一種心肌功能檢測用試劑盒及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及免疫層析檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體公開了一種心肌功能檢測用試劑盒及其制備方法。該試劑盒包括塑料板、玻璃纖維素膜、硝酸纖維素膜，樣本墊和吸水墊，所述玻璃纖維素膜上包被有量子點標(biāo)記的肌鈣蛋白抗體、肌紅蛋白抗體和肌酸激酶抗體的混合物；硝酸纖維素膜上設(shè)置有檢測線1、檢測線2、檢測線3和控制線，檢測線1上包被有肌鈣蛋白二抗，檢測線2上包被有肌紅蛋白二抗，檢測線3上包被有肌酸激酶二抗，控制線上包被有羊抗鼠lgG。該試劑盒，利用雙抗體/抗原夾心原理結(jié)合量子點的熒光特性實現(xiàn)了采用熒光免疫層析的方法對肌鈣蛋白、肌紅蛋白和肌酸激酶進行快速、靈敏的聯(lián)合檢測。
【專利說明】
一種心肌功能檢測用試劑盒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及免疫層析檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種心肌功能檢測用試劑盒及其制 備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 肌紅蛋白（Myoglobin,Mb)是一種氧結(jié)合血紅素蛋白，主要分布于心肌和骨豁肌組 織。在急性心肌損傷時，Mb最先被釋放入血液中，在癥狀出現(xiàn)約2-3小時后，血中Mb可超出正 常上限，9-12小時達到峰值，24-36小時后恢復(fù)正常。對于懷疑ACS的病人建議連續(xù)采樣測 定，因為癥狀出現(xiàn)和蛋白標(biāo)志物釋放到血液之間有一段延遲。在ACS早期診斷和監(jiān)測的臨床 效用已有大量文獻報告。檢測肌紅蛋白的濃度可以用于一些疾病的早期診斷，如（1)血中升 高：甲狀腺功能減低癥、高醛固酮血癥、腎功能不全、惡性高熱以及劇烈運動后等；（2)尿中 升高：撲啉病、血紅蛋白尿癥、血尿等；（3)血、尿中肌紅蛋白均升高：見于急性心肌梗死、心 絞痛、心源性休克、心肌病、肌疾病(進行性肌營養(yǎng)不良、多發(fā)性肌炎、重癥肌無力)等。另外， 測定血清肌紅蛋白可作為急性心肌梗死(AMI)診斷的早期最靈敏的指標(biāo)。但特異性差，骨骼 肌損傷、創(chuàng)傷、腎功能衰竭等疾病，都可導(dǎo)致其升高。Mb陽性雖不能確診AMI，但可用于早期 排除AMI診斷的重要指標(biāo)，如Mb陰性，則基本排除心肌梗死，還可用于再梗死的診斷，結(jié)合臨 床，如Mb重新升高，應(yīng)考慮為再梗死或者梗死延展。
[0003] 肌鈣蛋白，由T、C、I三亞基構(gòu)成，和原肌球蛋白一起通過調(diào)節(jié)鈣離子對橫紋肌動蛋 白ATP酶的活性來調(diào)節(jié)肌動蛋白和肌球蛋白相互作用。當(dāng)心肌損傷后，心肌肌鈣蛋白復(fù)合物 釋放到血液中，4-6小時后，開始在血液中升高，升高的肌鈣蛋白I能在血液中保持很長時間 6-10天。肌鈣蛋白I具有高度心肌特異性和靈敏度，所以肌鈣蛋白I已成為目前最理想的心 肌梗死標(biāo)志物。
[0004] 對心肌損傷的診斷在諸多診斷急性心肌梗死(AMI)的臨床生化指標(biāo)中，CK-MB (血 清心肌酶）曾一度被認為是診斷AMI的〃金標(biāo)準(zhǔn)〃，已廣泛應(yīng)用多年.隨著對心肌肌鈣蛋白 (cTn)深入研究，無論是對心肌的特異性還是診斷敏感性，CK-MB的地位都受到了嚴重挑戰(zhàn)。 cTn被認為是目前最好的確定標(biāo)志物，正逐步取代CK-MB成為AMI的診斷〃金標(biāo)準(zhǔn)〃。
[0005] 肌鈣蛋白（cTn)出現(xiàn)早，最早可在癥狀發(fā)作后2h出現(xiàn);具有較寬的診斷窗：cTnT(5 ~14天），cTnI (4~10天）。在它們的診斷窗中，cTn增高的幅度要比CK-MB高5~10倍。由于在 無心肌損傷時cTn在血液中含量很低，因此也可用于minor mycardial damage(MMD，微小心 肌損傷)的診斷，這是以前酶學(xué)指標(biāo)所難以做到的。cTn還具有判斷預(yù)后的價值，對任何冠狀 動脈疾患病人，即便ECG或其他檢查（如運動試驗）陰性，只要cTn增高，應(yīng)視為具有高危險 性。
[0006] 患有各種冠狀動脈疾患的病人必然會發(fā)生心肌細胞損傷。有些病人的臨床表現(xiàn)可 能不完全符合WHO關(guān)于AMI診斷標(biāo)準(zhǔn)(不穩(wěn)定心絞痛就是其中之一），但卻伴有某些心肌損傷 標(biāo)志物(如CTnT等)升高，從而導(dǎo)致細胞內(nèi)的組成成分滲漏入外周血循環(huán)，這使得心肌細胞 損傷標(biāo)志物的檢測成為可能。cTnT和cTnl在AMI后(3~6h)血中濃度很快升高，和CK-MB(3~ 8h)相當(dāng)或稍早，它們測定的特異性和靈敏度明顯高于CK-ΜΒκΤη具有相當(dāng)長的診斷窗口期 (cTnI7~9天，cTnT更長），cTn對急性胸痛病人(無論有無骨豁肌損傷)的診斷均優(yōu)于CK-MB。 研究表明：在對AMI的診斷方面cTnl和cTnT無顯著差異，都能鑒別出CK-MB所不能檢測出的 心肌損傷。相對CTnT而言，cTnl顯示出較低的初始靈敏性和較高的特異性。就上升的相對值 來說，cTnT比cTnl高；在不穩(wěn)定心絞痛病人中cTnT上升的頻度比cTnl高。在AMI后30天死亡 率的預(yù)報方面，cTnT優(yōu)于cTnl。
[0007]無論是不穩(wěn)定心絞痛還是無 Q波的心肌梗死，最初24小時的CTnT最具預(yù)后價值。對 不穩(wěn)定冠狀動脈疾患病人的隨訪發(fā)現(xiàn)，cTnT和運動試驗兩項都正常者，死亡或AMI的僅1%; 若異常，死亡或AMI可達50%。對急性冠狀動脈疾患（包括心肌梗死)病人的隨訪研究發(fā)現(xiàn)， cTnT小于0.1yg/L的病人的死亡率僅4%，相比而言，大于0.1yg/L的病人的死亡率則大3倍， 發(fā)生休克的百分率大3倍，發(fā)生充血性心功能衰竭的百分率也增加1倍。對cTnl的觀察研究 得到了類似的結(jié)果。不穩(wěn)定冠狀動脈疾患病人中，cTnl大于O.Uig/L的病人死亡率較cTnl小 于〇.lyg/L的病人的死亡率大3倍多。因此，任何急性冠狀動脈疾患病人同時測得cTn增高， 應(yīng)視為尚危險性。
[0008] 對圍手術(shù)期心肌梗死的診斷冠狀動脈搭橋術(shù)后心肌梗死的診斷在心臟手術(shù)中有 重要作用，CTn是圍手術(shù)期心肌梗死的敏感和特異的標(biāo)志物，能夠鑒別出沒有達到常規(guī)圍手 術(shù)期心肌梗死判斷標(biāo)準(zhǔn)的微小的圍手術(shù)期心肌損傷。對心肌炎的診斷與CK活性相比，心肌 炎時cTnT因其相對較高的血清檢測值和較長的上升時間而具有較高的檢測敏感性，血清 cTnT可作為急性心肌炎的診斷標(biāo)志物.與腎功能衰竭的關(guān)系缺血性心臟病是晚期腎病病人 發(fā)病和死亡的主要原因之一，占總死亡率的大約40% ;這些缺血性心臟病中的大約25%發(fā) 展為AMI。因此，在晚期腎臟病病人的臨床治療中，心血管并發(fā)癥的診斷成為至關(guān)重要的問 題。在晚期腎臟病病人血清中，cTnT和cTnl的檢測值存在著差異.晚期腎臟病病人的cTnT升 高的可能原因有3:檢測方法的交叉反應(yīng);cTnT在骨骼肌中的重表達;存在著微小心肌損傷。 第2代cTnT分析法不會因為cTnT在晚期腎臟病病人骨骼肌中的重表達而產(chǎn)生假陽性，從而 排除了分析法的交叉反應(yīng).研究結(jié)果認為，晚期腎臟病病人血清中cTnT的升高可能是由于 存在一定程度的心肌損傷。
[0009] 肌酸激酶(Creatine Kinase，CK)通常存在于動物的心臟、肌肉以及腦等組織的細 胞漿和線粒體中，是一個與細胞內(nèi)能量運轉(zhuǎn)、肌肉收縮、ATP再生有直接關(guān)系的重要激酶1， 2，它可逆地催化肌酸與ATP之間的轉(zhuǎn)磷酰基反應(yīng)。肌酸激酶有四種同功酶形式：肌肉型 (麗）、腦型(BB)、雜化型(MB)和線粒體型(MiMi)。麗型主要存在于各種肌肉細胞中，BB型主 要存在于腦細胞中，MB型主要存在于心肌細胞中，MiMi型主要存在于心肌和骨骼肌線粒體 中。肌肉型肌酸激酶分子是由兩個相同的亞基組成的二聚體。根據(jù)目前已經(jīng)測定的兔、人、 雞、鼠肌酸激酶的一級結(jié)構(gòu)，M型亞基由387個氨基酸殘基組成，分子量為43KDa左右，分子內(nèi) 有8個巰基，但無二硫鍵。大熊貓肌肉型肌酸激酶也是二聚體酶，每個亞基由376個氨基酸殘 基組成，分子量為42KDa。
[0010] 肌酸激酶的同功酶在臨床診斷中有十分重要的意義，在各種病變包括肌肉萎縮和 心肌梗塞發(fā)生時，人的血清中肌酸激酶水平迅速提高，目前認為在心肌梗塞的診斷中測定 肌酸激酶的活性比做心電圖更為可靠。心肌梗死時，肌酸激酶在起病6小時內(nèi)升高，24小時 達高峰，3-4日內(nèi)恢復(fù)正常。其中肌酸激酶的同工酶CK-MB診斷的特異性最高。肌酸激酶因其 具有重要的生理功能和臨床應(yīng)用價值已引起人們廣泛的重視和深入的研究。
[0011]因此，研究開發(fā)出一種能夠同時檢測肌鈣蛋白、肌紅蛋白和肌酸激酶的檢測方法， 對于臨床判斷心肌功能，初步針對心肌梗死等疾病具有重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明的目的是提供一種靈敏度高、準(zhǔn)確度高、操作簡 便、成本低的心肌功能檢測用試劑盒，實現(xiàn)對肌鈣蛋白、肌紅蛋白和肌酸激酶三種成分的同 時聯(lián)合檢測。
[0013] 本發(fā)明的目的還在于提供一種心肌功能檢測用試劑盒的制備方法。
[0014] 為了實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：
[0015] -種心肌功能檢測用試劑盒，包括塑料板、設(shè)置在塑料板上的玻璃纖維素膜、設(shè)置 在玻璃纖維素膜上的硝酸纖維素膜，所述硝酸纖維素膜上一端設(shè)有樣本墊，對應(yīng)的另一端 設(shè)有吸水墊，所述玻璃纖維素膜上包被有量子點標(biāo)記的肌鈣蛋白抗體、量子點標(biāo)記的肌紅 蛋白抗體和量子點標(biāo)記的肌酸激酶抗體的混合物;所述硝酸纖維素膜上設(shè)置有檢測線1、檢 測線2、檢測線3和控制線，所述檢測線1上包被有肌鈣蛋白二抗，所述檢測線2上包被有肌紅 蛋白二抗，所述檢測線3上包被有肌酸激酶二抗，所述控制線上包被有羊抗鼠 IgG。
[0016] 所述玻璃纖維上包被的量子點標(biāo)記的肌f丐蛋白抗體、量子點標(biāo)記的肌紅蛋白抗體 和量子點標(biāo)記的肌酸激酶抗體的混合物中量子點標(biāo)記的肌鈣蛋白抗體、量子點標(biāo)記的肌紅 蛋白抗體和量子點標(biāo)記的肌酸激酶抗體的質(zhì)量比為1:1:1。
[0017] 所述量子點為硒化錦或硫化錦量子點。
[0018] 所述硝酸纖維素膜上設(shè)置的檢測線1與檢測線2之間、檢測線2與檢測線3之間、檢 測線1與控制線之間的間隔均不小于5mm。
[0019] 上述心肌標(biāo)志物功能檢測用試劑盒的制備方法，包括以下操作步驟：
[0020] 1)原材料的制備：
[0021] A:制備玻璃纖維素膜:將量子點標(biāo)記的肌鈣蛋白抗體、量子點標(biāo)記的肌紅蛋白抗 體、量子點標(biāo)記的肌酸激酶抗體混合包被在玻璃纖維素膜上，干燥，備用；
[0022] B:制備硝酸纖維素膜:取硝酸纖維素膜，間隔劃分出檢測線1、檢測線2、檢測線3和 控制線，然后將肌鈣蛋白二抗、肌紅蛋白二抗、肌酸激酶二抗、羊抗鼠 IgG分別包被在硝酸纖 維素膜的檢測線1、檢測線2、檢測線3和控制線上，之后將包被后的硝酸纖維素膜放入封閉 液中封閉，干燥，備用；
[0023] 2)組裝:在塑料板上放置步驟1)制備的玻璃纖維素模，然后在步驟1)制備的玻璃 纖維素膜上放置步驟1)制備的硝酸纖維素膜，然后在硝酸纖維素的一端放置樣品墊，對應(yīng) 的另一端放置吸水墊，干燥，即完成。
[0024 ]步驟A中還包括首先制備量子點標(biāo)記的肌f丐蛋白抗體、量子點標(biāo)記的肌紅蛋白抗 體和量子點標(biāo)記的肌酸激酶抗體的混合物，具體方法包括以下操作步驟：
[0025] a:在膠乳顆粒懸濁液中加入改性環(huán)糊精，混勻24小時，純化，得改性環(huán)糊精-膠乳 復(fù)合物懸濁液；
[0026] b:在步驟a制備的改性環(huán)糊精-膠乳復(fù)合物懸濁液中加入量子點，混勻24小時，純 化，得量子點-改性環(huán)糊精-膠乳復(fù)合物懸池液；
[0027] c:在步驟b制備的量子點-改性環(huán)糊精-膠乳復(fù)合物懸濁液中加入活化劑，活化15 分鐘，純化，之后加入肌鈣蛋白抗體，混勻2~4小時后，離心得沉淀物顆粒，將沉淀物顆粒用 封閉液重懸，室溫混勻1小時，之后再進行純化，即得量子點標(biāo)記的肌鈣蛋白抗體；
[0028] d:按照上述步驟a~c同樣的方法制備量子點標(biāo)記的肌紅蛋白抗體和量子點標(biāo)記 的肌酸激酶抗體，然后將量子點標(biāo)記的肌鈣蛋白抗體、量子點標(biāo)記的肌紅蛋白抗體和量子 點標(biāo)記的肌酸激酶抗體混合，備用；
[0029] 所述改性環(huán)糊精為羧甲基化改性環(huán)糊精或氨基化改性環(huán)糊精。
[0030] 所述活化劑為1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽。
[0031 ]步驟c中所述量子點-改性環(huán)糊精-膠乳復(fù)合物懸濁液與活化劑的質(zhì)量比為1:10。
[0032 ]步驟B中所用的封閉液為牛血清白蛋白溶液。
[0033] 步驟c中所用的封閉液為牛血清白蛋白溶液。
[0034] 步驟a中所述改性環(huán)糊精與膠乳顆粒的質(zhì)量比為20:1;步驟b中所述量子點與環(huán)糊 精-乳膠復(fù)合物的質(zhì)量比為10:1;步驟c中所述肌鈣蛋白抗體與量子點-改性環(huán)糊精-膠乳復(fù) 合物的質(zhì)量比為1:20。
[0035]步驟a中膠乳顆粒使用前進行純化處理，所述純化處理的具體方法為:取膠乳顆粒 加入第一緩沖液中，離心分離，棄去上清，再用第一緩沖液重懸沉淀物顆粒，然后再離心分 離，棄去上清，再用第一緩沖液重懸沉淀物顆粒，4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0036] 上述純化后的膠乳顆粒在使用時取膠乳顆粒，采用第二緩沖液將膠乳顆粒稀釋成 濃度為l〇mg/ml。
[0037] 上述步驟b中還包括首先將步驟a中制備的改性環(huán)糊精-膠乳復(fù)合物懸濁液，采用 第二緩沖液稀釋成濃度為l〇mg/ml的懸濁液，然后再加入量子點。
[0038] 上述步驟c中還包括首先將步驟b中制備的量子點-改性環(huán)糊精-膠乳復(fù)合物懸濁 液，采用第二緩沖液稀釋成濃度為l〇mg/ml的懸濁液，然后再加入活化劑活化。
[0039] 步驟C中所述封閉后進行純化的具體方法為：8000rpm條件下離心15min，棄去上 清，沉淀復(fù)溶于分散液中。
[0040 ]步驟A中將量子點標(biāo)記的肌f丐蛋白抗體、量子點標(biāo)記的肌紅蛋白抗體、量子點標(biāo)記 的肌酸激酶抗體混合包被在玻璃纖維素膜上的具體方法為:將將量子點標(biāo)記的肌鈣蛋白抗 體、量子點標(biāo)記的肌紅蛋白抗體和量子點標(biāo)記的肌酸激酶抗體混合物均勻噴涂于玻璃纖維 素膜上。
[0041 ] 步驟a和步驟b中所述純化的具體方法為:8000rpm條件下離心，棄去上清，沉淀用 第一緩沖液進行重懸，之后在SOOOrpm條件下離心，棄去上清，沉淀復(fù)溶于第一緩沖液中。 [0042]步驟c中活化后純化的具體方法為 :8000rpm條件下離心棄去上清，沉淀用第一緩 沖液進行重懸。
[0043] 步驟B中將肌鈣蛋白二抗、肌紅蛋白二抗、肌酸激酶二抗、羊抗鼠 IgG分別包被在硝 酸纖維素膜的檢測線1、檢測線2、檢測線3和控制線上的具體方法為:分別取濃度均為Img/ ml的肌鈣蛋白二抗、肌紅蛋白二抗、肌酸激酶抗體和羊抗鼠 IgG，以lul/cm，IOcm/秒的速度 分別噴涂到硝酸纖維的檢測線1、檢測線2、檢測線3和控制線上。
[0044] 步驟1)和步驟2)中所述的干燥為37°C干燥3~5小時。
[0045] 上述第一緩沖液為0.02M，pH7.4的I3B緩沖液。上述第二緩沖液為0.02M，pH6.1的 MES緩沖液。
[0046] 上述心肌標(biāo)志物功能檢測用試劑盒在使用時，將待測樣品加入試劑盒的樣品墊 上，玻璃纖維素膜上的量子化標(biāo)記的肌鈣蛋白抗體、量子點標(biāo)記的肌紅蛋白抗體、量子點標(biāo) 記的肌酸激酶抗體混合物首先特異性的捕捉到待測樣品中的肌鈣蛋白、肌紅蛋白和肌酸激 酶，然后在達到檢測線3時，量子點標(biāo)記的肌酸激酶-肌酸激酶抗體結(jié)合物與檢測線3上的肌 酸激酶二抗特異性結(jié)合，在檢測線2時，量子點標(biāo)記的肌紅蛋白抗體-肌紅蛋白結(jié)合物與檢 測線2上的肌紅蛋白二抗特異性結(jié)合;在檢測線1時，量子點標(biāo)記的肌鈣蛋白抗體-肌鈣蛋白 結(jié)合物與檢測線1上的肌鈣蛋白二抗特異性結(jié)合;之后通過檢測檢測線1、檢測線2和檢測線 3上結(jié)合的量子點的熒光效應(yīng)，定量和定性判斷待測樣品中肌鈣蛋白、肌紅蛋白和肌酸激 酶。
[0047] 本發(fā)明心肌標(biāo)志物功能檢測用試劑盒，以量子化標(biāo)記的肌鈣蛋白抗體、量子點標(biāo) 記的肌紅蛋白抗體、量子點標(biāo)記的肌酸激酶抗體混合物包被在玻璃纖維素膜上，作為檢測 探針，利用雙抗體/抗原夾心原理結(jié)合量子點的熒光特性實現(xiàn)了采用熒光免疫層析的方法 對肌鈣蛋白、肌紅蛋白和肌酸激酶進行快速、特異、簡便、靈敏的聯(lián)合檢測。本發(fā)明心肌標(biāo)志 物功能檢測用試劑盒檢測線低，檢測靈敏度高。
[0048] 本發(fā)明心肌標(biāo)志物功能檢測用試劑盒的制備方法，操作簡便，易于控制，適于工業(yè) 化推廣應(yīng)用。
[0049] 進一步優(yōu)選的，本發(fā)明制備方法中，創(chuàng)新量子點標(biāo)記技術(shù)，采用羧甲基化或氨基化 改性的環(huán)糊精修飾量子點，然后將肌鈣蛋白抗體、肌紅蛋白抗體、肌酸激酶抗體分別結(jié)合在 改性環(huán)糊精的羧甲基基團或氨基基團上，實現(xiàn)制備獲得量子點標(biāo)記的肌鈣蛋白抗體、量子 點標(biāo)記的肌紅蛋白抗體、量子點標(biāo)記的肌酸激酶抗體。
【附圖說明】：
[0050] 圖1是采用實施例1制備的試劑盒檢測肌鈣蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液發(fā)光值與實際濃度之間 對應(yīng)關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0051] 圖2是采用實施例1制備的試劑盒檢測肌紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液發(fā)光值與實際濃度之間 對應(yīng)關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0052] 圖3是采用實施例1制備的試劑盒檢測肌酸激酶標(biāo)準(zhǔn)溶液發(fā)光值與實際濃度之間 對應(yīng)關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
【具體實施方式】
[0053] 下面通過具體實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案進行詳細說明。
[0054] 實施例1
[0055]本實施例心肌標(biāo)志物功能檢測用試劑盒，包括塑料板、設(shè)置在塑料板上的玻璃纖 維素膜、設(shè)置在玻璃纖維素膜上的硝酸纖維素膜，所述硝酸纖維素膜上一端設(shè)有樣本墊，對 應(yīng)的另一端設(shè)有吸水墊，所述玻璃纖維素膜上包被有質(zhì)量比為1:1:1的量子點標(biāo)記的肌鈣 蛋白抗體、量子點標(biāo)記的肌紅蛋白抗體和量子點標(biāo)記的肌酸激酶抗體的混合物;所述硝酸 纖維素膜上設(shè)置有檢測線1、檢測線2、檢測線3和控制線，所述檢測線1上包被有肌鈣蛋白二 抗，所述檢測線2上包被有肌紅蛋白二抗，所述檢測線3上包被有肌酸激酶二抗，所述控制線 上包被有羊抗鼠 IgG;所述量子點為硒化錦量子點。
[0056]本實施例心肌標(biāo)志物功能檢測用試劑盒的制備方法，具體操作步驟為：
[0057] 1)制備玻璃纖維素膜：
[0058] a:取Iml未標(biāo)記膠乳顆粒加入IOml，0.02M，pH7.41?緩沖液中；離心機1000 Orpm離 心20min;去掉上清液，再用IOml，0.02M，pH7.4PB緩沖液重懸沉淀顆粒物；之后再離心機 1000 Orpm離心20min，去掉上清并用5ml0.02M，pH7.4JB緩沖液重懸沉淀顆粒物，4°C保存待 用；
[0059] b:取步驟a制備的膠乳顆粒用0.02M，pH6.1的MES緩沖液將膠乳顆粒稀釋至IOmg/ ml，取0.05ml稀釋后的膠乳顆粒懸濁液加入IOmg羧甲基化改性環(huán)糊精，混勻24小時后，離心 機8000rpm離心，棄去上清，并用0.02M，pH7.4的I 3B緩沖液重懸沉淀顆粒物，之后再次離心機 8000rpm離心，棄去上清，沉淀顆粒物復(fù)溶于0.02M，pH7.4的PB緩沖液中，得羧甲基化改性環(huán) 糊精-膠乳復(fù)合物懸濁液；
[0060] C:取步驟b制備的羧甲基化改性環(huán)糊精-膠乳復(fù)合物懸濁液，用0.02M，pH6.1的MES 緩沖液將其稀釋至l〇mg/ml，取20ml稀釋后的羧甲基化改性環(huán)糊精-膠乳復(fù)合懸濁液，加入 20mg硒化鎘量子點，混勻24小時，離心機8000rpm離心，棄去上清，并用0.02M，pH7.4的PB緩 沖液重懸沉淀顆粒物，之后再次離心機8000rpm離心，棄去上清，沉淀顆粒物復(fù)溶于0.02M， pH7.4的PB緩沖液中，得量子點-羧甲基化改性環(huán)糊精-膠乳復(fù)合物懸濁液；
[0061] d:取步驟c制備的量子點-羧甲基化改性環(huán)糊精-膠乳復(fù)合物懸濁液，用0.02M， pH6.1的MES緩沖液將其稀釋至10mg/ml，然后按照量子點-改性環(huán)糊精-膠乳復(fù)合物與活化 劑的質(zhì)量比為1:10,加入1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽，活化15分鐘后， 8000rpm離心，棄去上清，并用0.02M，pH7.4的I 3B緩沖液重懸沉淀物顆粒，之后按照肌鈣蛋白 抗體:量子點-羧甲基化改性環(huán)糊精-膠乳復(fù)合物= 1:20的比例加入肌鈣蛋白抗體，混勻3小 時后，8000rpm離心15分鐘，將沉淀物顆粒用封閉液重懸，室溫混勻1小時，之后8000rpm離心 15min，沉淀顆粒物復(fù)溶于分散液，即得量子點標(biāo)記的肌鈣蛋白抗體；
[0062] e:按照上述步驟a~c同樣的方法制備量子點標(biāo)記的肌紅蛋白抗體和量子點標(biāo)記 的肌酸激酶抗體，然后將量子點標(biāo)記的肌鈣蛋白抗體、量子點標(biāo)記的肌紅蛋白抗體和量子 點標(biāo)記的肌酸激酶抗體混合，噴涂于玻璃纖維素模上，37°C干燥4小時，即得量子點標(biāo)記的 肌鈣蛋白抗體、量子點標(biāo)記的肌紅蛋白抗體和量子點標(biāo)記的肌酸激酶抗體混合物標(biāo)記的玻 璃纖維素膜；
[0063] 2)制備硝酸纖維素膜:取硝酸纖維素膜，間隔6mm依次劃分檢測線3、檢測線2、檢測 線1和控制線，之后取濃度均為lmg/ml的肌鈣蛋白二抗、肌紅蛋白二抗、肌酸激酶二抗、羊抗 鼠 IgG，以lul/Cm，10cm/秒的速度分別噴涂到硝酸纖維膜的檢測線1、檢測線2、檢測線3和控 制線上，之后將硝酸纖維素膜放入牛血清白蛋白溶液中封閉，37°C干燥3小時，即得所述的 硝酸纖維素膜；
[0064] 3)組裝:在塑料板上放置步驟1)制備的玻璃纖維素模，在步驟1)制備的玻璃纖維 素膜上放置步驟2)制備的硝酸纖維素膜，然后在硝酸纖維素的一端放置樣品墊，對應(yīng)的另 一端放置吸水墊，37 °C干燥5小時，即完成。
[0065] 實施例2
[0066] 本實施例心肌標(biāo)志物功能檢測用試劑盒，與實施例不同的地方在于，采用的量子 點為硫化鎘量子點，采用的改性環(huán)糊精為氨基化干性環(huán)糊精，制備肌鈣蛋白抗體、量子點標(biāo) 記的肌紅蛋白抗體和量子點標(biāo)記的肌酸激酶抗體的過程中，在活化的量子點-改性環(huán)糊精-膠乳懸濁液中加入抗體或抗原的混勻時間為2小時，其他同實施例1。
[0067] 實施例3
[0068] 本實施例心肌標(biāo)志物功能檢測用試劑盒，與實施例不同的地方在于，制備肌鈣蛋 白抗體、量子點標(biāo)記的肌紅蛋白抗體和量子點標(biāo)記的肌酸激酶抗體的過程中，在活化的量 子點-改性環(huán)糊精-膠乳懸濁液中加入抗體或抗原的混勻時間為4小時，其他同實施例1。
[0069] 試驗例：
[0070] 將肌紅蛋白稀釋為0 · 1953125ug/L、0 · 390625ug/L、0 · 78125ug/L、1 · 5625ug/L、 3.125ug/L、6.25ug/L、12.5ug/L、25ug/L、50ug/L、100ug/L、200ug/L;肌鈣蛋白稀釋為 0·1953125ug/L、0·390625ug/L、0·78125ug/L、1·5625ug/L、3·125ug/L、6·25ug/L、12·5ug/ 1、251^/1、50呢/1、100耶/1 ;肌酸激酶稀釋為0.1953125呢/1、0.3906251^/1、0.78125邶/1、 I · 5625ug/L、3 · 125ug/L、6 · 25ug/L、12 · 5ug/L、25ug/L、50ug/L、lOOug/L作為標(biāo)準(zhǔn)品溶液，并 同時配制空白溶液。
[0071] 分別取各濃度的標(biāo)準(zhǔn)品IOOul分別加入到實施例1制備的試劑盒的樣品墊上，5min 后將顯色完成的試劑盒放入熒光免疫層析讀數(shù)儀(南京美寧康誠生物科技有限公司）重，讀 取相應(yīng)檢測線的發(fā)光值，并記錄各濃度標(biāo)準(zhǔn)樣品檢測的發(fā)光值與實際濃度之間的對應(yīng)關(guān) 系，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1~圖3所示，肌鈣蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為:y = _〇.〇〇〇〇〇〇04x2+ 0·00088χ+0· 09312，R2 = 0.99862;肌紅蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y = -0 ·0000005χ2+ 0.00336χ+0.02718，R2 = 0.99967 ;肌酸激酶的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y = -0.00005x2+ 0.2899x+0.0573，R2 = 0.99974，由上述標(biāo)準(zhǔn)曲線可知本發(fā)明制備的試劑盒針對肌紅蛋白的 最低檢測限為21yg/L、肌鈣蛋白的最低檢測限為3ng/L、肌酸激酶最低檢測限為0.3yg/L。
[0072] 另外，取空白溶液加入到實施例1制備的試劑盒中，未檢測到熒光效應(yīng)。
[0073] 取100例隨機的臨床樣本，采用本發(fā)明實施例1制備的試劑盒對血清中肌鈣蛋白、 肌紅蛋白和肌酸激酶的濃度進行聯(lián)合檢測。檢測方法為：IOOul待測樣品（50ul樣品+50ul樣 品稀釋液)滴入試劑盒樣本墊上，5min后將顯色完成的標(biāo)準(zhǔn)品與待測樣品的試紙條放入熒 光免疫層析讀數(shù)儀(南京美寧康誠生物科技有限公司）中，讀取T/C線的發(fā)光值，并記錄，將 待測樣品T/C值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，得到肌鈣蛋白、肌紅蛋白、肌酸激酶的濃度，結(jié)果如下表1 所示：
[0074] 表 1





[0081] 由此可見，本方法可以直接定量檢測心肌三項，不需專業(yè)培訓(xùn)，操作方便，快速， IOmin即可獲得結(jié)果，適合在基層醫(yī)院和體檢中心推廣和運用。
[0082] 最后應(yīng)說明的是：以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對其限制;盡管 參照前述實施例對本發(fā)明進行了詳細的說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解:其依然可 以對前述各實施例所記載的技術(shù)方案進行修改，或者對其中部分技術(shù)特征進行等同替換； 而這些修改或者替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明各實施例技術(shù)方案的精神和 范圍。
【主權(quán)項】
1. 一種心肌功能檢測用試劑盒，包括塑料板、設(shè)置在塑料板上的玻璃纖維素膜、設(shè)置在 玻璃纖維素膜上的硝酸纖維素膜，所述硝酸纖維素膜上一端設(shè)有樣本墊，對應(yīng)的另一端設(shè) 有吸水墊，其特征在于，所述玻璃纖維素膜上包被有量子點標(biāo)記的肌鈣蛋白抗體、量子點標(biāo) 記的肌紅蛋白抗體和量子點標(biāo)記的肌酸激酶抗體的混合物;所述硝酸纖維素膜上設(shè)置有檢 測線1、檢測線2、檢測線3和控制線，所述檢測線1上包被有肌鈣蛋白二抗，所述檢測線2上包 被有肌紅蛋白二抗，所述檢測線3上包被有肌酸激酶二抗，所述控制線上包被有羊抗鼠 lgG。2. 如權(quán)利要求1所述的心肌功能檢測用試劑盒，其特征在于，所述玻璃纖維上包被的量 子點標(biāo)記的肌f丐蛋白抗體、量子點標(biāo)記的肌紅蛋白抗體和量子點標(biāo)記的肌酸激酶抗體的混 合物中量子點標(biāo)記的肌f丐蛋白抗體、量子點標(biāo)記的肌紅蛋白抗體和量子點標(biāo)記的肌酸激酶 抗體的質(zhì)量比為1:1:1。3. 如權(quán)利要求1所述的心肌功能檢測用試劑盒，其特征在于，所述量子點為硒化鎘或硫 化錦量子點。4. 如權(quán)利要求1~3任一項所述的心肌功能檢測用試劑盒，其特征在于，所述硝酸纖維 素膜上設(shè)置的檢測線1與檢測線2之間、檢測線2與檢測線3之間、檢測線1與控制線之間的間 隔均不小于5mm。5. -種如權(quán)利要求1所述的心肌功能檢測用試劑盒的制備方法，其特征在于，包括以下 操作步驟： 1) 原材料的制備： A:制備玻璃纖維素膜:將量子點標(biāo)記的肌f丐蛋白抗體、量子點標(biāo)記的肌紅蛋白抗體、量 子點標(biāo)記的肌酸激酶抗體混合包被在玻璃纖維素膜上，干燥，備用； B:制備硝酸纖維素膜:取硝酸纖維素膜，間隔劃分出檢測線1、檢測線2、檢測線3和控制 線，然后將肌鈣蛋白二抗、肌紅蛋白二抗、肌酸激酶二抗、羊抗鼠 lgG分別包被在硝酸纖維素 膜的檢測線1、檢測線2、檢測線3和控制線上，之后將包被后的硝酸纖維素膜放入封閉液中 封閉，干燥，備用； 2) 組裝:在塑料板上放置步驟1)制備的玻璃纖維素膜，然后在步驟1)制備的玻璃纖維 素膜上放置步驟1)制備的硝酸纖維素膜，然后在硝酸纖維素的一端放置樣品墊，對應(yīng)的另 一端放置吸水墊，干燥，即完成。6. 如權(quán)利要求5所述的心肌功能檢測用試劑盒的制備方法，其特征在于，步驟A中還包 括首先制備量子點標(biāo)記的肌f丐蛋白抗體、量子點標(biāo)記的肌紅蛋白抗體和量子點標(biāo)記的肌酸 激酶抗體的混合物，具體方法包括以下操作步驟： a:在膠乳顆粒懸濁液中加入改性環(huán)糊精，混勻24小時，純化，得改性環(huán)糊精-膠乳復(fù)合 物懸濁液； b:在步驟a制備的改性環(huán)糊精-膠乳復(fù)合物懸濁液中加入量子點，混勻24小時，純化，得 量子點-改性環(huán)糊精-膠乳復(fù)合物懸池液； c:在步驟b制備的量子點-改性環(huán)糊精-膠乳復(fù)合物懸濁液中加入活化劑，活化15分 鐘，純化，之后加入肌鈣蛋白抗體，混勻2~4小時后，離心得沉淀物顆粒，將沉淀物顆粒用封 閉液重懸，室溫混勻1小時，之后再進行純化，即得量子點標(biāo)記的肌鈣蛋白抗體； d:按照上述步驟a~c同樣的方法制備量子點標(biāo)記的肌紅蛋白抗體和量子點標(biāo)記的肌 酸激酶抗體，然后將量子點標(biāo)記的肌f丐蛋白抗體、量子點標(biāo)記的肌紅蛋白抗體和量子點標(biāo) 記的肌酸激酶抗體混合，備用。7. 如權(quán)利要求6所述的心肌功能檢測用試劑盒的制備方法，其特征在于，所述改性環(huán)糊 精為羧甲基化改性環(huán)糊精或氨基化改性環(huán)糊精。8. 如權(quán)利要求6所述的心肌功能檢測用試劑盒的制備方法，其特征在于，步驟a中所述 改性環(huán)糊精與膠乳顆粒的質(zhì)量比為20:1;步驟b中所述量子點與環(huán)糊精-乳膠復(fù)合物的質(zhì)量 比為10:1;步驟c中所述肌鈣蛋白抗體與量子點-改性環(huán)糊精-膠乳復(fù)合物的質(zhì)量比為1:20。9. 如權(quán)利要求6所述的心肌功能檢測用試劑盒的制備方法，其特征在于，步驟A中將量 子點標(biāo)記的肌f丐蛋白抗體、量子點標(biāo)記的肌紅蛋白抗體、量子點標(biāo)記的肌酸激酶抗體混合 包被在玻璃纖維素膜上的具體方法為:將量子點標(biāo)記的肌鈣蛋白抗體、量子點標(biāo)記的肌紅 蛋白抗體和量子點標(biāo)記的肌酸激酶抗體混合物均勻噴涂于玻璃纖維素膜上。10. 如權(quán)利要求6所述的心肌功能檢測用試劑盒的制備方法，其特征在于，步驟B中將肌 鈣蛋白二抗、肌紅蛋白二抗、肌酸激酶二抗、羊抗鼠 lgG分別包被在硝酸纖維素膜的檢測線 1、檢測線2、檢測線3和控制線上的具體方法為:分別取濃度均為lmg/ml的肌鈣蛋白二抗、肌 紅蛋白二抗、肌酸激酶二抗和羊抗鼠 IgG，以lul/cm，10cm/秒的速度分別噴涂到硝酸纖維的 檢測線1、檢測線2、檢測線3和控制線上。
【文檔編號】G01N33/68GK105842463SQ201610326801
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年5月17日
【發(fā)明人】金鑫, 曾濱, 趙正道
【申請人】北京美康基因科學(xué)股份有限公司