Akr1b10蛋白和用于肝硬化診斷的試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及醫(yī)藥生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及了一種肝硬化特異性抗原醛酮還原酶lB10(Aldo_Keto Reductase 1B10，AKR1B10)，以及一種用于肝硬化的早期診斷、診斷、治療指導(dǎo)、及預(yù)后判斷的試劑盒。。
【背景技術(shù)】
[0002]慢性肝炎后肝硬化是指由于各種病因引起的肝臟慢性、進(jìn)行性、彌漫性病變，其特點是在肝細(xì)胞壞死的基礎(chǔ)上發(fā)生纖維化，并代之以纖維包繞的異常肝細(xì)胞結(jié)節(jié)(稱之為假小葉)，導(dǎo)致正常肝小葉結(jié)構(gòu)和血管解剖的破壞。我國肝硬化的主要病因是病毒性肝炎，尤其是乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)和丁型肝炎(HDV)病毒引起的慢性、長期炎癥可導(dǎo)致肝硬化。
[0003]肝硬化是一種常見疾病，逐漸進(jìn)展，晚期出現(xiàn)肝功能衰竭、門靜脈高壓和多種并發(fā)癥，是嚴(yán)重和不可逆的肝臟疾病。肝硬化目前無有效的治療方法。在肝硬化的早期(代償期)，進(jìn)行及時的干預(yù)，讓患者避免重活動量工作，輔以飲食調(diào)節(jié)，如以高熱量、高蛋白質(zhì)、維生素豐富而易消化的食物為主。嚴(yán)禁飲酒，并限制脂肪，尤其是動物脂肪的過多攝人等，可避免或延緩其病情進(jìn)展，預(yù)防晚期肝硬化及各種并發(fā)癥的發(fā)生。
[0004]然而，早期肝硬化診斷比較困難，許多病理組織學(xué)證實為肝硬化的患者，?？蔁o任何癥狀或僅出現(xiàn)非特異性的消化道癥狀。目前，對于肝硬化的早期診斷主要在于:①對病毒性肝炎患者嚴(yán)密隨訪觀察；②對原因不明的肝大，特別是肝質(zhì)地堅實、表面不光滑者，有肝病面容者，出現(xiàn)蜘蛛痣、肝掌及毛細(xì)血管擴張等體征者，采用包括超聲、腹腔鏡及肝組織活檢等檢查手段幫助確定性質(zhì)。這些手段一則缺少特異性，二則臨床操作也有實質(zhì)性困難。急需更特異性的診斷或隨訪、追蹤指標(biāo)，尤其是無創(chuàng)性血清生物學(xué)指標(biāo)。
[0005]AKR1B10蛋白是從人類原發(fā)性腫瘤組織中分離鑒定出來的。該蛋白質(zhì)具有316個氨基酸，在多種人類腫瘤組織中高表達(dá)，并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長與增值，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。此前，本發(fā)明人研發(fā)了針對人類特異性抗原醛酮還原酶1B10蛋白(以下簡稱為AKR1B10)的特異性檢測試劑盒及其抗體，以用于癌癥的篩查、診斷、療效判斷、預(yù)后評估或復(fù)發(fā)監(jiān)測。然而，經(jīng)過進(jìn)一步研發(fā)，發(fā)現(xiàn)該人類特異性抗原醛酮還原酶1B10蛋白是肝硬化的一個新的，特異性血清標(biāo)記物，可用于肝硬化的早期診斷、診斷、治療指導(dǎo)、及預(yù)后判斷，而成就了本發(fā)明。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明人新發(fā)現(xiàn)AKR1B10蛋白在肝硬化再生結(jié)節(jié)中高表達(dá)，并經(jīng)細(xì)胞分泌，進(jìn)入血液循環(huán)，使肝硬化患者血清中該蛋白水平升高。因此AKR1B10可以作為新的肝硬化血清標(biāo)記物，可用于肝硬化的篩查、追蹤、早期診斷、治療指導(dǎo)和預(yù)后判斷，因而成為本發(fā)明的基礎(chǔ)。
[0007]因而針對人類肝硬化特異性抗原醛酮還原酶1B10 (Aldo-Keto Reductase 1B10，AKR1B10)蛋白，開發(fā)出一種新的，靈敏、特異、高效的診斷試劑盒，用于肝硬化的篩查、診斷、療效判斷與預(yù)后評估。
[0008]具體而言，本發(fā)明涉及如下內(nèi)容:
1.一種基于人類肝硬化特異性抗原醛酮還原酶1B10 (AKR1B10)蛋白的診斷試劑盒。
[0009]2.該試劑盒可用于肝硬化的篩查、診斷、療效判斷與預(yù)后評估，其包含特異性檢測AKR1B10的試劑。
[0010]3.項2所述的試劑盒，其中，所述特異性檢測AKR1B10的試劑是特異性識別AKR1B10蛋白的特異性抗體；或所述特異性檢測AKR1B10蛋白的試劑是特異性識別AKR1B10蛋白核酸的引物或探針:5’端:CAGAAAGCAGGACGTGGGACATC，3’端:GCACGTCGATTCGCGTCTATGAC。
[0011]
4.項2-3中任一項所述的試劑盒，其中所述試劑可用于檢測血清與尿液等體液，或組織樣本中的AKR1B10蛋白。
[0012]5.項2-4中任一項所述的試劑盒，其中所述試劑盒還包含AKR1B10蛋白標(biāo)準(zhǔn)品。
[0013]6.項2-5中任一項所述的試劑盒，其中所述試劑盒是酶聯(lián)免疫法吸附測定(ELISA)試劑盒、時間分辨免疫熒光分析(TRFIA)試劑盒及化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒。
[0014]7.項6所述的試劑盒，其包括:
包被有肝硬化特異性抗原AKR1B10特異性捕獲抗體的檢測板板；
生物素標(biāo)記的另一種屬來源的AKR1B10的特異性檢測抗體。該捕獲單克隆抗體與檢測抗體均可與AKR1B10蛋白結(jié)合。
[0015]8.項7所述的試劑盒，其還包括:
包被緩沖液(1XPBS，ρΗ7.3±0.1)；
樣品稀釋液(1XPBS、1%BSA、0.05%NaN3，pH 7.3±0.1)；
封閉液(IXPBS、3% BSA)；
洗脫液 PBST(1XPBS、0.05% Tween-20)；
Streptavidin-Eu/HRP。
[0016]9.根據(jù)項7或8的試劑盒，其中捕獲抗體來自用全長AKR1B10抗原免疫小鼠，并進(jìn)行細(xì)胞融合，分離單克隆雜交細(xì)胞株，而制備的，特異性識別AKR1B10的單克隆抗體；檢測抗體來自用全長AKR1B10抗原免疫兔獲得的純化抗體。
[0017]10.根據(jù)項2-9中任一項所述的試劑盒，其中所述篩查、診斷、療效判斷及預(yù)后評估包括:
a)利用所述特異性檢測AKR1B10的試劑測量來自受試者的生物學(xué)樣品中AKR1B10蛋白的水平；
b)將a)中測得的水平與正常樣品中的相應(yīng)水平比較。
[0018]11.根據(jù)項10的試劑盒，其中所述樣品是血清、尿液、等體液，或組織樣品。
[0019]12.特異性檢測AKR1B10蛋白的試劑在制備用于肝硬化篩查、早期診斷、療效判斷與預(yù)后評估的試劑盒中的用途。
[0020]13.根據(jù)項12所述的用途，其中，所述特異性檢測AKR1B10的試劑是特異性識別AKR1B10蛋白的單克隆抗體，其是保藏號為CGMCC N0.9249、或CGMCC N0.9250單抗細(xì)胞株所產(chǎn)生的單克隆抗體。
[0021]
【附圖說明】
[0022]圖1.鼠源性AKR1B10單克隆抗體的特異性。此為用純化的AKR1B10單克隆抗體進(jìn)行Western blot以檢測其特異性。M，蛋白分子量標(biāo)記物；H460，人肺癌細(xì)胞系(表達(dá)AKR1B10) ;293T，人胚胎腎細(xì)胞系(表達(dá)AR，但不表達(dá)AKR1B10) ;AKR1B10，純化蛋白；AR，純化蛋白?？笰KR1B10單克隆抗體具有高特異性，與AR蛋白無交叉反應(yīng)(注:AR (AldoseReductase)與AKR1B10為高度相似的同一家族蛋白)。
[0023]圖2:用抗AKR1B10特異性抗體檢測AKR1B10蛋白在人類肝硬化組織中的表達(dá)。此為用人類肝硬化活檢組織切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測所得結(jié)果，表明AKR1B10蛋白在人類肝硬化組織中特異表達(dá)，并可以用AKR1B10特異性抗體檢測到。
[0024]圖3:時間分辨免疫熒光測定(TRFIA)試劑盒的靈敏度。其中捕獲抗體來自用全長AKR1B10抗原制備的鼠源性單克隆抗體；檢測抗體來自用全長AKR1B10抗原免疫兔獲得的純化抗體。用純化的、不同量AKR1B10蛋白作為待檢樣品，以確定最低檢測靈敏度。
[0025]圖4:正常人群和肝硬化患者血清中AKR1B10濃度。用上述TRFIA檢測。
[0026]
【具體實施方式】
[0027]本發(fā)明涉及一種新發(fā)現(xiàn)，即AKR1B10蛋白在肝硬化再生結(jié)節(jié)中高表達(dá)，并經(jīng)細(xì)胞分泌，進(jìn)入血液循環(huán)，使肝硬化患者血清中該蛋白水平升高(參見圖2與圖4)。因此AKR1B10可以作為新的肝硬化血清標(biāo)記物，可用于肝硬化的篩查、追蹤、早期診斷、治療指導(dǎo)和預(yù)后判斷。
[0028]本發(fā)明提供的檢測AKR1B10蛋白的試劑盒，包括特異性識別AKR1B10蛋白的單克隆抗體，該抗體被包被在固體載體上。
[0029]本發(fā)明基于抗AKR1B10特異性單克隆抗體，新開發(fā)出利用夾心時間分辨免疫熒光分析(TRFIA)技術(shù)檢測血清AKR1B10抗原的試劑盒，此試劑盒適用于肝硬化的篩查、追蹤、早期診斷和指導(dǎo)治療與判斷預(yù)后。
[0030]本發(fā)明提供的檢測AKR1B10抗原的夾心時間分辨熒光免疫測定(TRFIA)試劑盒特征是，主要包括有:包被有捕獲AKR1B10蛋白的鼠源性特異性單克隆抗體的時間分辨免疫熒光測定(TRFIA)板；生物素標(biāo)記的檢測抗體(2 μ g/ml兔抗AKR1B10抗體)。捕獲抗體與檢測抗體均可與AKR1B10抗原結(jié)合。
[0031]所述檢測AKR1B10抗原的夾心時間分辨免疫熒光測定(TRFIA)試劑盒還包括有:包被緩沖液(1XPBS，pH7.3±0.1);樣本稀釋液/抗體稀釋液(1 XPBS、1%BSA、0.05%NaN3，pH 7.3±0.1);封閉液(1XPBS、3% BSA);洗脫液 PBST (1 XPBS、0.05% Tween-20);辣根過氧化物酶(HRP)或Eu標(biāo)記的Streptavidin ;標(biāo)準(zhǔn)品(不同濃度AKR1B10純抗原:0、0.3125、0.625、1.25、2.5、5、10、20 ng/ml)。
[0032]所述捕獲抗體來自用全長AKR1B10抗原制備的鼠源性單克隆抗體；檢測抗體來自用全長AKR1B10抗原免疫兔獲得的純化抗體。
[0033]本發(fā)明的另一個目的是提供上述試劑盒的制備方法。
[0034]—種制備上述檢測AKR1B10抗原的夾心時間分辨熒光免疫測定(TRFIA)試劑盒的方法，包括以下步驟:
用包被緩沖液將捕獲抗體稀釋成7-10 μ g/ml，在時間分辨熒光免疫測定(TRFIA)板的每孔中加入100 μ 1上述抗體稀釋液，4° C過夜；取出，置于37° C 30分鐘；甩去液體，用PBST洗滌5次；空干，每孔加入100 μ 1封閉液，37° C 2小時；甩去液體，用PBS洗2次；在室溫下，自然風(fēng)干2小時；用錫箔紙