomum(L. )Maton的干燥近成熟果 實(shí)，是藏醫(yī)與維吾爾醫(yī)用藥，以"加素"之名始載于《四部醫(yī)典》，現(xiàn)被多國藥典收載。小豆蔻 是世界著名的植物藥與香料，被稱為"香料之后"，原產(chǎn)于印度南部、斯里蘭卡及瓜地馬拉等 地，在印度傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中使用歷史超過兩千年，具有祛風(fēng)、健胃的功效。目前中醫(yī)很少使用，小 豆蔻曾以"豆蔻"之名收載于1953年版中國藥典。
[0004] 小豆蔻已報(bào)道的成分主要為揮發(fā)油，以及多糖與蛋白質(zhì)，推測(cè)還含有黃酮類化合 物，但目前尚未見黃酮類成分單體的分離與鑒定。揮發(fā)油是小豆蔻中重要的活性成分，含量 高達(dá)7%，超聲提取得到的揮發(fā)油以α-乙酸松油脂、桉油精、芳樟醇、α-松油醇、乙酸芳樟酯 為主，與超臨界C0 2提取所得成分類似;如以正己烷提取，揮發(fā)油組分有所不同，為檸檬烯、 桉油精、萜品油烯、月桂烯。此外，還含有麝香草醇、橙花基醋酸酯、蒎烯、橙花叔醇、香檜烯 等。
[0005] 小豆蔻藥理活性多樣，尤以抗腫瘤活性報(bào)道最多，涉及皮膚、肺、結(jié)腸等多個(gè)部位 的腫瘤，對(duì)胃腸道也有較好的保護(hù)作用，此外，還具有抗菌、抗氧化、抗炎、鎮(zhèn)痛等作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種從小豆蔻的干燥成熟果實(shí)中分離得到的貝殼杉烷類二 萜化合物，該貝殼杉烷類二萜化合物具有肝臟保護(hù)作用;本發(fā)明的另一個(gè)發(fā)明目的在于提 供上述貝殼杉烷類二萜化合物的制備方法。
[0007] 本發(fā)明的上述目的是通過下面的技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)的：
[0008] -種貝殼杉烷類二萜化合物，它具有下述結(jié)構(gòu)式的化合物(I)，
[0009]
[0010] -種上述貝殼杉烷類二萜化合物的制備方法，包含以下操作步驟：
[0011] (a)小豆蔻的干燥成熟果實(shí)粉碎，用80%乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無 醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水飽和的正丁醇萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯 萃取物和正丁醇萃取物；
[0012] (b)步驟(a)中乙酸乙酯萃取物用大孔樹脂除雜，依次用15%乙醇和75%乙醇洗 脫，收集75 %乙醇洗脫液，減壓濃縮得75 %乙醇洗脫物浸膏;所述大孔樹脂為AB-8型大孔吸 附樹脂；
[0013] (C)步驟(b)中75%乙醇洗脫浸膏用正相硅膠分離，依次用體積比為80:1、50:1、 30:1、15 :1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得至1」5個(gè)組分；
[0014] (d)步驟(C)中組分4用正相硅膠進(jìn)一步分離，依次用體積比為20:1、12:1和5:1的 二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個(gè)組分；
[0015] (e)步驟（d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積百分濃度為 70 %的甲醇水溶液等度洗脫，收集8-10個(gè)柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到純的化合物 (1)〇
[0016] 本發(fā)明化合物用作藥物時(shí)，可以直接使用，或者以藥物組合物的形式使用。實(shí)驗(yàn)表 明，上述貝殼杉烷類二萜化合物化合物（I)能使肝細(xì)胞對(duì)之后經(jīng)歷的缺血再灌注損傷的耐 受力增強(qiáng)，表現(xiàn)為肝細(xì)胞活力增強(qiáng)，細(xì)胞死亡率降低。即化合物（I)能夠減輕人肝細(xì)胞缺血 再灌注損傷，起到肝細(xì)胞保護(hù)作用。
[0017]以化合物（I)的治療有銷量為主藥作為藥物組合物的形式使用時(shí)，可藥用載體或 賦形劑可以是一種或多種選自固體、半固體和液體稀釋劑、填料以及藥物制品輔劑。將本發(fā) 明的藥物組合物以單位體重服用量的形式使用。即本發(fā)明化合物（I)作為藥物可通過口服 或注射的形式施用于需要治療的患者。用于口服時(shí)，可將其制成片劑、緩釋片、控釋片、膠 囊、滴丸、微丸、混懸劑、乳劑、散劑或顆粒劑、口服液等；用于注射時(shí)，可制成滅菌的水性或 油性溶液、無菌粉針、脂質(zhì)體或乳劑等。
【附圖說明】
[0018] 圖1為化合物(I)結(jié)構(gòu)式。
【具體實(shí)施方式】
[0019] 下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明保護(hù)范 圍。盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì) 本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和范圍。
[0020] 實(shí)施例1:化合物(I)分離制備及結(jié)構(gòu)確證
[0021] 藥材和試劑來源：乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷為分析純，購自上海 凌峰化學(xué)試劑有限公司，甲醇，分析純，購自江蘇漢邦化學(xué)試劑有限公司。小豆蔻購自安徽 亳州中藥材市場(chǎng)。
[0022] 制備方法：（a)小豆蔻的干燥成熟果實(shí)(8kg)粉碎，用80%乙醇熱回流提取(25L X 3 次），合并提取液，濃縮至無醇味(6L)，依次用石油醚(6LX3次）、乙酸乙酯(6LX3次)和水飽 和的正丁醇(6LX3次)萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物(355g)和正丁醇萃取 物；（b)步驟(a)中乙酸乙酯萃取物用AB-8型大孔樹脂除雜，依次用15 %乙醇（8L)和75 % (12L)乙醇洗脫，收集75%乙醇洗脫液，減壓濃縮得75%乙醇洗脫物浸膏（136g);(c)步驟 (b)中75%乙醇洗脫浸膏用正相硅膠分離，依次用體積比為80:1(8個(gè)柱體積）、50:1(8個(gè)柱 體積）、30:1 (6個(gè)柱體積）、15:1 (8個(gè)柱體積)和1:1 (5個(gè)柱體積）的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫 得到5個(gè)組分；（d)步驟(c)中組分4(31g)用正相硅膠進(jìn)一步分離，依次用體積比為20:1(8個(gè) 柱體積）、12:1(10個(gè)柱體積）和5:1(6個(gè)柱體積）的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個(gè)組分； (e)步驟(d)中組分2(llg)用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積百分濃度為70%的 甲醇水溶液等度洗脫，收集8-10個(gè)柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到純的化合物（I) (23mg)〇
[0023] 結(jié)構(gòu)確證:冊(cè)431]\^顯示[]\1+他]+為111/2 369.1712，結(jié)合核磁特征可得分子式為 C20H26〇5，不飽和度為8。核磁共振氫譜數(shù)據(jù)δΗ( ΡΡπι，DMS〇-d6，500MHz): H-1 (4 · 80，t，J = 8 · 6)， H-2(1.83，m)，H-3(1.32，d，J=13.5)，H-3(1.20，m)，H-5(2.48，br，s)，H-6(9.79，br，s)，H-9 (4.24，d，J=9.3)，H-ll(6.42,overlap)，H-12(6.39,overlap)，H-13(3.08，m)，H-14(2.09， d，J=10.8)，H-14(1.88,overlap)，H-15(5.71，s)，H-17(5.36，s)，H-17(5.05，s)，H-18 (1.01，s)，H-19(0.97，s)，H-20(4.31，d，J = 8.5)，H-20(4.25，d，J = 8.5);核磁共振碳譜數(shù) 據(jù)Sc(ppm，DMS0-d6，125Hz):77.4(CH，l-C)，24.1CH2,2-C)，37.4(CH2,3-C)，31.3(C，4-C)， 54.5(CH，5-C)，206.5(CH，6-C)，176.4(C，7-C)，51.2(C，8-C)，42.4(CH，9-C)，54.3(C，10-C)，126.9(CH，n-C)，136.2(CH，12-C)，40.3(CH，13-C)，37.1(CH2，14-C)，77.1(CH，15-C)， 155.4(C，16-C)，106.7(CH2，17-C)，33.1(CH 3，18-C)，23.5(CH3，19-C)，68.1(CH2,20-C);碳 原子標(biāo)記參見圖1。IR光譜結(jié)果顯示，化合物（I)含有羥基、內(nèi)酯羰基、醛基和雙鍵(3427CHT 1、 1723CHT1、1740CHT1和1631 cnf1)基團(tuán)。核磁數(shù)據(jù)表明，該化合物是1，8-內(nèi)酯結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)貝殼 杉烷類二萜。4-? COSY譜中，烯烴次甲基的質(zhì)子(δΗ6.42和6.39)與H-9和H-13的相關(guān)性，表 明 C-11 和 C-12 之間含有雙鍵;HMBC 譜中 Η-11(δΗ6.42)與 C-9(SC42.4)，C-1O0C54.3#PC-13 0〇4〇.3)以及!1-9(5!14.24)，!1-130!13.〇8)和!12-14(5!12.〇9和1.88)與(：-120(：136.2)的相 關(guān)性驗(yàn)證了上述推測(cè)。該化合物結(jié)構(gòu)如圖1所示。
[0024]實(shí)施例2:化合物（I)藥理作用試驗(yàn) [0025] -、材料和儀器
[0026] HL7702肝細(xì)胞株由中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究所提供?；衔铮↖)為自制(純度 大于98% )。高糖DMEM培養(yǎng)基、高糖DMEM/F12 = 1:1培養(yǎng)基、胎牛血清均購于HycLoneJDTA購 于上海試劑一廠。臺(tái)盼藍(lán)購于北京化工廠。無糖DMEM培養(yǎng)基購于Gibco。胰酶、MTT、DMS0均購 于Amrescc^LDH釋放法檢測(cè)試劑盒購于GENMDEALT生化檢測(cè)試劑盒、AST生化檢測(cè)試劑盒、 LDH生化檢測(cè)試劑盒均購于美國貝克曼試劑有限公司。Western及IP細(xì)胞裂解液、PMSF、BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒、MDA檢測(cè)試劑盒均購于碧云天生物研究所。
[0027] C02培養(yǎng)箱，SheL-Lab 2300;電熱恒溫孵育箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠;缺氧培養(yǎng)盒， 長(zhǎng)沙長(zhǎng)錦科技有限公司；酶標(biāo)儀，美國BioTek Epoch;全自動(dòng)生化儀，Beckman LX20;離心 機(jī)，德國Eppendorf centrifyge 5415D。
[0028] 二、試驗(yàn)方法
[0029] 1、細(xì)胞分組
[0030] 將細(xì)胞分為6組，每組6個(gè)復(fù)孔：（1)正常培養(yǎng)組(N組）：完全培養(yǎng)基，正常條件下培 養(yǎng)；（2)缺血再灌注組（IR組）：完全培養(yǎng)基正常條件下培養(yǎng)lh后，模擬缺氧8h，再灌注4h; (3) 化合物（I)組:RE1組:化合物（I) 0.5ng/mL預(yù)處理lh; RE2組:化合物（I) 5ng/mL預(yù)處理lh; RE3 組:化合物（I)50ng/mL預(yù)處理lh;模擬缺氧8h，再灌注4h; (4)生理鹽水組(NS組）：以與化合 物（I)同等體積的生理鹽水預(yù)處理1 h，模擬缺氧8h，再灌注4h。
[0031] 2、化合物（I)的預(yù)處理
[0032] (1)化合物（I)的配制：將lmg化合物（I)溶解于500mL生理鹽水中。移液槍吸取 2.5mL于第一支離心管中，用生理鹽水稀釋至10mL配制成濃度為500ng/mL的化合物（I)溶 液。從第一支離心管中吸取lmL至第二支離心管中，用生理鹽水稀釋至10mL配制成濃度為 50ng/mL的化合物（I)溶液。從第二支離心管中吸取lmL至第三支離心管中，用生理鹽水稀釋 至1 OmL配制成濃度為5ng/mL的化合物（I)溶液。作好標(biāo)記。
[0033] (2)化合物（I)預(yù)處理：正常培養(yǎng)組和缺血再灌注組以每孔100yL新鮮的完全培養(yǎng) 基更換。RE1組每孔加入5ng/mL的化合物（I)溶液10yL和新鮮的完全培養(yǎng)基90yL，RE2組每孔 加入50ng/mL的化合物（I)溶液10yL和新鮮的完全培養(yǎng)基90yL，RE3組每孔加入500ng/mL的 化合物（I)溶液l〇yL和新鮮的完全培養(yǎng)基90yL。生理鹽水組每孔加入生理鹽水10yL和