一種桑黃菌株及其選育方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種桑黃菌株，以及該桑黃菌株的選育方法：原生質(zhì)體的制備與誘變；誘變菌株的篩選；誘變菌株的鑒定。本發(fā)明選育得到的桑黃菌株搖瓶生物量達(dá)到17.92g/L，比原始出發(fā)菌株提高9.51％。黃酮產(chǎn)量達(dá)到0.47g/L，多糖產(chǎn)量達(dá)到3.57g/L分別比原始出發(fā)菌株提高52.16％和67.95％。生物產(chǎn)量及代謝活性物產(chǎn)量也顯著高于親本菌株SH1，且清除自由基的能力有顯著提高。CGMCC No.1224220160421
【專利說明】
_種桑黃菌株及其選育方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)和微生物誘變育種領(lǐng)域，具體涉及一種桑黃菌株及其選育方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 桑黃是一種大型珍稀藥用真菌，屬真菌界、擔(dān)子菌門、傘菌綱、銹革孔菌科。桑黃具 有抑制腫瘤、抗衰老、抗氧化以及增強(qiáng)細(xì)胞免疫能力等生理功能，其主要的活性物質(zhì)為桑黃 多糖和小分子的黃酮類物質(zhì)。隨著社會經(jīng)濟(jì)發(fā)展水平的提高，國內(nèi)外市場對桑黃的需求量 急劇增加，而野生桑黃資源極其有限，采用液體發(fā)酵技術(shù)大規(guī)模生產(chǎn)桑黃菌絲體是滿足國 內(nèi)外市場需求的有效途徑，而發(fā)酵獲得的桑黃菌絲體的產(chǎn)量及其活性的高低在很大程度上 取決于桑黃菌種的優(yōu)劣。
[0003] 與其它食用菌相比，桑黃菌株極易發(fā)生衰退，從而使其產(chǎn)量及菌株活性降低。桑黃 菌株多糖和黃酮產(chǎn)量降低，則無法滿足市場的需求。
[0004] ARTP(常溫常壓等離子)誘變技術(shù)使用等離子體中的活性粒子作用于微生物，能夠 使微生物細(xì)胞壁/膜的結(jié)構(gòu)及通透性改變，并引起基因損傷，進(jìn)而使微生物基因序列及其代 謝網(wǎng)絡(luò)顯著變化，最終導(dǎo)致微生物產(chǎn)生突變。與傳統(tǒng)誘變方法相比，采用ARTP能夠有效造成 DNA多樣性的損傷，突變率高，并易獲得遺傳穩(wěn)定性良好的突變株。
[0005] 目前尚未見到有關(guān)采用ARTP技術(shù)誘變桑黃菌株的任何報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的首先是提供一種桑黃菌株，該菌株的保藏號為:CGMCC No. 12242,其 分類命名：桑黃，拉丁文學(xué)名:Phellinus igniarius，保藏單位：中國微生物菌種保藏管理 委員會普通微生物中心，地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保藏日期為2016年4月21 曰。
[0007] 本發(fā)明還提供了上述桑黃菌株的選育方法，該方法包括如下步驟：
[0008] (1)原生質(zhì)體的制備與誘變：
[0009] 將SH1菌種接種于TOB液體培養(yǎng)基上，靜置培養(yǎng)6~8d，獲得菌絲體；
[0010] 菌絲體用1 %溶壁酶和〇. 25%崩潰酶30°C酶解2.5~3h，獲得原生質(zhì)體；
[0011] 原生質(zhì)體稀釋至1〇6個/mL，涂于載片上，置于氦氣處理源下，進(jìn)行ARTP誘變處理； (2)誘變菌株的篩選：
[0012] 誘變處理的菌液，放入0.6mol/L的甘露醇緩沖液中，震蕩混勻，然后涂抹于再生培 養(yǎng)基上生長8~10d;
[0013] 挑取再生菌株于新的平板之上，通過生長速度、生長狀態(tài)、搖瓶生物量、連續(xù)傳代 觀測實(shí)驗(yàn)，選取生長速度快、生物量高、遺傳穩(wěn)定的菌株；
[0014] 然后通過測定超氧化物歧化酶、酸性磷酸酶篩選出抗氧化能力強(qiáng)的菌株；
[0015] (3)誘變菌株的鑒定
[0016]通過拮抗實(shí)驗(yàn)、DNA隨機(jī)引物擴(kuò)增、醇提物HPLC指紋圖譜分析檢測，鑒定誘變菌株 是有別于SH1菌株的新菌株。
[0017]本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：
[0018]本發(fā)明通過ARTP技術(shù)誘變得到的桑黃菌株，通過菌絲生長速度、搖瓶生物量、超氧 化物歧化酶和酸性磷酸酶酶活對誘變菌株進(jìn)行篩選，獲得新的優(yōu)良變異菌株。得到的桑黃 新菌株的生物量及代謝活性物產(chǎn)量均有大幅度上升。黃酮產(chǎn)量提升52.16%，多糖產(chǎn)量提升 67.95%〇
【附圖說明】
[0019] 圖1 ARTP致死率曲線
[0020] 圖2 RAPD引物序列
[0021] 圖3 RATO擴(kuò)增圖譜
[0022] 其中Μ為Marker，CK為出發(fā)菌株SHI，bp為堿基對
[0023] 圖4菌株HPLC分析
【具體實(shí)施方式】
[0024]為了對本發(fā)明有更深入的了解，現(xiàn)結(jié)合具體的應(yīng)用實(shí)例對本發(fā)明做進(jìn)一步的說 明：
[0025]親本菌株桑黃SH1菌株來源于中國微生物菌種保藏中心上海食用菌分中心，編號 為：3249。
[0026]本實(shí)驗(yàn)所使用培養(yǎng)基配方：
[0027]固體培養(yǎng)基:取桑樹枝20g加入蒸餾水1L，煮沸l(wèi)h，過濾取上清液加入PDA(馬鈴薯 葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基購于BD公司）粉末39g，121°C滅菌20min備用。
[0028]液體培養(yǎng)基:取桑樹枝20g加入蒸餾水1L，煮沸l(wèi)h，過濾取上清液加入PDB(馬鈴薯 葡萄糖肉湯培養(yǎng)基購于BD公司）粉末24g，121°C滅菌20min備用。
[0029]原生質(zhì)體再生培養(yǎng)基:取桑樹枝20g加入蒸餾水1L，煮沸l(wèi)h，過濾取上清液加入TOA 粉末39g，甘露醇109.2g，121°C滅菌20min倒平板備用。
[0030] 實(shí)施例1:原生質(zhì)體的制備與誘變
[0031] (1)菌株的活化及培養(yǎng)將斜面菌種SH1轉(zhuǎn)接到PDA平板中，26°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8~ l〇d。挑取平板菌絲于勻漿器中，加入少量液體培養(yǎng)基，勻漿打碎，接種于100mL液體培養(yǎng)基 中，26 °C恒溫，靜置培養(yǎng)10d，期間每天輕微震蕩菌絲2~3次。
[0032] (2)原生質(zhì)體的制備過濾收集靜置培養(yǎng)菌絲，無菌水沖洗1~2次，無菌吸水紙將菌 絲表面水分吸干。按照每〇.3g菌絲加入lmL酶液(0.12g溶壁酶(購于廣東省微生物研究所）、 〇. 〇3g崩潰酶(購于Sigma)溶于12mL 0.6mol/L的甘露醇溶液中，經(jīng)0.2μηι細(xì)菌過濾器過濾除 菌），30°C，80r/min，酶解3h。用G-3砂芯漏斗過濾，將收集的濾液在4°C、3000r/min條件下離 心lOmin，棄上清，沉淀用0.6mol/L的甘露醇洗滌2~3次，得到純化的原生質(zhì)體。
[0033] (3)原生質(zhì)體誘變按上述方法制備原生質(zhì)體，通過血球計數(shù)板計數(shù)將原生質(zhì)體稀 釋至IX 106個/mL，取20yL原生質(zhì)體均勻涂于載片上，至于氦氣處理源下，處理距離2mm、功 率為120W、氣流量為8SLM、處理時間1〇8、2〇8、3〇8、4〇8、5〇8。計算其在不同處理時間下的致 死率曲線。其結(jié)果見圖1。圖1顯示，隨著處理時間的增加，致死率不斷提高，在50s處達(dá)到 100%。在20s~30s時菌株的誘變致死率在50%~70%內(nèi)，為最適誘變劑量。
[0034]實(shí)施例2:誘變菌株的篩選
[0035] (1)誘變菌株的初篩取誘變之后菌液100yL均勻涂布于再生培養(yǎng)基上，26 °C培養(yǎng)箱 中培養(yǎng)7~10d后，誘變菌株再生出來，挑取菌落較大，菌絲密集的誘變菌株，用直徑0.6cm打 孔器定量接種于新的PDA平板之上，培養(yǎng)10d后，統(tǒng)計菌絲生長速度。以30株未誘變原生質(zhì)體 再生菌株平均生長速度為對照，選取菌絲生長速度大于出發(fā)菌株的誘變誘變菌株，進(jìn)行傳 代實(shí)驗(yàn)。每代測其菌絲生長速度，傳代5次，選取菌絲生長速度快，遺傳穩(wěn)定的優(yōu)秀菌株10 株。
[0036] (2)誘變菌株的復(fù)篩取上述步驟中篩出的10株優(yōu)秀菌株，用直徑0.6cm的打孔器定 量接種5~6塊于100mL液體培養(yǎng)基內(nèi)，培養(yǎng)10~12d，菌絲體清洗過濾凍干，測其搖瓶生物 量。選取生物量增長大于5 %的菌株共5株如下表1。
[0037]表1 5株誘變菌株的生物量值
[0039]測上述5株菌株菌絲體胞內(nèi)超氧化物歧化酶(S0D)和酸性磷酸酶酶活(ACPhSOD酶 活按照NBT法測定，ACP酶活使用對硝基酚法測定。
[0040]比較菌株S0D和ACP酶活，與菌絲生長速度一起代入生物量模型：
[0041 ] Byieid = 2.68Bpda+0.052Bsod+0.399Bacp_0.894
[0042]按菌絲模擬產(chǎn)量大小排序，結(jié)果如下表所示2，A67>A41>A1>A54>SH1。選取最優(yōu)菌 株為A67。
[0043]表2 5株誘變菌株的模擬產(chǎn)量
[0045]實(shí)施例3:誘變菌株的鑒定及產(chǎn)量測定 [0046] (1)菌株誘變鑒定
[0047]拮抗實(shí)驗(yàn):拮抗實(shí)驗(yàn)是一種可以快速鑒定菌株之間遺傳差異的方法，不僅可以用 來確定不同種菌株之間的關(guān)系，也可以用來鑒定同種的菌株是否產(chǎn)生了變異。結(jié)果顯示， 誘變菌株A67與原始出發(fā)菌株SH1產(chǎn)生了明顯的拮抗現(xiàn)象，從菌絲形態(tài)方面證實(shí)了菌株的遺 傳物質(zhì)發(fā)生了改變。
[0048] RAH)隨機(jī)引物擴(kuò)增：
[0049] 采用CTAB法提取誘變菌株和出發(fā)菌株的DNA，從52條RAPD引物中篩選出12條重復(fù) 性較好，可以反映菌株之間差異的引物（引物序列具體見圖2)。
[0050] RAPD-PCR 擴(kuò)增體系： l〇xPCRbu!Tcr 2.5 ,uL 2.5 mmol/L dNTPs 2 iVli 20 μηιοΙ/L RAPD，」|物 1 μL
[0051] ^ 5 Ι?/μΙ Taq DNA 聚合酶 0:.5 pL 100 ng,VL 校板 DNA i .〇 μL ddH：0 18 μL
[0052] RAPD-PCR 擴(kuò)增條件：
[0054] 具體條帶差異見圖3。圖3中可以明顯看出誘變菌株A67與出發(fā)菌株SHI在S44、S39、 S35、S15幾條引物下的電泳條帶具有較為顯著的差異，出現(xiàn)了多條條帶的增添和消失，電泳 結(jié)果在分子水平證實(shí)了突變菌株A67與出發(fā)菌株SH1的遺傳物質(zhì)發(fā)生了顯著地改變。
[0055] 菌絲體醇提物HPLC分析：取A67菌絲體2g，加入80 %乙醇40mL，超聲提取2h，10 OOOr/min離心取上清液，離心濃縮得到其醇提物。取醇提物樣品10mg，溶于lmL甲醇中，10 000r/min離心10min，過0.22μηι有機(jī)膜，上清上樣。使用反相C18色譜柱，流動相由A，B兩部分 組成，A相：超純水(+0.1 %冰醋酸），B相：乙腈，流速：lmL/min;檢測波長:254nm;柱溫：30 °C ;進(jìn)樣量:20yL。按下列表3中的程序進(jìn)行洗脫：
[0056] 表3HPLC洗脫程序
[0058]結(jié)果如圖4所示，誘變菌株A67與出發(fā)菌株SH1的液相圖譜發(fā)生了較大差異。與SHI 菌株的圖譜相比，A67菌株產(chǎn)生多個新峰，說明與出發(fā)菌株相比，A67產(chǎn)生了新的次級代謝產(chǎn) 物。除此，從峰的高低、峰面積可以看出A67菌株次級代謝物的產(chǎn)量與出發(fā)菌株相比也有較 大程度的提升。此結(jié)果從代謝產(chǎn)物方面驗(yàn)證了 A67菌株是優(yōu)于出發(fā)菌株的新菌株。
[0059] (2)出發(fā)菌株與A67菌株產(chǎn)量及活性測定
[0000 ]胞內(nèi)多糖含量測定:胞內(nèi)多糖含量測定采用總糖減還原糖的方法測定，胞內(nèi)總糖 含量采用苯酚-硫酸法測定;胞內(nèi)還原糖采用DNS法測定。
[0061 ]黃酮含量測定：分別取桑黃菌株凍干菌絲體lg加入到25ml容量瓶中，80%乙醇定 容至刻度，超聲提取2_3h，醇提物1000r/min離心10min，取上清備用。采用NaN02-Al(N0 3)3比 色法，測定黃酮類化合物含量，每個樣品做3次重復(fù)。
[0062]測定結(jié)果見如下表4。
[0063] 表4多糖和黃酮測量結(jié)果
[0064]
[0065]清除自由基能力測定
[0066]通過化學(xué)發(fā)光法測定誘變菌株與原始菌株菌絲體的醇提物，對超氧陰離子和過氧 化氫的清除作用。IC50值表示清除50 %自由基時，樣品濃度的大小。IC50值與清除自由的 能力負(fù)正相關(guān)，即IC50值越小，其清除自由基的能力越強(qiáng)。結(jié)果見如下表5,表明：誘變菌株 A67的醇提物對過氧化氫和超氧陰離子的清除作用都要優(yōu)于出發(fā)菌株，誘變菌株相比分別 提升 40.17% 和 29.45%。
[0067]表5清除自由基能力測定結(jié)果
[0068]
[0069]綜合上述實(shí)施例結(jié)果表明，經(jīng)ARTP技術(shù)誘變后得到的新菌株A67經(jīng)多種鑒定方法 綜合認(rèn)定明顯有別于親本菌株SH1，其多糖和黃酮產(chǎn)量明顯增高，生物產(chǎn)量及代謝活性物產(chǎn) 量也顯著高于親本菌株SH1，且清除自由基的能力有顯著提高。
【主權(quán)項】
1. 一種桑黃菌株，其特征在于，所述桑黃菌的保藏編號為CGMCC No. 12242。2. -種權(quán)利要求1所述桑黃菌株的選育方法，其特征在于包括如下步驟： (1) 原生質(zhì)體的制備與誘變： 將SH1菌種接種于PDB液體培養(yǎng)基上，靜置培養(yǎng)6~8d，獲得菌絲體； 菌絲體用1 %溶壁酶和0.25 %崩潰酶30 °C酶解2.5~3h，獲得原生質(zhì)體； 原生質(zhì)體稀釋至1〇6個/mL，涂于載片上，置于氦氣處理源下，進(jìn)行ARTP誘變處理； (2) 誘變菌株的篩選： 誘變處理的菌液，放入0.6mol/L的甘露醇緩沖液中，震蕩混勻，涂抹于再生培養(yǎng)基上生 長8~10d; 挑取再生菌株于新的平板之上，通過生長速度、生長狀態(tài)、搖瓶生物量、連續(xù)傳代觀測 實(shí)驗(yàn)，選取生長速度快、生物量高、遺傳穩(wěn)定菌株； 通過測定超氧化物歧化酶、酸性磷酸酶篩選出抗氧化能力強(qiáng)的優(yōu)秀菌株； (3) 誘變菌株的鑒定 通過拮抗實(shí)驗(yàn)、DNA隨機(jī)引物擴(kuò)增、醇提物HPLC指紋圖譜分析檢測，鑒定誘變菌株是有 別于SH1菌株的新菌株。
【文檔編號】C12N15/01GK105969670SQ201610392076
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年6月3日
【發(fā)明人】楊焱, 曲德輝, 唐傳紅, 張赫男, 張勁松, 馮杰, 劉艷芳, 吳迪, 顏夢秋, 周帥, 馮娜, 唐慶九, 張忠
【申請人】上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院