microRNA在制備診斷宮頸癌或其癌前病變的試劑盒中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域；更具體地，涉及microRNA在制備診斷宮頸癌或其癌前 病變的試劑盒中的應(yīng)用，為臨床上HPV陽(yáng)性婦女的分流W及宮頸癌或其癌前病變的檢測(cè)提 供輔助診斷。
【背景技術(shù)】
[0002] 宮頸癌是全球最常見的女性惡性腫瘤之一。據(jù)世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究署 (International Agency for Research on CancerJARC)估計(jì)，2008年全球約有52. 9萬(wàn)例 新發(fā)宮頸癌，其中85%發(fā)生在欠發(fā)達(dá)地區(qū)，59%發(fā)生在亞洲；死亡病例達(dá)27. 5萬(wàn)，其中85% 死亡病例發(fā)生在發(fā)展中國(guó)家。據(jù)中國(guó)癌癥中必72個(gè)腫瘤登記處的數(shù)據(jù)顯示，中國(guó)在2009年 登記的宮頸癌發(fā)病率為12. 96/10萬(wàn)，且中國(guó)宮頸癌的發(fā)病正呈年輕化趨勢(shì)發(fā)展（應(yīng)倩等， "中國(guó)2009年宮頸癌發(fā)病與死亡分析"中國(guó)腫瘤2013,22:612-616)。宮頸癌的高發(fā)病率和 年輕化趨勢(shì)嚴(yán)重影響著中國(guó)廣大婦女的健康和生活質(zhì)量，因此對(duì)宮頸癌或其癌前病變的早 期診斷和防治意義十分重大。
[0003] 自20世紀(jì)40年代W來(lái)，己氏涂片開始被廣泛用于宮頸癌篩查。宮頸細(xì)胞學(xué)檢查 具有較高的特異性，但其最主要的不足是敏感性低。單次常規(guī)己氏涂片對(duì)于診斷高級(jí)別宮 頸上皮內(nèi)瘤變（cervical inhaepithelial neoplasia，CIN)的敏感性僅為 50%左右。20 世紀(jì)90年代開始發(fā)展了液基細(xì)胞學(xué)（liquid-based ecology, LBC)檢查，LBC通過專用設(shè) 備實(shí)現(xiàn)了液基細(xì)胞的薄層制片，提高了宮頸脫落細(xì)胞標(biāo)本的滿意率，但對(duì)于診斷高級(jí)別CIN 的敏感性仍較低，僅為38-65 %，送與常規(guī)己氏涂片相比，并無(wú)顯著差異。
[0004] 德國(guó)著名醫(yī)學(xué)科學(xué)家Harald zur Hausen早在20世紀(jì)70年代研究發(fā)現(xiàn)高危型人 乳頭狀瘤病毒（Human Papillomavirus, HPV)感染是宮頸癌的成因。事實(shí)上，宮頸癌的發(fā) 病一般需要經(jīng)歷從HPV持續(xù)感染到不同程度的CIN(CIN1-CIN3)，最后發(fā)展成為宮頸癌。送 個(gè)過程一般比較漫長(zhǎng)，平均需要10-15年時(shí)間，送為宮頸癌或其癌前病變的早期發(fā)現(xiàn)和阻 斷提供了足夠的時(shí)間?；诟呶Ｐ虷PV與宮頸癌之間存在明確的病因關(guān)系，HPV檢測(cè)已被 歐洲生殖道感染和腫瘤研究組織巧UR0GIN)推薦作為宮頸癌的初篩手段。然而，HPV檢測(cè) 的最大局限性在于陽(yáng)性預(yù)測(cè)值低。有研究表明，近90%的HPV陽(yáng)性婦女是一過性感染，HPV 會(huì)在2年內(nèi)被機(jī)體免疫清除，僅有少數(shù)發(fā)展為持續(xù)感染（de Sanjos6 et al.，"Worldwide prev曰lence 曰nd genotype distribution of cervic曰1 hum曰n p曰pillom曰virus DNA in women with normal cytology:a meta-analysis"Lancet Infect. Dis. 2007,7:453-459)； 而在HPV持續(xù)感染的婦女中也僅有少數(shù)會(huì)最終發(fā)生宮頸癌（化bie and化schieri， "Understanding HPV tests and their appropriate applications" Cytopathology 2013,24:289-308)。臨床上，HPV檢測(cè)容易導(dǎo)致陰道鏡回叫率和宮頸活檢的比例增加，造成 過度診療，從而增加了患者的精神壓力及隨診費(fèi)用。因此，選擇恰當(dāng)?shù)姆椒▽?duì)HPV初篩陽(yáng)性 婦女進(jìn)行合適的分流是有效管理大量HPV初篩陽(yáng)性婦女的關(guān)鍵。
[0005] microRNA(miRNA)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一類非編碼小分子RNA，它能在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào) 控基因的表達(dá)，其表達(dá)情況與機(jī)體眾多生理病理狀態(tài)密切相關(guān)。越來(lái)越多的研究證據(jù)表明， 異常的miRNA表達(dá)是人類疾病的標(biāo)志，包括腫瘤。但遺憾的是，miRNA(特別是宮頸脫落細(xì) 胞中的miRNA)檢測(cè)在宮頸癌或其癌前病變篩查中的應(yīng)用研究卻仍不多。此外，關(guān)于新的與 宮頸癌或其癌前病變相關(guān)miRNA也有待進(jìn)一步挖掘。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供microRNA在制備診斷宮頸癌或其癌前病變的試劑盒中的 應(yīng)用。
[0007] 在本發(fā)明的第一方面，提供miR-375和/或miR-424的用途，用于制備診斷宮頸癌 或其癌前病變的診斷試劑。
[0008] 在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的診斷試劑包括：
[000引 （1)特異性擴(kuò)增miR-375和/或miR-424的引物；或
[0010] (2)特異性識(shí)別（結(jié)合）miR-375和/或miR-424的探針；較佳地為DNA探針。
[00川在本發(fā)明的另一方面，提供特異性檢測(cè)miR-375和/或miR-424的試劑的用途，用 于制備診斷宮頸癌或其癌前病變的診斷試劑盒。
[0012] 在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的特異性檢測(cè)miR-375和/或miR-424的試劑包括：
[001引 （1)特異性擴(kuò)增miR-375和/或miR-424的引物；或
[0014] (2)特異性識(shí)別（結(jié)合）miR-375和/或miR-424的探針；較佳地為DNA探針。
[001引在另一優(yōu)選例中，所述的特異性擴(kuò)增miR-424的引物的核巧酸序列如SEQ ID N0:8 和沈Q ID NO: 11所示。
[0016] 在另一優(yōu)選例中，所述的特異性擴(kuò)增miR-375的引物的核巧酸序列如SEQ ID N0:9 和沈Q ID NO: 11所示。
[0017] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種用于診斷宮頸癌或其癌前病變的試劑盒，所述試 劑盒中包括：
[001引 （1)特異性擴(kuò)增miR-375和/或miR-424的引物；或
[0019] (2)特異性識(shí)別（結(jié)合）miR-375和/或miR-424的探針；較佳地為DNA探針。
[0020] 在一個(gè)優(yōu)選例中，所述試劑盒中包括特異性識(shí)別（結(jié)合）miR-375和/或miR-424 的DM探針，并且，還包括：
[0021] (3)捕獲抗體，其是抗DNA-RNA雜合體的特異性抗體，其包含于溶液中或被固定于 固相載體上；和
[0022] (4)檢測(cè)抗體，其是連接有可檢測(cè)信號(hào)的抗DNA-RNA雜合體的特異性抗體。
[0023] 在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒中還包括選自下組的一種或多種試劑或組件：
[0024] 樣品裂解液；
[0025] 洗涂液；
[002引變性液；
[0027] 陰性質(zhì)控品；
[002引 陽(yáng)性質(zhì)控品；
[0029] 鑒定可檢測(cè)信號(hào)的試劑；和/或
[0030] 微孔板。
[0031] 在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒中還包括；特異性擴(kuò)增miR-218的引物；或特異性 識(shí)別（結(jié)合）miR-218的探針；較佳地為DNA探針。較佳地，所述的特異性擴(kuò)增miR-218的 引物的核巧酸序列如SEQ ID NO: 10和SEQ ID NO: 11所示。
[0032] 在另一優(yōu)選例中，所述的可檢測(cè)信號(hào)選自；堿性磯酸酶，辣根過氧化物酶，葡萄糖 氧化酶，目-D-半乳糖巧酶，脈酶，過氧化氨酶或葡萄糖淀粉酶；所述的鑒定可檢測(cè)信號(hào)的 試劑是所述堿性磯酸酶，辣根過氧化物酶，葡萄糖氧化酶，目-D-半乳糖巧酶，脈酶，過氧化 氨酶或葡萄糖淀粉酶的底物。
[0033] 在另一優(yōu)選例中，所述試劑盒中包括特異性擴(kuò)增miR-375和/或miR-424的引物， 并且，還包括：
[0034] 總RNA提取試劑；
[00對(duì)逆轉(zhuǎn)錄試劑；
[0036] miR-375 和 / 或 miR-424 逆轉(zhuǎn)錄引物；
[0037] miRNA的PCR檢測(cè)試劑；
[00測(cè) miRNA核酸擴(kuò)增引物；
[003引陰性質(zhì)控品；和/或
[0040] 陽(yáng)性質(zhì)控品。
[0041] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種診斷宮頸癌或其癌前病變的方法，所述方法包括： 應(yīng)用所述的試劑盒檢測(cè)受試者離體宮頸組織或細(xì)胞樣本中miR-375和/或miR-424的存在 量；較佳地，該方法包括：
[0042] (1)將待測(cè)樣本裂解后，與所述的特異性識(shí)別miR-375和/或miR-424的DNA探針 進(jìn)行雜交反應(yīng)，獲得雜交液；
[0043] (2)將雜交液加樣到包被有捕獲抗體的固相載體上，在固相載體上形成捕獲抗體 與DNA-RNA雜合體二元復(fù)合物；
[0044] (3)將檢測(cè)抗體加樣于固相載體，在固相載體上形成捕獲抗體、DNA-RNA雜合體和 檢測(cè)抗體Η元復(fù)合物；
[0045] (4)鑒定固相載體上的可檢測(cè)信號(hào)，確定待測(cè)樣品中miR-375和/或miR-424的存 在量；若miR-375和/或miR-424的存在量顯著低于正常宮頸組織或細(xì)胞中的存在量，則提 示該受試者存在宮頸癌或其癌前病變；
[0046] 或者，所述方法包括：應(yīng)用所述的試劑盒檢測(cè)受試者離體宮頸組織或細(xì)胞樣本中 miR-375和/或miR-424的存在量；較佳地，該方法包括：
[0047] (a)提取受試者離體宮頸組織或細(xì)胞樣本的總RNA ;
[0048] 化）利用miR-375和/或miR-424逆轉(zhuǎn)錄引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，獲得miR-375和/或 miR-424 的 cDNA ;
[0049] (C)利用特異性擴(kuò)增miR-375和/或miR-424的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，確定miR-375 和/或miR-424的存在量；若miR-375和/或miR-424的存在量顯著低于正常宮頸組織或 細(xì)胞中的存在量，則提示該受試者存在宮頸癌或其癌前病變。
[0050] 本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見 的。
【附圖說(shuō)明】