急性高原病熱休克蛋白70基因rs1008438位點(diǎn)流式液相芯片檢測試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及人類基因診斷試劑盒，采用流式熒光雜交法定性檢測急性高原病易感 基因中的SNP位點(diǎn)。適用于臨床急性高原病易感基因的預(yù)測診斷，還可用于高原適應(yīng)人群 和AMS患者基因組檢測。
【背景技術(shù)】
[0002] 青藏高原地域遼闊、物產(chǎn)豐富，蘊(yùn)含著巨大的經(jīng)濟(jì)發(fā)展?jié)摿?；青藏高原地處祖國?南邊睡，是重要的天然屏障，軍事地理位置重要。但高原自然生存環(huán)境惡劣，在海拔3000 米高原，大氣壓降至537mmHg，僅為海平面的70%，大氣氧分壓為103mmHg，肺泡氣氧分壓為 62mmHg，高原缺氧導(dǎo)致機(jī)體勞動能力明顯降低，在海拔4500米地區(qū)，人的體力只有平原的 60%。高原特殊的環(huán)境因素可導(dǎo)致高原病的發(fā)生，急性高原病（Acute mountain siekness AMS)最為常見，危害也最大。流行病學(xué)調(diào)查顯示，AMS多發(fā)生于海拔2500米以上的高原，而 我國海拔3000米以上的高原就占國土面積的1/6,常住人口約6000多萬。目前AMS已經(jīng)成 為我國高原地區(qū)的重大公共衛(wèi)生問題，嚴(yán)重阻礙著當(dāng)?shù)亟?jīng)濟(jì)、社會及各項(xiàng)事業(yè)的發(fā)展。由于 AMS發(fā)展迅速，后果嚴(yán)重，目前又缺乏非常有效的治療措施，因此，尋找有效的預(yù)防措施顯得 尤為迫切。AMS是一種多基因疾病，是高原低氧的環(huán)境因素和許多微效致病基因共同作用的 結(jié)果。大量研究表明，誘導(dǎo)AMS形成的易感基因產(chǎn)物在AMS患者和高原習(xí)服人群之間的表 達(dá)存在顯著性差異。如果在進(jìn)入高原之前，通過遺傳標(biāo)記的檢測，將攜帶這種易感基因型的 個體篩檢出來，避免其暴露于高原低氧環(huán)境，就能有效預(yù)防AMS的發(fā)生。但現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)室檢 測方法均不能進(jìn)行易感基因型檢測?？傊?，研發(fā)急性高原病易感基因的預(yù)測診斷試劑盒仍 然是人們面對的挑戰(zhàn)之一。
[0003] 流式液相芯片技術(shù)又稱流式熒光技術(shù)或懸浮陣列流式熒光技術(shù)，其原理是將熒光 標(biāo)記后的單細(xì)胞(或顆粒）懸液隨鞘液進(jìn)入流動室，壓力迫使鞘液包裹的液滴包含單一細(xì)胞 或顆粒垂直通過檢測區(qū)。熒光標(biāo)記的細(xì)胞或顆粒在激光激發(fā)下發(fā)出熒光，根據(jù)其本身標(biāo)記 的熒光和激發(fā)后發(fā)出的熒光綜合分析進(jìn)行檢測。其在小樣本、高通量、操作簡便、快速準(zhǔn)確、 敏感度、特異度高等方面優(yōu)于傳統(tǒng)的分析方法，而且其所有反應(yīng)均在液相中進(jìn)行，保持天然 構(gòu)象，有利于探針和待測物充分反應(yīng)，目前已廣泛用于各類核酸及蛋白檢測，如基因分型、 抗原/抗體檢測、感染性疾病診斷等，其中HPV檢測及分型試劑盒、呼吸道病毒檢測試劑盒、 細(xì)胞因子檢測試劑盒、腫瘤標(biāo)志物檢測試劑盒等已經(jīng)在美國和中國經(jīng)FDA及SFDA批準(zhǔn)用于 臨床檢測。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的主要是提供一種高特異度、靈敏度，且具有同時檢測多個樣本、多個 指標(biāo)能力的試劑盒。
[0005] 本發(fā)明通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)： 急性高原病熱休克蛋白70基因 rs100 8438位點(diǎn)流式液相芯片檢測試劑盒，該試劑盒包 含特異性熒光微球交聯(lián)探針微球雜交液、特異性PCR引物混合液、預(yù)混液、藻紅蛋白熒光標(biāo) 記鏈霉親和素（SA-PE); 其中，特異性熒光微球交聯(lián)探針及特異性PCR引物和探針序列如下： H-FA :5, -CAGGACGGGAGGCGAAAA-3，； H-FC :5,-CAGGACGGGAGGCGAAAC-3，； HSP70-R2 :5'-AAAGGTAGTGGACTGTCGC-3' ； H-P0529-3 :5'-ATAAGTCGTCACGGAGACCC-3' 。
[0006] 進(jìn)一步地，所述預(yù)混液由 4X Buffer、dNTPs、Taq Polymerase 組成。
[0007] 具體地，預(yù)混液的用量為：10 μ I，特異性PCR引物混合液的用量為：2 μ 1。
[0008] 另外，所述試劑盒還包含ddH20。具體地，CldH2O的用量為：6 μ 1。在進(jìn)行檢測時， 待檢DNA的用量為：2 μ 1。
[0009] 上述試劑盒在實(shí)際使用過程中的PCR反應(yīng)條件為：首先熱啟動95°C lOmin，然后進(jìn) 入35個循環(huán)；94°C變性30s，64°C退火30s，72°C延伸30s ;循環(huán)結(jié)束后72°C延伸lOmin。
[0010] 取PCR產(chǎn)物3 μ 1與22 μ 1微球雜交液混合，95 °C變性5 min，48 °C雜交30 min 后，加入SA-PE 75 μ 1，48 °C溫育15 min。使用Luminex 200流式熒光分析儀檢測雜交產(chǎn) 物。
[0011] 本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)及有益效果： 本發(fā)明的試劑盒具有高特異度、靈敏度，而且具有同時檢測多個樣本、多個指標(biāo)的能 力，可以用于臨床急性高原?。ˋMS)重點(diǎn)易感基因的檢測診斷，還可應(yīng)用于應(yīng)對批量需要急 進(jìn)高原的人群，短時間內(nèi)進(jìn)行檢測并分型。
【附圖說明】
[0012] 圖1為1號標(biāo)本HSP70位點(diǎn)測序結(jié)果。
[0013] 圖2為2號標(biāo)本HSP70位點(diǎn)測序結(jié)果。
[0014] 圖3為3號標(biāo)本HSP70位點(diǎn)測序結(jié)果。
[0015] 圖4為4號標(biāo)本HSP70位點(diǎn)測序結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0016] 下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的說明，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不限于此。 實(shí)施例
[0017] 急性高原?。ˋMS)易感基因 SNP位點(diǎn)的選擇： 使用NCBI核酸數(shù)據(jù)庫公開信息及文獻(xiàn)調(diào)研，篩選高原急性不適易感靶基因及位點(diǎn)，通 過生物信息學(xué)比對研究，篩選急性高原病（AMS)易感基因，對選取的AMS易感基因 SNP位點(diǎn) 的序列號查詢和基因組序列下載。SNP位點(diǎn)的選擇原則：該位點(diǎn)盡量位于基因編碼區(qū)、調(diào)控 區(qū)等蛋白活性關(guān)系密切的區(qū)域，各SNP位點(diǎn)基因頻率分布資料均來自中國漢族人群。根據(jù) SNP位點(diǎn)選擇原則，選定1個易感基因的1個SNP位點(diǎn)。所選SNP位點(diǎn)為：熱休克蛋白70基 因（HSP70)啟動子區(qū)：rs100 8438。
[0018] 通過對SNP位點(diǎn)的選擇，本申請研究出了以下試劑盒： 該試劑盒包含特異性熒光微球交聯(lián)探針微球雜交液、特異性PCR引物混合液、預(yù)混液、 澡紅蛋白9?光標(biāo)記鏈霉未和素、內(nèi)標(biāo)球蛋白。
[0019] 所述預(yù)混液由4X Buffer、dNTPs、Taq Polymerase組成。該預(yù)混液可從市面上直 接購買。
[0020] 所述特異性熒光微球交聯(lián)探針微球雜交液是由探針（H-P0529-3號）與19號熒光 微球耦聯(lián)、TE緩沖液及四甲基氯化氨（TMC)雜交緩沖液制備。其具體的制備方法和采用 的其他原料均是現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明僅是采用了不同的探針和熒光微球，然后制備方法是現(xiàn) 有的。
[0021 ] 上述特異性熒光微球交聯(lián)探針及特異性PCR引物和探針序列如下： H-FA :5, -CAGGACGGGAGGCGAAAA-3，； H-FC :5,-CAGGACGGGAGGCGAAAC-3，； HSP70-R2 :5'-AAAGGTAGTGGACTGTCGC-3' ； H-P0529-3 :5'-ATAAGTCGTCACGGAGACCC-3' 。
[0022] 具體地，試劑盒中的預(yù)混液用量為：10 μ 1，特異性PCR引物混合液用量為：2 μ 1。
[0023] 另外，所述試劑盒還包含ddH20。具體地，CldH2O的用量為：6 μ 1。在進(jìn)行檢測時， 待檢DNA的用量為：2 μ 1。也就是說本申請?jiān)噭┖械腜CR反應(yīng)體系的總體積為20 μ 1。
[0024] 然而，PCR反應(yīng)條件為：首先熱啟動95°C lOmin，然后進(jìn)入35個循環(huán)；94°C變性 30s，64°C退火30s，72°C延伸30s ;循環(huán)結(jié)束后72°C延伸lOmin。雜交反應(yīng)條件為取PCR產(chǎn) 物3 μ 1與22 μ 1微球雜交液混合，95 °C變性5 min，48 °C雜交30 min后，加入SA-PE 75 μ 1，48 °C溫育 15 min。
[0025] 本發(fā)明的試劑盒使用時，引物對為兩對：① H-FA\HSP70-R2,②H-FC\HSP70-R2。采 用LumineUOO流式熒光檢測儀進(jìn)行檢測。
[0026] 本發(fā)明的臨床驗(yàn)證： 采集2015年1月西藏某醫(yī)院收治的4例臨床診斷為急性高原病的患者全血，提取DNA 采用AMS易感基因流式液相芯片檢測并分型。通過擴(kuò)增、雜交并用LumineX200流式熒光檢 測儀檢測，檢測結(jié)果如表1。
[0027] 表1急性高原病的患者流失液相芯片檢測結(jié)果
結(jié)果表明，如果只有引物對①或引物對②的產(chǎn)物雜交結(jié)果是陽性(MFI > 500)，則判定 為純合突變，SNP類型為引物對①或引物對②帶有的堿基類型。如果引物對①和引物對② 的產(chǎn)物雜交結(jié)果都呈陽性，則判定為雜合突變。
[0028] 檢測后將基因組DNA進(jìn)行測序驗(yàn)證結(jié)果(華大基因），測序結(jié)果見圖1~4。病例標(biāo) 本編號為：1、2、3、4,測序結(jié)果與本發(fā)明檢測結(jié)果完全吻合。
[0029] 4例急性高原病的患者標(biāo)本中，HSP70 (rs100 8438)突變4例，其中編號1的病例 為純合G突變，編號2的病例為雜合突變，編號3的病例為純合G突變，編號4的病例為雜 合突變，說明該方法與臨床診斷一致性非常好。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 急性高原病熱休克蛋白70基因rsl008438位點(diǎn)流式液相芯片檢測試劑盒，其特征在 于，該試劑盒包含特異性熒光微球交聯(lián)探針微球雜交液、特異性PCR引物混合液、預(yù)混液、 澡紅蛋白9?光標(biāo)記鏈霉未和素； 其中，特異性熒光微球交聯(lián)探針及特異性PCR引物和探針序列如下： H-FA:5, -CAGGACGGGAGGCGAAAA-3，； H-FC:5,-CAGGACGGGAGGCGAAAC-3，； HSP70-R2 :5'-AAAGGTAGTGGACTGTCGC-3'； H-P0529-3 :5'-ATAAGTCGTCACGGAGACCC-3' 。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的急性高原病熱休克蛋白70基因rsl008438位點(diǎn)流式液相 芯片檢測試劑盒，其特征在于，預(yù)混液的用量為：1〇μ1，特異性PCR引物混合液的用量為： 2 μ 1〇3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的急性高原病熱休克蛋白70基因rsl008438位點(diǎn)流式液 相芯片檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包含ddH20。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的急性高原病熱休克蛋白70基因rsl008438位點(diǎn)流式液相芯 片檢測試劑盒，其特征在于，ddH20的用量為：6μ1。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的急性高原病熱休克蛋白70基因rs100 8438位點(diǎn)流式液相芯 片檢測試劑盒，其特征在于，特異性熒光微球交聯(lián)探針微球雜交液是由探針H-P0529-3與 19號熒光微球耦聯(lián)、TE緩沖液及四甲基氯化氨雜交緩沖液制備。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種急性高原病熱休克蛋白70基因rs1008438位點(diǎn)流式液相芯片檢測試劑盒，該試劑盒包含特異性熒光微球交聯(lián)探針微球雜交液、特異性PCR引物混合液、預(yù)混液、藻紅蛋白熒光標(biāo)記鏈霉親和素。本發(fā)明的試劑盒具有高特異度、靈敏度，而且具有同時檢測多個樣本、多個指標(biāo)的能力，可以用于臨床急性高原?。ˋMS）重點(diǎn)易感基因的檢測診斷，還可應(yīng)用于應(yīng)對批量需要急進(jìn)高原的人群，短時間內(nèi)進(jìn)行檢測并分型。
【IPC分類】C12Q1/68
【公開號】CN105385777
【申請?zhí)枴緾N201510998240
【發(fā)明人】吳艾霖, 吳麗娟, 秦燕, 熊怡淞, 劉毓剛, 胡莉娜
【申請人】吳艾霖
【公開日】2016年3月9日
【申請日】2015年12月25日