一種用于制備nk細(xì)胞的試劑盒及其應(yīng)用方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種用于制備NK細(xì)胞的試劑盒及其應(yīng)用方法，該試劑盒包括：(1)NK細(xì)胞的純化體系；(2)NK細(xì)胞的誘導(dǎo)分化體系；(3)NK細(xì)胞的誘導(dǎo)成熟體系；(4)NK細(xì)胞的誘導(dǎo)增殖體系；其中，IL?2的終濃度為10ng/ml，IL?15的終濃度為50ng/ml。本申請(qǐng)僅僅通過(guò)低劑量的IL?2和IL?15兩種細(xì)胞因子組合，實(shí)現(xiàn)在體外可以高效穩(wěn)定地?cái)U(kuò)增NK細(xì)胞，在NK細(xì)胞的培養(yǎng)過(guò)程中，不僅可以促進(jìn)NK細(xì)胞的增殖分化，也可以促進(jìn)NK細(xì)胞分泌IFN?γ、TNF?α等細(xì)胞因子，產(chǎn)生協(xié)同促進(jìn)的作用，增強(qiáng)其抗瘤活性，而且體外擴(kuò)增的NK細(xì)胞回輸?shù)襟w內(nèi)后，延長(zhǎng)NK細(xì)胞凋亡的時(shí)間，可顯著提高腫瘤治療的效果。
【專利說(shuō)明】
一種用于制備NK細(xì)胞的試劑盒及其應(yīng)用方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域，具體地，涉及一種用于制備NK細(xì)胞的試劑盒及其應(yīng)用方法。
【背景技術(shù)】
[0002]目前，癌癥已超過(guò)心臟病，成為全球第一大死亡原因。WHO在2014年12月公布，根據(jù)報(bào)告預(yù)測(cè)，全球每年新增癌癥患者數(shù)呈迅猛增長(zhǎng)態(tài)勢(shì)，由2012年的1400萬(wàn)名，將逐年增加到2025年的1900萬(wàn)人，2035年的2400萬(wàn)人。癌癥是中國(guó)居民死亡的主要原因之一，據(jù)全國(guó)腫瘤登記中心發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示，2012年全世界癌癥病例新增1400萬(wàn)癌癥病例，約有820萬(wàn)人死亡。根據(jù)2012年全國(guó)登記年報(bào)，中國(guó)每年新增癌癥患者350萬(wàn)例，占全球總數(shù)的兩成，平均每天確診9889人，全國(guó)每分鐘有6人被診斷為癌癥，約有250萬(wàn)人死于癌癥。手術(shù)、放療和化療是治療腫瘤的三大常規(guī)方式。傳統(tǒng)的治療癌癥的手段，雖然能在短時(shí)間內(nèi)有效減輕腫瘤負(fù)荷，但因其不能有效得清除腫瘤細(xì)胞，手術(shù)后微小殘存病灶、對(duì)化療產(chǎn)生耐藥及對(duì)放療不敏感的患者腫瘤易發(fā)生轉(zhuǎn)移，且副作用大等弊端，使得腫瘤的臨床療效不顯著。腫瘤細(xì)胞免疫治療作為一種全新的腫瘤全身治療方式，能系統(tǒng)殺滅腫瘤細(xì)胞，有效抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、擴(kuò)散和復(fù)發(fā)，副反應(yīng)小等良好的臨床治療效果，克服了腫瘤傳統(tǒng)治療方式的“不徹底、易轉(zhuǎn)移、副作用大”等弊端，是目前國(guó)際上公認(rèn)的繼手術(shù)、放療和化療之后最有希望完全消滅腫瘤細(xì)胞的第四大治療腫瘤的新技術(shù)。
[0003]目前，腫瘤細(xì)胞免疫治療應(yīng)用于臨床的細(xì)胞有DC細(xì)胞、CIK細(xì)胞、DC-CIK細(xì)胞和NK細(xì)胞等。自然殺傷性細(xì)胞(Natural killer cells,NK cells)是一群不同于T、B淋巴細(xì)胞的大顆粒淋巴細(xì)胞，無(wú)需抗原的預(yù)先致敏和活化即可發(fā)揮細(xì)胞毒效應(yīng)，并可分泌多種細(xì)胞因子及趨化因子。NK細(xì)胞是一個(gè)非常安全的效應(yīng)細(xì)胞，可以避免細(xì)胞因子風(fēng)暴、腫瘤溶解綜合癥。活化的NK細(xì)胞能夠表達(dá)多種共刺激因子，如⑶80、⑶86、⑶70、0X40L、2B4等，直接與T細(xì)胞相互作用而刺激獲得性免疫應(yīng)答;活化的NK細(xì)胞也可能具有APC樣表型，直接行使抗原提呈功能從而促進(jìn)T細(xì)胞免疫應(yīng)答。人類NK細(xì)胞具有特有的標(biāo)志CD56和CD16分子但缺乏T細(xì)胞抗原CD3XD16為免疫球蛋白Fe受體，介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)效應(yīng)，⑶56分子為粘附分子。人類NK細(xì)胞定義為表型⑶3—OT16+⑶56+。爾細(xì)胞含有大量的NK穿孔素和顆粒酶B攻擊靶細(xì)胞。同時(shí)，NK細(xì)胞分泌IFN-γ、TNF-a、GM-CSF和IL-3等細(xì)胞因子間接殺傷腫瘤。K562是人體外周血NK細(xì)胞敏感的靶細(xì)胞，對(duì)其殺傷功能的檢測(cè)可作為NK細(xì)胞功能檢測(cè)的主要指標(biāo)之一。
[0004]目前，NK細(xì)胞制備技術(shù)中存在以下問(wèn)題:
[0005](I)經(jīng)體外擴(kuò)增回輸?shù)讲∪梭w內(nèi)有效的NK細(xì)胞效應(yīng)細(xì)胞數(shù)量少，作用于腫瘤靶細(xì)胞的殺傷功能較低，且浸潤(rùn)到腫瘤組織的NK細(xì)胞數(shù)量非常少。因而限制了腫瘤治療的效果，不能顯著的提高腫瘤患者尤其是晚期患者的生存期。(2)正常人體外周血中的NK細(xì)胞數(shù)量較少，僅占外周血的淋巴細(xì)胞的10%?20%。
[0006]因此，NK細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增后提高細(xì)胞的數(shù)量和細(xì)胞的殺傷功能是兩大關(guān)鍵因素。如何提高上述兩大關(guān)鍵因素是目前腫瘤細(xì)胞免疫治療技術(shù)亟需解決的問(wèn)題。
[0007]NK細(xì)胞是先天免疫中一類重要的細(xì)胞，通過(guò)細(xì)胞毒作用和分泌細(xì)胞因子參與集體抗感染和抗腫瘤免疫。NK細(xì)胞根據(jù)CD56分子表達(dá)密度的不同可將NK細(xì)胞分為CD56bl:1ght和⑶56dim兩個(gè)亞群，人正常PBMC中約90%NK細(xì)胞是⑶56dim，同時(shí)表達(dá)⑶16分子，主要參與NK細(xì)胞毒作用；約10 %NK細(xì)胞是⑶56biight亞群，不表達(dá)或低表達(dá)⑶16分子，主要參與NK細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的作用。靜止的NK細(xì)胞只表達(dá)IL-2親和力受體，低劑量IL-2不能有效促進(jìn)NK細(xì)胞的殺傷水平，可能是低劑量的IL-2不能誘導(dǎo)高親和力受體的表達(dá)，當(dāng)加入IL-15后，促進(jìn)IL-2高親和力IL-2R表達(dá)，從而促進(jìn)NK細(xì)胞殺傷功能。IL-2是第一個(gè)被批準(zhǔn)用來(lái)治療腫瘤的細(xì)胞因子。體內(nèi)和體外的實(shí)驗(yàn)表明IL-2能增加NK細(xì)胞的數(shù)量，提高NK細(xì)胞的殺傷力能力。對(duì)于臨床而言，體內(nèi)注射細(xì)胞因子IL-2擴(kuò)增NK細(xì)胞的效果有限，對(duì)患者毒副作用大，臨床上體內(nèi)大劑量IL-2，會(huì)引起嚴(yán)重的毛細(xì)血管滲漏綜合癥。目前體外擴(kuò)增NK細(xì)胞后回輸給患者是臨床常用的方法。體外NK細(xì)胞擴(kuò)增單獨(dú)使用IL-2，雖然可刺激T細(xì)胞增殖、調(diào)節(jié)B細(xì)胞的增殖與分化，但I(xiàn)L-15對(duì)NK細(xì)胞的發(fā)育和分化的調(diào)節(jié)作用十分明顯。研究表明，IL-15能夠促進(jìn)CD34+造血干細(xì)胞定向分化為NK細(xì)胞，并對(duì)NK細(xì)胞的發(fā)育分化及維持長(zhǎng)期體外存活等方面有顯著作用。因此本研究采用的IL-2和IL-15聯(lián)合使用，擴(kuò)增NK細(xì)胞。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的在于提供一種解決上述技術(shù)問(wèn)題的用于制備NK細(xì)胞的試劑盒及其應(yīng)用方法。
[0009]本發(fā)明通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
[0010]一種用于制備NK細(xì)胞的試劑盒，包括:
[0011](I)NK細(xì)胞的純化體系；
[0012](2)NK細(xì)胞的誘導(dǎo)分化體系，包括:1L-2以及IL-15;
[0013](3)NK細(xì)胞的誘導(dǎo)成熟體系，包括:NK細(xì)胞擴(kuò)增劑、IL-2以及IL-15;
[0014](4)NK細(xì)胞的誘導(dǎo)增殖體系，包括:1L-2以及IL-15;
[0015]其中，各體系中，IL-2的終濃度為10ng/ml，IL-15的終濃度為50ng/ml。
[0016]本申請(qǐng)中所說(shuō)的IL-2的低劑量具體是指IL-2的終濃度為10ng/ml、大劑量具體是指IL-2的終濃度為100ng/ml。
[0017]為解決現(xiàn)有技術(shù)中擴(kuò)增培養(yǎng)NK細(xì)胞時(shí)使用大劑量的IL-2，易引起嚴(yán)重的毛細(xì)血管滲漏綜合癥等副作用的問(wèn)題，本申請(qǐng)降低IL-2的劑量，避免上述問(wèn)題的發(fā)生，提高臨床使用安全性，另一方面，低劑量IL-2的使用，會(huì)導(dǎo)致由其培養(yǎng)的NK細(xì)胞的擴(kuò)增數(shù)量及其殺傷力能力降低(相對(duì)大劑量的IL-2來(lái)說(shuō))，而為了保持優(yōu)良的NK細(xì)胞的擴(kuò)增數(shù)量及其殺傷力能力，本申請(qǐng)僅僅通過(guò)低劑量的IL-2和IL-15兩種細(xì)胞因子組合，實(shí)現(xiàn)在體外可以高效穩(wěn)定地?cái)U(kuò)增NK細(xì)胞，而且在NK細(xì)胞的培養(yǎng)過(guò)程中，不僅可以促進(jìn)NK細(xì)胞的增殖分化，同時(shí)也可以促進(jìn)NK細(xì)胞分泌IFN-γ、TNF_a等細(xì)胞因子，產(chǎn)生協(xié)同促進(jìn)的作用，增強(qiáng)其抗瘤活性，而且體外擴(kuò)增的NK細(xì)胞回輸?shù)襟w內(nèi)后，延長(zhǎng)NK細(xì)胞凋亡的時(shí)間，可顯著提高腫瘤治療的效果。
[0018]IL-2和IL-15具有相似的空間結(jié)構(gòu)，其相應(yīng)受體共用況、γ c亞單位，但在功能上兩者并不相同。IL-15對(duì)NK細(xì)胞的發(fā)育和分化的調(diào)節(jié)作用十分明顯。研究表明，IL-15能夠促進(jìn)CD34+造血干細(xì)胞定向分化為NK細(xì)胞。IL-2和IL-15對(duì)PBMC和同種異體抗原活化，能免疫上調(diào)NK細(xì)胞的比例。低劑量IL-15和低劑量IL-2具有協(xié)同刺激NK細(xì)胞殺傷功能的作用，低劑量IL-2不能誘導(dǎo)高親和力受體的表達(dá)，加入IL-15后，促進(jìn)IL-2高親和力受體的表達(dá)，從而促進(jìn)NK細(xì)胞殺傷活性。
[0019]所述NK細(xì)胞擴(kuò)增劑中主要含有IFN-γ、TNF-a、TNF-0、GM_CSF等。其聯(lián)合細(xì)胞因子IL-2和IL-15，可以增加IL-2R和IL-15R的表達(dá)。同時(shí)，能夠體內(nèi)外顯著地?cái)U(kuò)增DC，刺激T細(xì)胞和NK細(xì)胞增殖。
[0020]其中，所述(I)NK細(xì)胞的純化體系包括:Perco 11分離液。將Perco 11分離液配制成分布在37.5 %-50 %區(qū)間的6個(gè)密度梯度，且每個(gè)梯度相差2.5 %，S卩，6個(gè)密度梯度分別為:37.5%、40%、42.5%、45%、47.5%、50%。通過(guò)將獲得的PBMC鋪于該密度梯度的上層并低速離心，以去除⑶3+細(xì)胞，獲得純化的NK細(xì)胞。
[0021]其中，所述(2)NK細(xì)胞的誘導(dǎo)分化體系還包括:含有5%自體血清的NK細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基。
[0022]其中，所述(3)NK細(xì)胞的誘導(dǎo)成熟體系還包括:抗⑶3單克隆抗體、重組人纖維連接蛋白和含5%自體血清的NK細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基。其中，所述抗CD3單克隆抗體的終濃度為50ng/ml，所述重組人纖維連接蛋白的終濃度為lyg/ml。
[0023]其中，所述(4)NK細(xì)胞的誘導(dǎo)增殖體系還包括:含有5%自體血清的NK細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基。
[0024]其中，NK細(xì)胞擴(kuò)增劑包括以下成分:GM-CSF、IL_4和TNF-a;
[0025]其中，本申請(qǐng)中所述的NK細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基包括:無(wú)血清培養(yǎng)基、2mmol/L左旋谷氨酰胺、100U/ml青霉素以及I OOU/ml鏈霉素。本申請(qǐng)所述的NK細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基由于加入了左旋谷氨酰胺、青霉素以及鏈霉素，能夠有效防止/抑制培養(yǎng)基中細(xì)菌的生長(zhǎng)。
[0026]一種應(yīng)用上述試劑盒制備NK細(xì)胞的方法，包括以下步驟:
[0027](I )NK細(xì)胞的純化:將獲得的PBMC去除⑶3+細(xì)胞，獲得純化的NK細(xì)胞；
[0028](2)NK細(xì)胞的誘導(dǎo)分化:將經(jīng)過(guò)上述步驟(I)獲得的純化后的NK細(xì)胞用培養(yǎng)基重懸，加入終濃度為10ng/ml的IL-2和終濃度為50ng/ml的IL-15進(jìn)行培養(yǎng)，第3天，離心后，再用培養(yǎng)基重懸NK細(xì)胞，加入終濃度為10ng/ml的IL-2以及終濃度為50ng/ml的IL-15，并調(diào)整NK細(xì)胞濃度，繼續(xù)培養(yǎng)并根據(jù)培養(yǎng)基顏色半量補(bǔ)充IL-2、IL-15和培養(yǎng)基，每天記錄NK細(xì)胞濃度；
[0029](3 )NK細(xì)胞的誘導(dǎo)成熟:第7天，將懸浮的NK細(xì)胞轉(zhuǎn)移至經(jīng)抗⑶3單克隆抗體和重組人纖維連接蛋白包被的培養(yǎng)瓶中，加入培養(yǎng)基、終濃度為10ng/ml的IL-2、終濃度為50ng/ml的IL-15和NK細(xì)胞擴(kuò)增劑，繼續(xù)培養(yǎng)；
[0030](4)NK細(xì)胞的誘導(dǎo)增殖:第8-13天，根據(jù)培養(yǎng)基顏色補(bǔ)充培養(yǎng)基，加入終濃度為10ng/ml的IL-2和終濃度為50ng/ml的IL-15，繼續(xù)培養(yǎng)至NK細(xì)胞生長(zhǎng)到所需數(shù)量即可。
[0031 ]其中，上述步驟(I )NK細(xì)胞的純化可以為:
[0032]先用PBS將？6代011分離液滲透壓調(diào)至28508/1^ H2O,再用pH7.2的PBS將PercolI分離液配成37.5%?50%區(qū)間的6個(gè)梯度，每個(gè)梯度相差2.5%，按照密度從高到低的添加順序依次加入試管中，將獲得的PBMC鋪于該試管上層，低速(在2000rpm下離心30min)離心，去除⑶3+細(xì)胞，獲得純化的NK細(xì)胞。純化后的NK細(xì)胞主要分布于(42.5?47.5)%的梯度層，以42.5%梯度層的NK細(xì)胞含量最高。
[0033]其中，上述步驟(2)NK細(xì)胞的誘導(dǎo)分化可以為:用含有5%自體血清的NK細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基重懸NK細(xì)胞，NK細(xì)胞濃度為1.0 X 16個(gè)/ml，加入終濃度為10ng/ml的IL-2和終濃度為50ng/ml的IL-15，置于37°C、5 %CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第3天，離心后，再用含有5 %自體血清的NK細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基重懸NK細(xì)胞，加入終濃度為10ng/ml的IL-2和終濃度為50ng/ml的IL-15 ， 并調(diào)整 NK 細(xì)胞濃度為1.0?2.0 X 16個(gè)/ml，置于37°C、5%C02培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。根據(jù)培養(yǎng)基顏色，半量補(bǔ)充IL-2、IL-15和培養(yǎng)基，每天記錄NK細(xì)胞濃度。
[0034]將NK細(xì)胞濃度調(diào)整為1.0?2.0 X 16個(gè)/ml保證細(xì)胞后續(xù)培養(yǎng)正常，不調(diào)整細(xì)胞數(shù)量的話，后續(xù)擴(kuò)增就會(huì)出現(xiàn)問(wèn)題，導(dǎo)致細(xì)胞增長(zhǎng)不起來(lái)，或提前凋亡。
[0035]其中，上述步驟(3)NK細(xì)胞的誘導(dǎo)成熟可以為:第7天，將懸浮的NK細(xì)胞轉(zhuǎn)移至經(jīng)終濃度為50ng/ml的抗CD3單克隆抗體和終濃度為lyg/ml的重組人纖維連接蛋白包被的培養(yǎng)瓶中，并加入含有5 %自體血清的NK細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基，終濃度為10ng/ml的IL-2、終濃度為50ng/ml的IL-15和4ml NK細(xì)胞擴(kuò)增劑，置于37°C,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以后根據(jù)培養(yǎng)基顏色半量補(bǔ)充含5%自體血清的NK細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基。
[0036]其中，上述步驟(4)NK細(xì)胞的誘導(dǎo)增殖可以為:第8-13天，根據(jù)培養(yǎng)基顏色補(bǔ)充含5%自體血清的NK細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基，加入終濃度為10ng/ml的IL-2和終濃度為50ng/ml的IL-15 ，置于 37°C 、5%C02 培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng) ，第14天，當(dāng)NK細(xì)胞生長(zhǎng)到所需數(shù)量即可。
[0037]其中，上述NK細(xì)胞的制備方法中，所述PBMC通過(guò)以下方式獲得:
[0038]采集腫瘤患者外周血50ml，肝素抗凝，加入等量PBS至血細(xì)胞中以稀釋血細(xì)胞，2000印111，離心101^11，將稀釋的外周血緩慢加入比重為1.077的人淋巴細(xì)胞分離液層上，二者比例為1:1。離心20min，將呈白霧狀的單個(gè)核細(xì)胞層輕輕吸出，移入另一離心管中。用PBS稀釋，2000rpm，離心5min，洗滌3次低速離心后得到PBMC，并用NK細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基調(diào)整PBMC密度為1.0 X 16個(gè)/ml。分離血清:另取30ml血液，37°C凝固I?2h，當(dāng)血清自然析出后，4°C，30000rpm離心1min，得到血清，備用。
[0039]本發(fā)明具有如下的優(yōu)點(diǎn)和有益效果:
[0040](I)本發(fā)明細(xì)胞制備得到的NK細(xì)胞，其主要效應(yīng)細(xì)胞為⑶3-⑶56+T細(xì)胞，且具有很高的純度和活性，經(jīng)流式細(xì)胞儀分析檢測(cè)CD3-CD56+T細(xì)胞的含量約占異質(zhì)性細(xì)胞群體的30%?70%以上。
[0041](2)本發(fā)明細(xì)胞制備的NK細(xì)胞增殖速度快，經(jīng)檢測(cè)，NK細(xì)胞在培養(yǎng)第14天數(shù)量可達(dá)(5.0±0.2)Χ109，活率達(dá)90% 以上。
[0042](3)本發(fā)明培養(yǎng)的⑶3-⑶56+細(xì)胞比例高，經(jīng)檢測(cè)培養(yǎng)14天后⑶3-⑶56+細(xì)胞產(chǎn)率可達(dá)(89.40±2.65)%;當(dāng)效靶比為40:1時(shí)，NK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷活性平均為(65.27土3.52) %。表明本發(fā)明所制備的NK細(xì)胞具有很好靶向殺傷腫瘤細(xì)胞的臨床效應(yīng)。
【附圖說(shuō)明】
[0043]此處所說(shuō)明的附圖用來(lái)提供對(duì)本發(fā)明實(shí)施例的進(jìn)一步理解，構(gòu)成本申請(qǐng)的一部分，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明實(shí)施例的限定。在附圖中:
[0044]圖1為采用本發(fā)明方法培養(yǎng)的NK細(xì)胞含量的流式細(xì)胞儀分析圖。
【具體實(shí)施方式】
[0045]為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，下面結(jié)合實(shí)施例及附圖，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，本發(fā)明的示意性實(shí)施方式及其說(shuō)明僅用于解釋本發(fā)明，并不作為對(duì)本發(fā)明的限定。
[0046]本發(fā)明中提到的各英文縮寫(xiě)分別為:
[0047]DC:樹(shù)突狀細(xì)胞；
[0048]CIK:細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞；
[0049]GM-CSF:粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子；
[0050]PBMC:外周血單個(gè)核細(xì)胞；
[0051 ] TNF-α:腫瘤壞死因子-α;
[0052]TNF-β:腫瘤壞死因子-β;
[0053]IFN-γ:干擾素-γ;
[0054]IL-2:白細(xì)胞介素-2;
[0055]IL-15:白細(xì)胞介素-15;
[0056]IL-3:白細(xì)胞介素-3。
[0057]實(shí)施例1
[0058]1、卩81(:的制備:
[0059]采集腫瘤患者外周血50ml，肝素抗凝，加入等量PBS至血細(xì)胞中，混勻，稀釋血細(xì)胞，2000印111，離心101^11。將稀釋的外周血緩慢加入比重為1.077的人淋巴細(xì)胞分離液層上，二者比例為1:1 AOOg，離心20min，將呈白霧狀的單個(gè)核細(xì)胞層輕輕吸出，移入另一離心管中。用I3BS稀釋，2000rpm，離心5min，洗滌3次低速離心后得到PBMC，并用NK細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基調(diào)整PBMC密度為1.0 X 16個(gè)/ml。分離血清:另取30ml血液37 °C凝固I?2h，當(dāng)血清自然析出后，4°C，30000rpm離心lOmin，得到血清，備用。
[0060]2、NK細(xì)胞純化:
[0061 ] 先用PBS將？6代011原液滲透壓調(diào)至28508/1^ H2O,用pH7.2的PBS將PercolI配成37.5 %?50 % 6個(gè)密度梯度，每個(gè)梯度相差2.5%,按密度由高到低依次緩緩加于20ml試管中，將得到的PBMC鋪于上層，低速離心，去除⑶3陽(yáng)性細(xì)胞，獲得純化的NK細(xì)胞。NK細(xì)胞主要分布于(42.5?47.5) %梯度層，以42.5 %梯度層含量最高。
[0062]3、NK細(xì)胞的誘導(dǎo)分化:
[0063]用含有5%自體血清的NK細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基重懸NK細(xì)胞濃度為1.0 X 16個(gè)/ml，加入終濃度為10ng/ml IL-2、50ng/ml IL-15，混勻后加入到75cm2培養(yǎng)瓶中，置于37°C、5%C02培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)。第3天，離心后，用含有5 %自體血清的NK細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，加入終濃度為10ng/ml IL-2、50ng/ml IL-15，混勻后，調(diào)整NK細(xì)胞濃度為I.0?2.0 X 16個(gè)/ml，置于37°C、5 % CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第4-6天，繼續(xù)觀察培養(yǎng)基顏色，半量換液，加入所需的刺激因子和培養(yǎng)液，每天記錄NK細(xì)胞濃度。
[0064]4、NK細(xì)胞的誘導(dǎo)成熟:
[0065]第7天，將懸浮的NK細(xì)胞轉(zhuǎn)移至經(jīng)抗⑶3單克隆抗體(終濃度50ng/ml)和重組人纖維連接蛋白(終濃度lyg/ml)包被的175cm2培養(yǎng)瓶中，并加入含有5%自體血清NK細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基，終濃度為10ng/ml IL-2、50ng/ml IL-15和4mlNK細(xì)胞擴(kuò)增劑，置于37°C、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。以后根據(jù)培養(yǎng)液顏色，半量補(bǔ)充含5 %自體血清NK細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基。
[0066]5、NK細(xì)胞的誘導(dǎo)增殖:
[0067]第8-13天，觀察培養(yǎng)基顏色變化，補(bǔ)充5%自體血清的NK細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基，加入終濃度為10ng/ml IL-2、50ng/ml IL-15，置于37°C、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第14天，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)到所需數(shù)量即可收集使用或凍存。
[0068]實(shí)施例1制得的NK細(xì)胞的生物學(xué)特性檢測(cè)
[0069]1、細(xì)胞活性、細(xì)胞純度、增殖力及免疫表型的檢測(cè)
[0070]取培養(yǎng)14天ΙΟΟμΙ濃度為16個(gè)/ml的細(xì)胞，加入ΙΟΟμΙ 0.4%臺(tái)盼藍(lán)染色液，顯微鏡下觀察，活細(xì)胞不染色，死細(xì)胞染成藍(lán)色，本發(fā)明制備的NK細(xì)胞活率可高達(dá)90 %以上，如圖1所示。此外，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)，培養(yǎng)第14天時(shí)，NK細(xì)胞擴(kuò)增數(shù)量達(dá)到(1.5 ± 0.2) X19個(gè)/ml，細(xì)胞增殖倍數(shù)達(dá)到外周血分離得到的PBMC(89.60±57.17)倍。
[0071]分別收集培養(yǎng)第O、8、14天的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1.0 X 15個(gè)/ml，加入抗體CD3PE-Cy5、CD4-PE、CD8-FITC 抗體標(biāo)記 T 細(xì)胞亞群；加入 CD3-FITC、CD 16+56-PE 抗體標(biāo)記 NK ；加入鼠抗人抗體FITC-1gGl、PE-1gGl作為對(duì)照進(jìn)行免疫分型檢測(cè)。上述抗體各10μ1，室溫避光孵育30min，用I3BS洗滌2次，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。IL-2和IL-15組合培養(yǎng)，擴(kuò)增后細(xì)胞總數(shù)、NK細(xì)胞、T細(xì)胞數(shù)均有明顯變化，其中，本發(fā)明制備的NK細(xì)胞⑶3-⑶16+CD56+可達(dá)到(89.40 土2.65)%, T 細(xì)胞數(shù)量 CD4+T 細(xì)胞和 Treg 細(xì)胞(20.43 ± 4.86) %、( 26.89 ± 7.32)比例明顯降低。
[0072]2、NK細(xì)胞對(duì)人紅白血病K562殺傷力特性的檢測(cè)
[0073]傳代培養(yǎng)24?48h對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的K562(經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色，活性大于95%)，調(diào)整細(xì)胞濃度為2 X 16個(gè)/ml，加入5lCr3.7MBq 37 °C、5 %CO2孵育I.5h，中間每隔15min晃動(dòng)I次，標(biāo)記完畢，洗滌3次，調(diào)整細(xì)胞數(shù)至I X 15個(gè)/ml，獲取標(biāo)記的K562為靶細(xì)胞。收集細(xì)胞因子刺激的PBMC，為效應(yīng)細(xì)胞。按效靶比5:1,10:1,20:1,40:1各100μ1接種于96孔板。靶細(xì)胞最大釋放孔，加10μ1裂解液，靶細(xì)胞、5%的胎牛血清RPMI1640各100μ1，各組均設(shè)3個(gè)平行孔，置于370C,5%⑶2培養(yǎng)箱中孵育4h，200g離心5min，吸取上清液50μ1，加入96孔平底酶標(biāo)板中，加入50ylLDH底物反應(yīng)液，室溫下避光防止30min，每孔加50μ1反應(yīng)終止液終止酶促反應(yīng)。用酶標(biāo)檢測(cè)儀在490nm處測(cè)定已空白組為基準(zhǔn)值A(chǔ)值。同時(shí)設(shè)空白對(duì)照、靶細(xì)胞對(duì)照、效應(yīng)細(xì)胞對(duì)照。每孔數(shù)值減去空白對(duì)照孔，求出3個(gè)復(fù)孔的平均A值，以殺傷率計(jì)算NK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷活性，殺傷活性(％ )=(實(shí)驗(yàn)組平均值A(chǔ)-自然釋平均值A(chǔ))/(最大釋放平均值A(chǔ)值-自然釋平均值A(chǔ)) X 100%。
[0074]結(jié)果顯示:本申請(qǐng)制備的NK細(xì)胞具有良好的殺傷活性，NK細(xì)胞對(duì)K562細(xì)胞的殺傷活性為(51.35±2.64)%，NK細(xì)胞對(duì)CNE2細(xì)胞的殺傷活性為(31.95 ± 5.43) %。其中，當(dāng)本發(fā)明制備的NK細(xì)胞與K562細(xì)胞效靶比40:1時(shí)，NK的特異性殺傷活性最高，為(72.37 土3.96)%； NK細(xì)胞對(duì)CNE2細(xì)胞(效靶比40:1)殺傷活性為(54.67 ± 3.96) %。
[0075]單獨(dú)使用IL-2制備的NK細(xì)胞方法相同，獲得的NK細(xì)胞比例為(32.76±3.45) %。
[0076]以上所述的【具體實(shí)施方式】，對(duì)本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果進(jìn)行了進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，所應(yīng)理解的是，以上所述僅為本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】而已，并不用于限定本發(fā)明的保護(hù)范圍，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所做的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種用于制備NK細(xì)胞的試劑盒，其特征在于，包括: (1)NK細(xì)胞的純化體系； (2)NK細(xì)胞的誘導(dǎo)分化體系，包括:1L-2以及IL-15; (3)NK細(xì)胞的誘導(dǎo)成熟體系，包括:NK細(xì)胞擴(kuò)增劑、IL-2以及IL-15; (4)NK細(xì)胞的誘導(dǎo)增殖體系，包括:1L-2以及IL-15; 其中，各體系中，IL-2的終濃度為10ng/ml，IL-15的終濃度為50ng/ml。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于制備NK細(xì)胞的試劑盒，其特征在于，所述(I)NK細(xì)胞的純化體系包括:Perco 11分離液。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于制備NK細(xì)胞的試劑盒，其特征在于，所述(2)NK細(xì)胞的誘導(dǎo)分化體系還包括:含有5%自體血清的NK細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于制備NK細(xì)胞的試劑盒，其特征在于，所述(3)NK細(xì)胞的誘導(dǎo)成熟體系還包括:抗CD3單克隆抗體、重組人纖維連接蛋白和含5%自體血清的NK細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基，其中，所述抗CD3單克隆抗體的終濃度為50ng/ml，所述重組人纖維連接蛋白的終濃度為lyg/ml。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于制備NK細(xì)胞的試劑盒，其特征在于，所述(4)NK細(xì)胞的誘導(dǎo)增殖體系還包括:含有5%自體血清的NK細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基。6.根據(jù)權(quán)利要求3至5中任一項(xiàng)所述的一種用于制備NK細(xì)胞的試劑盒，其特征在于，所述NK細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基包括:無(wú)血清培養(yǎng)基、2mmol/L左旋谷氨酰胺、100U/ml青霉素以及100U/ml鏈霉素。7.應(yīng)用如權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的試劑盒制備NK細(xì)胞的方法，其特征在于，包括以下步驟: (I )NK細(xì)胞的純化:將獲得的PBMC去除⑶3+細(xì)胞，獲得純化的NK細(xì)胞； (2)NK細(xì)胞的誘導(dǎo)分化:將經(jīng)過(guò)上述步驟(I)獲得的純化后的NK細(xì)胞用培養(yǎng)基重懸，加入終濃度為10ng/ml的IL-2和終濃度為50ng/ml的IL-15進(jìn)行培養(yǎng)，第3天，離心后，再用培養(yǎng)基重懸NK細(xì)胞，加入終濃度為10ng/ml的IL-2以及終濃度為50ng/ml的IL-15，并調(diào)整NK細(xì)胞濃度，繼續(xù)培養(yǎng)并根據(jù)培養(yǎng)基顏色半量補(bǔ)充IL-2、IL-15和培養(yǎng)基，每天記錄NK細(xì)胞濃度； (3 )NK細(xì)胞的誘導(dǎo)成熟:第7天，將懸浮的NK細(xì)胞轉(zhuǎn)移至經(jīng)抗⑶3單克隆抗體和重組人纖維連接蛋白包被的培養(yǎng)瓶中，加入培養(yǎng)基、終濃度為10ng/ml的IL-2、終濃度為50ng/ml的IL-15和NK細(xì)胞擴(kuò)增劑，繼續(xù)培養(yǎng)； (4)NK細(xì)胞的誘導(dǎo)增殖:第8-13天，根據(jù)培養(yǎng)基顏色補(bǔ)充培養(yǎng)基，加入終濃度為10ng/ml的IL-2和終濃度為50ng/ml的IL-15，繼續(xù)培養(yǎng)至NK細(xì)胞生長(zhǎng)到所需數(shù)量即可。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備NK細(xì)胞的方法，其特征在于，所述步驟(I)NK細(xì)胞的純化具體為: 先用PBS將?6^011分離液滲透壓調(diào)至28508/1^ H2O,再用pH7.2的PBS將PercolI分離液配成37.5%?50%區(qū)間的6個(gè)梯度，每個(gè)梯度相差2.5%，按照密度從高到低的添加順序依次加入試管中，將獲得的PBMC鋪于該試管上層，低速離心，去除CD3+細(xì)胞，獲得純化的NK細(xì)胞。9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備NK細(xì)胞的方法，其特征在于，所述步驟(2)NK細(xì)胞的誘導(dǎo)分化具體為:用含有5 %自體血清的NK細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基重懸NK細(xì)胞，NK細(xì)胞濃度為1.0XlO6個(gè)/ml，加入終濃度為10ng/ml的IL-2和終濃度為50ng/ml的IL-15，置于37 °C,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第3天，離心后，再用含有5%自體血清的NK細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基重懸NK細(xì)胞，加入終濃度為10即/1111的11^2和終濃度為501^/1111的11^15，并調(diào)整爾細(xì)胞濃度為1.0?2.0\106個(gè)/ml，置于37 °C、5 % CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，根據(jù)培養(yǎng)基顏色，半量補(bǔ)充IL_2、IL-15和培養(yǎng)基，每天記錄NK細(xì)胞濃度。10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備NK細(xì)胞的方法，其特征在于，所述步驟(3)NK細(xì)胞的誘導(dǎo)成熟具體為:第7天，將懸浮的NK細(xì)胞轉(zhuǎn)移至經(jīng)終濃度為50ng/ml的抗CD3單克隆抗體和終濃度為lyg/ml的重組人纖維連接蛋白包被的培養(yǎng)瓶中，并加入含有5%自體血清的NK細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基，終濃度為10ng/ml的IL-2、終濃度為50ng/ml的IL-15和4ml NK細(xì)胞擴(kuò)增劑，置于37°C、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以后根據(jù)培養(yǎng)基顏色半量補(bǔ)充含5%自體血清的NK細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基； 所述步驟(4)NK細(xì)胞的誘導(dǎo)增殖具體為:第8-13天，根據(jù)培養(yǎng)基顏色補(bǔ)充含5%自體血清的NK細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基，加入終濃度為10ng/ml的IL-2和終濃度為50ng/ml的IL-15，置于37°C、5%C02培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，第14天，當(dāng)NK細(xì)胞生長(zhǎng)到所需數(shù)量即可。
【文檔編號(hào)】C12N5/0783GK105925527SQ201610335200
【公開(kāi)日】2016年9月7日
【申請(qǐng)日】2016年5月19日
【發(fā)明人】趙西娟, 鄧珍珍, 袁媛, 孟祥玲
【申請(qǐng)人】成都百賽泰科生物科技有限公司