專利名稱：人源參與微絲組裝調(diào)控的核蛋白及其制備和應(yīng)用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物基因領(lǐng)域，具體地說是一種人源參與微絲組裝調(diào)控的核蛋白，本發(fā)明也涉及這種人源參與微絲組裝調(diào)控的核蛋白的制備和應(yīng)用方法。
背景技術(shù)：
微絲是胞漿中一組由纖維狀結(jié)構(gòu)組成的網(wǎng)架。微絲幾乎遍布于一切真核細(xì)胞，不僅僅是活細(xì)胞的支撐結(jié)構(gòu)，形成微絨毛，而且在細(xì)胞器的運(yùn)動(dòng)、質(zhì)膜的流動(dòng)性、胞質(zhì)環(huán)流以及頂體反應(yīng)等細(xì)胞活動(dòng)中扮演重要的角色。肌肉的收縮也主要靠微絲的運(yùn)動(dòng)來實(shí)現(xiàn)，當(dāng)細(xì)胞受到外來信號(hào)的刺激時(shí)，也是依靠細(xì)胞膜下肌動(dòng)蛋白結(jié)構(gòu)的變化而進(jìn)行信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)的。
微絲是由一些小的蛋白分子通過組裝形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，而且微絲一些重要功能(如參與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞黏附)都是通過骨架蛋白的組裝和解聚來實(shí)現(xiàn)的，因此研究微絲的組裝和解聚，尤其是研究發(fā)現(xiàn)參與微絲組裝和解聚的分子具有十分重要的意義。
通過差異顯示技術(shù)從人肺上皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了一種mRNA序列，同時(shí)通過生物信息學(xué)分析確定其編碼區(qū)，并推測(cè)其是一種膜結(jié)合相關(guān)蛋白。本發(fā)明從肺上皮細(xì)胞中分離了其編碼蛋白P18的基因序列，并對(duì)其功能進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)P18蛋白參與了微絲的組裝和細(xì)胞黏附。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種來自于人源的參與微絲組裝和細(xì)胞黏附的核蛋白。本發(fā)明的目的還在于提供這種人源參與微絲組裝調(diào)控的核蛋白的制備和應(yīng)用方法。
本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明的人源參與微絲組裝和細(xì)胞黏附的核蛋白，來源于人正常肺上皮細(xì)胞，它是由173個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)。它具有SEQ IDNo.1所示的核酸序列。其名稱為大腸桿菌JM 109/pET-28b-p18(Escherichia coli JM109/pET-28b-p18)；保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心；保藏單位地址中國(guó).武漢.武漢大學(xué)(郵政編碼430072)；保藏日期為2005年8月25日；保藏編號(hào)CCTCC NOM205092。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)是采用下列方法來制備的首先提取正常人類肺組織的總RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄PCR的方法合成cDNA，用特異性引物擴(kuò)增所述的人P18基因蛋白編碼序列，將所述人參與微絲組裝與細(xì)胞黏附的核蛋白編碼序列插入真核細(xì)胞表達(dá)載體，得到含有所述人參與微絲組裝與細(xì)胞黏附的核蛋白編碼序列的重組表達(dá)載體，將該重組表達(dá)載體導(dǎo)入真核細(xì)胞，通過免疫印跡的方法確認(rèn)了所述的人參與微絲組裝與細(xì)胞黏附的核蛋白的表達(dá)。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)在參與微絲組裝與細(xì)胞黏附方面的應(yīng)用是采用下列方法來進(jìn)行的將所述人參與微絲組裝與細(xì)胞黏附的核蛋白編碼序列插入真核細(xì)胞表達(dá)載體，得到含有所述人參與微絲組裝與細(xì)胞黏附的核蛋白編碼序列的重組表達(dá)載體，將該重組表達(dá)載體導(dǎo)入真核細(xì)胞，從導(dǎo)入了所述的人參與微絲組裝與細(xì)胞黏附的核蛋白編碼序列的重組表達(dá)載體的細(xì)胞中觀察到細(xì)胞微絲結(jié)構(gòu)的變化。
在概括和以特定的實(shí)施方案描述本發(fā)明前，列舉在描述本發(fā)明的上下文中所用的縮寫及代號(hào)。未在下文或說明書的其他部分定義的那些縮寫及代號(hào)具有本領(lǐng)域認(rèn)同的意義。
縮寫“P18”是指本發(fā)明所提供的人源的參與微絲組裝和細(xì)胞黏附的核蛋白，具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。
代號(hào)“Invitrogen公司”指的是一家總部在美國(guó)的生物公司。
代號(hào)“TRIZOL”指的是Invitrogen公司的一種提取RNA的試劑的商標(biāo)。
代號(hào)“Dnase I”指的是脫氧核糖核酸酶I，是一種將單鏈和雙鏈的DNA降解為寡聚脫氧核糖核酸的酶。
代號(hào)“ThermoScriptTMRT-PCR System”指的是Invitrogen公司的一種逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的名稱。
縮寫“ORF”指的是基因中的開放讀碼框，其是蛋白質(zhì)的編碼基因。
縮寫“PCR”指的是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是一種將核酸片段大量擴(kuò)增的技術(shù)。
代號(hào)“pcDNA3.1D/V5-His-TOPO”指的是Invitrogen公司的一種真核表達(dá)質(zhì)粒的名稱。
縮寫“LB”指的是Luria-Bertani培養(yǎng)基，是一種細(xì)菌生長(zhǎng)用的培養(yǎng)基。
代號(hào)“Roche公司”指的是一家總部在德國(guó)的生物公司。
代號(hào)“FuGENETM6 Transfection Reagent”指的是Roche公司的細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑。
代號(hào)“NIH3T3”指的是一種小鼠成纖維細(xì)胞株。
縮寫“FBS”指的是胎牛血清。
代號(hào)“Western blot”指的是蛋白質(zhì)免疫印跡反應(yīng)。
代號(hào)“anti-P18-IgY”指的是雞抗人P18抗體。
縮寫“K4M”指的是一種細(xì)胞或組織的包埋劑。
縮寫“FITC”指的是異硫氰酸熒光黃，是一種熒光染料。
代號(hào)“Northern blot”指的是RNA印跡反應(yīng)。


圖1是P18蛋白表達(dá)的分析圖；圖2、3是P18蛋白的亞細(xì)胞定位圖；圖4、5是P18蛋白參與微絲組裝的激光共聚焦圖片；圖6是P18 mRNA表達(dá)的組織分布圖。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合附圖舉例對(duì)本發(fā)明作更詳細(xì)的描述1、人參與微絲組裝與細(xì)胞黏附的核蛋白全編碼區(qū)的克隆步驟1 cDNA第一條鏈的合成(1)正常肺組織總RNA的提取應(yīng)用Invitrogen公司TRIZOL RNA提取試劑，按說明書提供的方法提取正常肺組織的總RNA。并用DNase I處理所提組織總RNA，然后再用TRIZOL總RNA提取試劑純化RNA，通過RNA/DNA計(jì)算器測(cè)定RNA含量，調(diào)整濃度約為1μg/μl，于1％甲醛變性瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè)所提RNA標(biāo)本的完整性。
(2)采用Invitrogen公司的ThermoScriptTMRT-PCR System，采用隨機(jī)六堿基引物(random hexamer)進(jìn)行高溫逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA的第一條鏈。反應(yīng)條件25℃10min→60℃ 60min→85℃ 5min。
步驟2 PCR擴(kuò)增P18蛋白的ORF區(qū)為增強(qiáng)反應(yīng)的特異性，采用巢式PCR擴(kuò)增P18ORF區(qū)。根據(jù)軟件預(yù)測(cè)的ORF區(qū)設(shè)計(jì)引物。第一次PCR 所用的上游引物為5′-GGACTAAGAGGGGAGCAAGGCGAGGAG-3′，下游引物為5′-CTCTGGCTGTTCCCAAGAGCAGGCTC-3′。第二次PCR所用的上游引物為5′-CACCATGCTCCCGCCGCCCCCGCGCCAG-3′，下游引物為5′-AGCCGCCACCTCCTGCTTGCCCTGGCAG-3′。第一次PCR所用引物位于第二次PCR所用引物的外側(cè)。同時(shí)，為減少PCR過程中的錯(cuò)誤堿基摻入，采取增大模板量，盡量減少PCR循環(huán)數(shù)的策略。
步驟3 真核表達(dá)載體的構(gòu)建(1)連接與轉(zhuǎn)化采用Invitrogen公司pcDNA3.1D/V5-His-TOPO質(zhì)粒作為真核表達(dá)載體。參照說明書的方法進(jìn)行連接，并參照《分子克隆》(1989)所述的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化大腸桿菌。涂布于含有氨芐青霉素抗性的LB平板。
(2)重組體的確認(rèn)隨機(jī)挑選40個(gè)菌落，置于5ml含氨芐青霉素(100ng/ml)的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)16h，取1ml細(xì)菌培養(yǎng)物用于重組質(zhì)粒序列測(cè)定(上海英駿生物技術(shù)有限公司)。
2、P18真核表達(dá)載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的建立步驟1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染采用Roche公司的FuGENETM6 Transfection Reagent作為轉(zhuǎn)染試劑，并參照說明書將P18重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞。
步驟2 篩選穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞克隆(1)轉(zhuǎn)染后72h，將細(xì)胞以1∶6的比例傳代，此時(shí)用含新霉素(G418)的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。
(2)根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)，每3天換液一次，直至抗性克隆形成。
(3)將已形成的抗性克隆細(xì)胞轉(zhuǎn)移到24孔板中，加入新鮮的含10％FBS的全培養(yǎng)基進(jìn)行傳代培養(yǎng)，直至有足夠的細(xì)胞數(shù)量用于后續(xù)試驗(yàn)，其間維持G418的篩選濃度。
步驟3 Western blot確認(rèn)P18蛋白的表達(dá)用雞抗人anti-P18-IgY抗體用作一抗，參照《分子克隆》(1989)所述方法進(jìn)行Western blot分析。結(jié)果如圖1所示，從圖中清晰可見轉(zhuǎn)染后，蛋白表達(dá)量明顯增加。
3、P18蛋白的亞細(xì)胞定位步驟1 K4M低溫包埋電子顯微鏡標(biāo)示的制備穩(wěn)定表達(dá)P18蛋白的細(xì)胞經(jīng)戊二醛和多聚甲醛溶液固定，重蒸水洗滌，乙醇系列脫水，包埋劑滲透，乙醇/K4M混合液浸透，再經(jīng)純K4M浸透。樣品在-30℃下紫外照射聚合24h以上，然后將樣品放在室溫下繼續(xù)用紫外照射聚合2-3天。
步驟2 抗P18抗體免疫電鏡觀察細(xì)胞經(jīng)K4M包埋后，超薄切片。切片浸入PBSTT(磷酸鹽緩沖液+BSA+TritonX100+Tween-20)中室溫下作用15min，PBS充分洗滌。用雞抗人P18抗體室溫下作用60min。PBS洗滌3次，每次5min。再與15nm蛋白A-膠體金復(fù)合物于室溫下作用60min。PBS和重蒸水充分洗滌，5％醋酸雙氧鈾染色15min。重蒸水充分洗滌后，在透射電子顯微鏡下觀察照相。
對(duì)照實(shí)驗(yàn)中，一抗用抗體稀釋液代替抗P18抗體。其他步驟與抗P18抗體標(biāo)記步驟相同。結(jié)果如圖2，上圖為轉(zhuǎn)染前，下圖為轉(zhuǎn)染后。箭頭所示為轉(zhuǎn)染后在核內(nèi)大量出現(xiàn)金顆粒，表明此蛋白主要定位于細(xì)胞核內(nèi)。
4、P18蛋白對(duì)微絲組裝的影響從培養(yǎng)皿中取出細(xì)胞培養(yǎng)片后，PBS洗滌；室溫下用多聚甲醛固定，并用PBS洗滌。然后將載有細(xì)胞的蓋玻片浸入TritonX-100中于室溫作用10min，并用PBS洗滌。經(jīng)BSA封閉后，用FITC標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽在室溫下進(jìn)行。然后用PBS洗滌兩次。最后滴加n-Propyl gallate(n-丙基沒石子酸酯)進(jìn)行封片，用激光共聚焦顯微鏡觀察。結(jié)果如圖3所示，上圖為轉(zhuǎn)染前，下圖為轉(zhuǎn)染后。從圖中可以清晰地看出，轉(zhuǎn)染含有P18序列的質(zhì)粒后，細(xì)胞微絲結(jié)構(gòu)發(fā)生紊亂，細(xì)胞間連接消失，說明P18蛋白參與了細(xì)胞微絲的組裝調(diào)控，對(duì)細(xì)胞間連接產(chǎn)生了直接的影響。
5、P18 mRNA在人類12種組織的分布以P18基因的cDNA為探針，對(duì)人正常多組織雜交膜(Clontech公司)進(jìn)行Northern blot分析。參照說明書所提供的方法，結(jié)果如圖4所示。
序列表SEQ ID No.1序列信息<110>哈爾濱工業(yè)大學(xué)<120>人源參與微絲組裝調(diào)控的核蛋白P18編碼序列<160>2<210>1<211>522<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>1atg ctc ccg ccg ccc ccg cgc cag ccg ccg ccc cag gcg cgt gcg gcc cgc ggc gcg gtg 60Met Leu Pro Pro Pro Pro Arg Gln Pro Pro Pro Gln Ala Arg Ala Ala Arg Gly Ala Val5 10 15 20cgc ctg cag cgg ccc ttc ctg cgc agc ccg ctg ggc gtg ttg cgg ctg ctg cag ctg ctg 120Arg Leu Gln Arg Pro Phe Leu Arg Ser Pro Leu Gly Val Leu Arg Leu Leu Gln Leu Leu25 30 35 40gcc ggc gct gcc ttc tgg atc act atc gcc acc agc aag tac cag ggc ccc gtg cac ttc 180Ala Gly Ala Ala Phe Trp Ile Thr Ile Ala Thr Ser Lys Tyr Gln Gly Pro Val His Phe45 50 55 60gcg ctc ttc gtg tcc gtg ctc ttc tgg ctg ctc acc ctg ggc ctc tac ttc ctc acg ctg 240Ala Leu Phe Val Ser Val Leu Phe Trp Leu Leu Thr Leu Gly Leu Tyr Phe Leu Thr Leu65 70 75 80ctg ggc aag cac gag ctg gtc ccc gtg ctg ggc tcg cgc tgg ctc atg gtc aac gtg gcg 300Leu Gly Lys His Glu Leu Val Pro Val Leu Gly Ser Arg Trp Leu Met Val Asn Val Ala85 90 95 100cac gat gtg ctg gcg gcc gcg ctc tac ggc gcc gcc acc ggc atc atg agc gac cag atg 360His Asp Val Leu Ala Ala Ala Leu Tyr Gly Ala Ala Thr Gly Ile Met Ser Asp Gln Met105 110 115 120cag cgc cac agc tac tgc aac ctc aag gat tac ccg ctc ccc tgc gcc tac cac gcc ttc 420Gln Arg His Ser Tyr Cys Asn Leu Lys Asp Tyr Pro Leu Pro Cys Ala Tyr His Ala Phe125 130 135 140ctg gcg gcc gcc gtc tgc ggc ggc gtc tgc cac ggc ctc tac ctg ctt tcg gcg ctc tat 480Leu Ala Ala Ala Val Cys Gly Gly Val Cys His Gly Leu Tyr Leu Leu Ser Ala Leu Tyr145 150 155 160ggc tgc ggg cgt cgc tgc cag ggc aag cag gag gtg gcg tga 522Gly Cys Gly Arg Arg Cys Gln Gly Lys Gln Glu Val Ala165 170<210>2<211>173<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>2Met Leu Pro Pro Pro Pro Arg Gln Pro Pro Pro Gln Ala Arg Ala5 10 15Ala Arg Gly Ala Val Arg Leu Gln Arg Pro Phe Leu Arg Ser Pro
20 25 30Leu Gly Val Leu Arg Leu Leu Gln Leu Leu Ala Gly Ala Ala Phe35 40 45Trp Ile Thr Ile Ala Thr Ser Lys Tyr Gln Gly Pro Val His Phe50 55 60Ala Leu Phe Val Ser Val Leu Phe Trp Leu Leu Thr Leu Gly Leu65 70 75Tyr Phe Leu Thr Leu Leu Gly Lys His Glu Leu Val Pro Val Leu80 85 90Gly Ser Arg Trp Leu Met Val Asn Val Ala His Asp Val Leu Ala95 100 105Ala Ala Leu Tyr Gly Ala Ala Thr Gly Ile Met Ser Asp Gln Met110 115 120Gln Arg His Ser Tyr Cys Asn Leu Lys Asp Tyr Pro Leu Pro Cys125 130 135Ala Tyr His Ala Phe Leu Ala Ala Ala Val Cys Gly Gly Val Cys140 145 150His Gly Leu Tyr Leu Leu Ser Ala Leu Tyr Gly Cys Gly Arg Arg155 160 165Cys Gln Gly Lys Gln Glu Val Ala170
權(quán)利要求
1.一種人源參與微絲組裝調(diào)控的核蛋白，其特征是人參與微絲組裝和細(xì)胞黏附的核蛋白來源于人正常肺上皮細(xì)胞，它是由173個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人源參與微絲組裝調(diào)控的核蛋白，其特征是所述的人源參與微絲組裝調(diào)控的核蛋白具有SEQ ID No.1所示的核酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的人源參與微絲組裝調(diào)控的核蛋白，其特征是所述的SEQ ID No.1核酸序列為Met Leu Pro Pro Pro Pro Arg Gln Pro Pro Pro Gln Ala Arg Ala5 10 15Ala Arg Gly Ala Val Arg Leu Gln Arg Pro Phe Leu Arg Ser Pro20 25 30Leu Gly Val Leu Arg Leu Leu Gln Leu Leu Ala Gly Ala Ala Phe35 40 45Trp Ile Thr Ile Ala Thr Ser Lys Tyr Gln Gly Pro Val His Phe50 55 60Ala Leu Phe Val Ser Val Leu Phe Trp Leu Leu Thr Leu Gly Leu65 70 75Tyr Phe Leu Thr Leu Leu Gly Lys His Glu Leu Val Pro Val Leu80 85 90Gly Ser Arg Trp Leu Met Val Asn Val Ala His Asp Val Leu Ala95 100 105Ala Ala Leu Tyr Gly Ala Ala Thr Gly Ile Met Ser Asp Gln Met110 115 120Gln Arg His Ser Tyr Cys Asn Leu Lys Asp Tyr Pro Leu Pro Cys125 130 135Ala Tyr His Ala Phe Leu Ala Ala Ala Val Cys Gly Gly Val Cys140 145 150His Gly Leu Tyr Leu Leu Ser Ala Leu Tyr Gly Cys Gly Arg Arg155 160 165Cys Gln Gly Lys Gln Glu Val Ala170
4.一種人源參與微絲組裝調(diào)控的核蛋白的制備方法，其特征是首先提取正常人類肺組織的總RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄PCR的方法合成cDNA，用特異性引物擴(kuò)增所述的人P18基因蛋白編碼序列，將所述人參與微絲組裝與細(xì)胞黏附的核蛋白編碼序列插入真核細(xì)胞表達(dá)載體，得到含有所述人參與微絲組裝與細(xì)胞黏附的核蛋白編碼序列的重組表達(dá)載體，將該重組表達(dá)載體導(dǎo)入真核細(xì)胞，通過免疫印跡的方法確認(rèn)了所述的人參與微絲組裝與細(xì)胞黏附的核蛋白的表達(dá)。
5.一種人源參與微絲組裝調(diào)控的核蛋白的應(yīng)用方法，其特征是將所述人參與微絲組裝與細(xì)胞黏附的核蛋白編碼序列插入真核細(xì)胞表達(dá)載體，得到含有所述人參與微絲組裝與細(xì)胞黏附的核蛋白編碼序列的重組表達(dá)載體，將該重組表達(dá)載體導(dǎo)入真核細(xì)胞，從導(dǎo)入了所述的人參與微絲組裝與細(xì)胞黏附的核蛋白編碼序列的重組表達(dá)載體的細(xì)胞中觀察到細(xì)胞微絲結(jié)構(gòu)的變化。
全文摘要
本發(fā)明設(shè)計(jì)的是人源參與微絲組裝調(diào)控的核蛋白及其制備和應(yīng)用方法。它來源于人正常肺上皮細(xì)胞，它是由173個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)。首先提取正常人類肺組織的總RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄PCR的方法合成cDNA，用特異性引物擴(kuò)增所述的人P18基因蛋白編碼序列，將所述人參與微絲組裝與細(xì)胞黏附的核蛋白編碼序列插入真核細(xì)胞表達(dá)載體，得到含有所述人參與微絲組裝與細(xì)胞黏附的核蛋白編碼序列的重組表達(dá)載體，將該重組表達(dá)載體導(dǎo)入真核細(xì)胞，通過免疫印跡的方法確認(rèn)了所述的人參與微絲組裝與細(xì)胞黏附的核蛋白的表達(dá)。
文檔編號(hào)C12N15/10GK1865441SQ20061000977
公開日2006年11月22日 申請(qǐng)日期2006年3月8日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月8日
發(fā)明者李鈺, 呂冰潔, 赫杰, 王山, 雷露 申請(qǐng)人:哈爾濱工業(yè)大學(xué)