專利名稱：茉莉酸甲酯應答的人參PgPDR3基因啟動子及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于植物基因工程技術領域，具體涉及一個受茉莉酸甲酯應答的人參TOR轉(zhuǎn)運蛋白基因的啟動子。
背景技術：
人參0°.ginseng C.A.Meyer)為五加科人參屬多年生草本植物,是名貴中藥材。人參中含有多種藥用成分，其中人參皂苷是人參最主要的活性成分。目前已從人參根中分離出50余種人參皂苷，現(xiàn)代醫(yī)學研究證明各皂苷單體具有重要的藥用價值，且已廣泛應用于臨床。但是其中一些具有抗腫瘤、抗衰老、抑制細胞凋亡和增強免疫力等活性強的皂苷含量極低。利用人參皂苷合成代謝相關的基因調(diào)控技術促進人參皂苷的合成與積累具有重要的理論價值和應用前景。基因的有效轉(zhuǎn)錄和表達是發(fā)揮其基因功能的重要條件，基因成功轉(zhuǎn)錄和表達需要依靠啟動子對其的調(diào)控，啟動子與RNA聚合酶、轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子等相互作用發(fā)揮其調(diào)控的功能。真核生物中的TATA和CAAT框，它們決定了轉(zhuǎn)錄的起始位點和效率，負責和RNA聚合酶結(jié)合，啟動基本轉(zhuǎn)錄過 程。啟動子組件有許多不同的類型，包括病原誘導型作用元件、組織特異型作用元件和化學物質(zhì)誘導作用元件等。其中化學物質(zhì)誘導型作用元件在促進次生代謝產(chǎn)物合成方面起重要作用。在次生代謝產(chǎn)物合成與積累相關基因的表達過程中，順式作用元件通過與轉(zhuǎn)錄因子的互作發(fā)揮著重要調(diào)控作用:環(huán)境刺激經(jīng)過一系列信號轉(zhuǎn)導、傳遞后，激活防衛(wèi)相關轉(zhuǎn)錄因子與特異順式作用元件的互作，從而實現(xiàn)相關防衛(wèi)功能基因的表達。鑒于順式作用元件的上述重要調(diào)控作用，使用誘導型啟動子介導的抗性基因無疑具有多方面的優(yōu)勢，因此鑒定次生代謝產(chǎn)物合成與積累相關的誘導型啟動子已成為目前植物分子生物學研究的熱點之一。在人參次生代謝調(diào)控中，可以通過導入關鍵酶等基因調(diào)控合成途徑中的多步限速反應，或者通過順式作用元件在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控人參皂苷合成、轉(zhuǎn)運和積累相關基因的表達，從而提聞人參阜昔的含量。植物ABC轉(zhuǎn)運蛋白(ATP-binding cassette transporter)是目前已知最大，功能最廣泛的蛋白家族，ABC轉(zhuǎn)運蛋白屬跨膜運輸?shù)鞍祝盟釧TP釋放的能量轉(zhuǎn)運有機酸、生物堿、細胞代謝產(chǎn)物和藥物等。參與細菌耐藥性、次生代謝產(chǎn)物積累、脅迫反應和腫瘤抗藥性等。ABC轉(zhuǎn)運蛋白家族包括多向耐藥性蛋白(pleiotropic drug resistance,PDR),多藥耐藥性蛋白(multidrug resistance, MDR)等。PDR是其中最大的亞族,是植物和真菌中特有的一種ABC轉(zhuǎn)運蛋白。但目前對植物PDR基因相關研究甚少，離體細胞培養(yǎng)中，香紫蘇醇可誘導層基因上調(diào)表達，在細胞內(nèi)NpTORl蛋白累積增強了細胞向胞外轉(zhuǎn)運香紫蘇醇以及其類似物的能力。擬南芥(A細胞內(nèi)香紫蘇醇的累積亦能誘導
基因上調(diào)表達，同時在細胞外檢測到AtH)R12蛋白向胞外轉(zhuǎn)運的香紫蘇醇，推測萜類物質(zhì)可能是基因表達的上游調(diào)控物質(zhì)。矮牽牛中PhTORl蛋白可以轉(zhuǎn)運一種新發(fā)現(xiàn)的植物激素——獨角金內(nèi)酯，進而促進矮牽牛分枝。因而，PDR轉(zhuǎn)運蛋白基因在調(diào)控次生代謝產(chǎn)物的積累方面具有重要潛力。然而，在發(fā)明人的研究之前，尚無人參PDR蛋白基因及其調(diào)控元件的報道，更不存在與該基因表達調(diào)控相關的影響次生代謝產(chǎn)物合成與積累相關的誘導型啟動子的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在從人參中分離出受茉莉酸甲酯應答調(diào)控的PgPDR3基因誘導型啟動子，從而提供一種能夠調(diào)控人參皂苷轉(zhuǎn)運與積累相關的基因資源，為今后開發(fā)基因工程產(chǎn)品奠定基礎。為了達到上述目的，本發(fā)明提供的技術方案為:本發(fā)明提供了一種調(diào)控人參皂苷轉(zhuǎn)運與積累的基因的啟動子ProPDR3，其序列如SEQ ID N0.1所示，或是與SEQ IDN0.1具有99%以上同源性的DNA序列。本發(fā)明所述的啟動子ProH)R3的制備方法為:提取人參根基因組總DNA，以人參根總DNA為模板，構(gòu)建四個啟動子文庫-.Dral文庫、￡boR V文庫、Pvu II文庫和Stu I文庫；分別以構(gòu)建的文庫、AcoR V文庫Ira II文庫和泣w I文庫為模板，根據(jù)人參基因的5'端序列設計引物，進行PCR擴增；膠回收PCR產(chǎn)物，該產(chǎn)物即得本發(fā)明所述的ProPDR3啟動子。上述根據(jù)人參/^/公/ 3基因的5'端序列設計的引物包括外側(cè)引物和巢式引物，夕卜側(cè)引物Pro3-SP如SEQ ID N0.2所示，巢式引物Pro3-Nest_SP如SEQ ID N0.3所示。本發(fā)明還提供了含有ProPDR3啟動子的重組載體，具體包括:植物表達載體PCAMBIA1301,即將ProTOR3啟動子連接到空載體pCAMBIA1301中，獲得ProTOR3啟動子驅(qū)動的⑶S報告基因的重組載體pCAMBIA1301-ProroR3::⑶S。ProPDR3啟動子亦可克隆到其他空載體中，或制備成轉(zhuǎn)基因細胞及重組菌。本發(fā)明還提 供了 proroR3啟動子在調(diào)控人參皂苷轉(zhuǎn)運與積累中的應用以及ProPDR3啟動子在人參育種中的應用。本發(fā)明利用現(xiàn)有的植物基因工程技術，根據(jù)已克隆的人參PgPDR3基因的5'端序列，采用Genomewalker技術分離ProF1DRS啟動子序列，構(gòu)建ProPDR3::⑶S報告基因的重組表達載體，并通過根癌農(nóng)桿菌介導法將基因轉(zhuǎn)入煙草，經(jīng)過異源表達鑒定證明Pr0H)R3對GUS報告基因轉(zhuǎn)錄與表達存在驅(qū)動作用。本發(fā)明人參ABC轉(zhuǎn)運蛋白基因的啟動子ProPDR3序列如SEQ ID N0.1所示。本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)ProH)R3驅(qū)動的⑶S基因表達具有組織特異性且受茉莉酸甲酯和人參皂苷等化學物質(zhì)的誘導，表明所述Pr0H)R3啟動子具有促進調(diào)控人參皂苷轉(zhuǎn)運和積累方面的功能。因此，可以通過該啟動子或其衍生物調(diào)控或改良人參及其它植物，獲得人參皂苷含量高的優(yōu)良植物品種。對于后續(xù)克隆人參皂苷轉(zhuǎn)運信號途徑中的關鍵的調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子基因，以及通過轉(zhuǎn)基因方法調(diào)控人參皂苷等萜類化合物的轉(zhuǎn)運與積累等奠定了基礎。


圖1是本發(fā)明擴增的人參ProPDR3啟動子片段電泳結(jié)果；圖中，I表示PCR擴增產(chǎn)物，M表不Marker ；
圖2是本發(fā)明擴增的人參Pr0H)R3啟動子順式作用元件分析 圖3是轉(zhuǎn)基因煙草中擴增的人參ProPDR3啟動子片段電泳結(jié)果；圖中，riO表示PCR擴增產(chǎn)物，M表示Marker ；
圖4是本發(fā)明的Pi~oroR3啟動子啟動⑶S報告基因在轉(zhuǎn)基因煙草不同組織中的表達水平 圖5是本發(fā)明的ProPDR3啟動子啟動⑶S報告基因在IOOiiM MJ,50uM SA,20uM ABA和20mg/LGS誘導下表達水平圖，其中MJ為茉莉酸甲酯、SA為水楊酸、ABA為脫落酸、GS為
人參皂苷。
具體實施例方式實施實例I Pr0H)R3啟動子的獲得
1、人參根DNA提取及其啟動子文庫的構(gòu)建
取吉林長白山人參產(chǎn)區(qū)四年生人參根，自來水浸泡45min后沖洗2次，先用75%乙醇浸泡30秒(sec)，無菌水沖洗2次。參考Omega Plant DNA Kit (Omega公司)說明提取基因組DNA,以人參根總DNA為模板,按照Genomewalker試劑盒(Takara公司)說明書構(gòu)建DraI文庫(DLl) ,BcoR V 文庫(DL2)、Pvu II 文庫(DL3)和 Stu I 文庫(DL4)。2、引物設計和PCR擴增 (I)引物設計與合成
根據(jù)已克隆的人參/^/公/ 3基因(登錄號為KC013238，專利申請?zhí)枮?01210462401.X)的5'端基因序列,設計外側(cè)和巢式引物,采用Primer Premier 5.0軟件設計引物如下:Pro3-SP:5' -ATGCTCAAATCTGACTTCAATCGTGGG-3' ；(SEQ ID N0.2) Pro3-Nest-SP:5' -TCAACTTCCATACCATTAGTCCTCCAC-3'。(SEQ ID N0.3)
引物由上海英駿生物有限公司合成。(2) PCR 擴增
分別以構(gòu)建的四個啟動子文庫(DL1、DL2、DL3和DL4)為模板，利用Pi~o3-SP引物與試劑盒中外側(cè)引物APl (5’ - GTAATACGACTCACTATAGGGC - 3’)進行第一輪PCR擴增。反應體系為:10XPCR緩沖液 L、MgCl2 (25mmol/L) 5 y L、dNTP (2.5mmol/L)8iiL、Pro3-SP (lOumol/L) 2u L.AP1 (10 y mol/L) 2 y L、文庫 DNA I u L.dd H2O 26.5 u L和 LA Taq DNA polymerase (5U/U L) 0.5 U L。反應條件為:94°C變性25sec，72°C延伸3min，7個循環(huán)；94°C變性25sec、67°C退火3min、32個循環(huán)；72°C延伸IOmin0將上述第一輪PCR產(chǎn)物稀釋50倍，再以試劑盒中提供的巢式引物AP2(5，- ACTATAGGGCACGCGTGGT - 3’)和 Pro3-Nest_SP 引物，以上述同樣體系，94 °C 變性25sec，72°C 延伸 3min，5 個循環(huán)；94°C 變性 25sec，67°C 退火 3min、25 個循環(huán)；72°C 延伸IOmin0 1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物。(3)擴增片段膠回收、連接、測序及分析 將PCR產(chǎn)物膠回收后連接至pGEM-T Easy載體上，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a，將重組質(zhì)粒pGEM-ProPDR3送上海英駿公司測序。測序后獲得的序列長度為917bp的基因片段，對獲得的基因序列與/^/ /以基因5’端重疊區(qū)序列進行比對，經(jīng)比對準確無誤后，對克隆的序列采用 PlantCARE(http://bioinformatiCS.psb.ugent.be/webtools/plantCare/html/)在線分析工具對所克隆的啟動子片段進行順式元件分析，分析結(jié)果見圖2，結(jié)果表明克隆的序列含有啟動子應有的基本元件(TATA-Box和CAAT-Box)和多種順式作用元件。其序列如序列表中SEQ ID N0.1所示。實施實例2植物表達載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化
1、植物表達載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因煙草的篩選
(I)根據(jù)啟動子序列設計片段相對應的包含ife WNco I酶切位點的特異性引物，上下游引物分別命名為Pl和P2。Pl:5' -CGATGGATCCCACTTTGGTTGCTTCTCAATA-3' ；(SEQ ID N0.4)
P2:5' -GGGCCATGGTCTTGCTTTCTATACATCACC-3'。(SEQ ID N0.5)
分別用漢■ HI和Afco I雙酶切pCAMBIA1301和ProPDR3，回收pCAMBIA1301載體和ProPDR3啟動子片段。將兩片段連接并轉(zhuǎn)化DH5 a，通過卡那霉素篩選、PCR和Bam Wl/NcoI雙酶切鑒定獲得重組子，重組質(zhì)粒命名為pCAMBIA1301-ProroR3::⑶S。(2)根癌農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞的制備
①在含有IOOii g/mL利福霉素的YEB平板上劃線培養(yǎng)農(nóng)桿菌EHA105，28°C暗培養(yǎng)2d。②挑取單菌落接種到含有100 U g/mL利福霉素的YEB培養(yǎng)基中，28°C振蕩培養(yǎng)過夜。③將過夜活化的農(nóng)桿菌按1:50的比例稀釋到50mL含有100 U g/mL的卡那霉索的YEB培養(yǎng)基中，28°C振蕩培養(yǎng)至0D600約為0.4-0.6，冰浴30min。④于4°C, 5000rpm 離心 IOmin,棄上清液,用 10mT, 0.15mM NaCl 懸浮菌體。⑤于4°C, 5000rpm離心IOmin,棄上清液,用2mL 20 mM CaCl2懸浮菌體。⑥每管200 U L分裝，液氮速凍，_70°C保存。(3)根癌農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞的轉(zhuǎn)化
①將根癌農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞置于冰上，緩慢解凍。②加入0.5iig pCAMBIA1301-ProPDR3::⑶S 質(zhì)粒 DNA，輕輕混勻，冰浴 30min。③置液氮中冷凍2min，迅速移入37 °C水浴中熱激5min，再迅速冰浴2min，之后加A 800 u L YEB液體培養(yǎng)基，于28 °C振蕩培養(yǎng)3_4h。④5000rpm離心5min沉淀菌體,棄掉800ii L上清后重新懸浮菌體,均勻涂布于含有100 u g/mL利福霉素和50 u g/mL卡那霉素的YEB培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)2_3d。(4)根癌農(nóng)桿菌質(zhì)粒提取和鑒定 ①PCR鑒定
挑取轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌單菌落接種于1.5mL含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中37°C振蕩培養(yǎng)，用Pi*0roR3啟動子特異性引物進行鑒別，引物如下:
P3:5' -CTCTGCTTCTCCAGCGAACT-3' ；(SEQ ID N0.6)
P4:5' -TGTTCCATGCGTGTTGTGTG-3' ；(SEQ ID N0.7)
PCR擴增后，瓊脂糖凝膠電泳檢測是否含有預期片段。PCR反應程序如下:94°C 30sec,58°C 30sec,72°C 30sec，35 個循環(huán)；72°C 2min。②酶切鑒定
挑取挑取PCR鑒定為陽性的農(nóng)桿菌單 菌落接種于含有100 u g/mL的利福霉素和50 ii g/mL的卡那霉素的YEB培養(yǎng)基中，28 °C培養(yǎng)過夜培養(yǎng)，提取重組質(zhì)粒pCAMBIA1301-ProroR3::⑶S，采用上述方法以漢■ HI/Afco I雙酶切提取的質(zhì)粒。經(jīng)過酶切鑒定正確后獲得含重組質(zhì)粒pCAMBIA1301-ProPDR3::⑶S的農(nóng)桿菌。2、基因轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)基因煙草的篩選
(1)含pCAMBIA1301-ProTOR3::⑶S質(zhì)粒的根癌農(nóng)桿菌培養(yǎng)
28°C劃線培養(yǎng)含有pCAMBIA1301-ProroR3::⑶S質(zhì)粒的農(nóng)桿菌約2d。挑取單菌落接種于含有100mg/L利福霉素和50mg/L卡那霉素的YEB液體培養(yǎng)基中，28°C振蕩培養(yǎng)過夜，至0D600約為0.6時收集菌液，4000rpm離心lOmin，沉淀重懸于1/2MS液體培養(yǎng)基中。(2)葉盤法侵染煙草
將煙草benthamiana )幼葉置于自來水中沖洗3_4次,然后在70%乙醇中浸泡30-60sec，10%次氯酸鈉中消毒10-20min，再用無菌水充分沖洗，然后置于無菌培養(yǎng)皿中，將葉片切成0.5-1 cm2的小片，將剪好的葉片分別放入含有pCAMBIA1301-ProroR3::⑶S質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌液中侵染5min，將葉片上的菌液用無菌濾紙吸干。(3)共培養(yǎng)
侵染過并吸干表面菌液的葉盤，氣孔面朝上，緊靠著放在共培養(yǎng)基上(MS+6-BA 1.0mg/L+IAA 0.lmg/L)，黑暗處培養(yǎng) 2d。(4)篩選及分化培養(yǎng)
暗培養(yǎng)2d后，轉(zhuǎn)換到篩選分化培養(yǎng)基上(MS+6-BA 1.0mg/L+IAA 0.lmg/L+Kan IOOmg/L+Cef 300mg/L),每15d換一次篩選分化培養(yǎng)基,至分化出的煙草長至3_5cm時轉(zhuǎn)至生根培養(yǎng)基中。(5)生根培養(yǎng)
將分化至3-5cm的煙草分別切下，轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基(1/2MS+IBA 2.0mg/L)。(6)移栽
當再生植株的根長至5-8cm時，打開封口膜煉苗2-3d，將幼苗移栽至花盆內(nèi)，移栽后最初的5-10d罩上透明塑料，保持90%-100%的濕度，并在罩上打些小孔以利于氣體交換。移栽的基質(zhì)以及花盆均預先消毒。(7)轉(zhuǎn)基因植株PCR鑒定
以轉(zhuǎn)基因植株的基因組DNA為模板，采用上述重組質(zhì)粒鑒定所用的ProroR3基因特異性引物P3和P4進行PCR擴增，PCR反應體系和反應條件同上。轉(zhuǎn)基因煙草植株PCR檢測結(jié)果見圖3，其中廣4、6、分別為轉(zhuǎn)化pCAMBIA1301-ProroR3::⑶S成功并分化成苗的Ttl代陽性轉(zhuǎn)基因植株，5號為轉(zhuǎn)化失敗的植株，10號為轉(zhuǎn)空載體pCAMBIA1301成功并分化成苗的Ttl代陽性轉(zhuǎn)基因植株。 (8) ProPDR3啟動⑶S表達及其活性檢測
利用GUS能與底物MUG (3,4-甲基傘型酮-￠-葡萄糖醛酸苷)反應產(chǎn)生熒光物質(zhì)MU(4-甲基傘型酮)。MU的激發(fā)波長為365nm,發(fā)射波長為456nm,其含量可由突光分光光度計測出。根據(jù)單位質(zhì)量的植物總蛋白在單位時間內(nèi)產(chǎn)生的熒光物質(zhì)的多少來定量的檢測GUS含量。試劑配制:lmol/L Na2HPO4 溶液:35.814g Na2HPO4 溶于 IOOmL 水。lmol/L NaH2PO4溶液:15.601g NaH2PO4溶于 IOOmL水。0.1M磷酸緩沖液(pH7.0): lmol/L 似2冊04取5.1lmL,lmol/L NaH2PO4 取 4.23mL，定容至 100mL。10% SDS 溶液:將 90mL水稍微加熱，加 IOg SDS,攪拌溶解，加入幾滴濃鹽酸調(diào)節(jié)pH至7.2，然后加水定容至IOOmL150.5 M EDTA (pH8.0):在80mL水中加入18.61g Na2EDTA*2H20,用NaOH調(diào)pH至8.0 (約需2g左右的固體NaOH)，溶解后定容至IOOmL0 GUS酶提取液:0.1M磷酸緩沖液(pH7.0)取50mL ；10% SDS取ImL ；0.5MEDTA(pH8.0)取 2mL;Triton X-100 取 100 y L ; 3 -巰基乙醇 IOOyL;用水定容至 IOOmL0MUG底物:稱8.8mg MUG，溶于IOmL⑶S酶提取液中，配制成2mmol/L的工作濃度。反應終止液(0.2 mo I/L Na2CO3):稱2.12g Na2CO3，用水定容至100mL?？捡R斯亮藍G250溶液:考馬斯亮藍G250 IOmg, 95%乙醇5ml, H3PO4 IOmL,定容至IOOmL,過濾后4°C保存。I mg/mLBSA:20mg BSA，用GUS提取緩沖液定容至20mL。①植物總蛋白的提取
取轉(zhuǎn)基因植株新鮮的 植物組織IOOmg左右，用液氮將生物材料急速冷凍，然后采用液氮研磨的方式在研缽里磨碎組織。如果不立即研磨，可以先將液氮冷凍處理的植物組織儲存于_80°C冰箱。將研磨破碎的組織轉(zhuǎn)到Ep管里，并立即加入ImL的⑶S提取緩沖液，充分混勻。12，000rpm，4°C離心5min，將上清轉(zhuǎn)至另一潔凈的Ep管，冰上放置待用。②蛋白濃度的測定
取 7 個 Ep 管，分別加入 0 μ L、2 μ L、4 μ L、8 u LU2u L、16u L,20u L 的 BSA 標準液，用水補至相同體積20 u L0加入980 u L的考馬斯亮藍G250溶液，充分混勻，冰上靜置5min。用紫外分光光度計測定595nm處的吸收值。以蛋白濃度(mg/mL)對吸收值A595做標準曲線。取待測蛋白樣品10 iiL，加IOii L水，加入980 ii L的考馬斯亮藍G250溶液，充分混勻，冰上靜置5min，用紫外分光光度計測定595nm處的吸收值，計算蛋白樣品的濃度。③⑶S表達水平的定量測定
取IOOμ L蛋白上清，加入400 μL 37°C預熱的⑶S提取緩沖液里，再加入500 μ L MUG底物，37°C溫浴。在0min、15min、30min、45min和60min分別取混合反應物200 y L加入到800 u L反應終止液，室溫避光保存。用熒光分光光度計在激發(fā)波長365nm、發(fā)射波長455nm下，狹縫IOnm時測定不同時間點的熒光強度值。以熒光強度值對反應時間作曲線，求出單位時間的熒光強度變化。用單位時間的熒光強度變化除以參加反應的蛋白量，求出單位質(zhì)量的蛋白單位時間的熒光強度變化。圖4為轉(zhuǎn)基因煙草不同組織中⑶S活性與對照煙草(轉(zhuǎn)PCAMBIA1301空載體)不同組織中⑶S表達水平定量測定的相對值(倍數(shù))。圖4顯示ProPDR3啟動子表達具有明顯的組織特異性，其在根中的活性最高。圖5為不同誘導物作用下轉(zhuǎn)基因煙草中GUS活性與對照煙草(轉(zhuǎn)PCAMBIA1301空載體)GUS表達水平定量測定的相對值(倍數(shù))。圖5結(jié)果顯示ProPDR3啟動子受茉莉酸甲酯(MJ)和人參皂苷(ginsenosides，GS)的誘導，而ProPDRl啟動中包含茉莉酸甲酯誘導的順式作用元件(CGTCA-motif、TGACG-motif和T/G_box)，推測Pr0H)R3啟動子的應答反應與這些順式作用元件有關。該啟動子受人參皂苷的誘導，表明其可能參與調(diào)控人參皂苷轉(zhuǎn)運與積累。
權利要求
1.茉莉酸甲酯應答的人參PgPDR3基因啟動子，其特征在于:該啟動子的DNA序列如SEQ ID N0.1所示，或是與SEQ ID N0.1具有99%以上同源性的DNA序列。
2.如權利要求1所述的啟動子的制備方法，其特征在于依次為以下步驟:提取人參根基因組總DNA，以人參根總DNA為模板，構(gòu)建四個啟動子文庫'Dral文庫、V文庫、PvuII文庫和泣 I文庫；分別以構(gòu)建的文庫、&oR V文庫、Pvu II文庫和泣 I文庫為模板，根據(jù)人參PgPDR >基因的5'端序列設計引物，進行PCR擴增；膠回收PCR產(chǎn)物，該產(chǎn)物即得本發(fā)明所述的啟動子ProPDR3。
3.根據(jù)權利要求2所述的制備方法，其特征在于:所述根據(jù)人參基因的5'端序列設計的引物包括外側(cè)弓I物Pro3-SP和巢式引物Pro3-Nest-SP，外側(cè)弓I物Pro3_SP如SEQID N0.2 所示，巢式引物 Pro3-Nest-SP 如 SEQ ID N0.3 所示。
4.含有權利要求1所述啟動子的重組載體，其特征在于:所述重組載體為pCAMBIA1301-ProPDR3::⑶S，所述空載體為pCAMBIA1301載體，在ProPDR3啟動子的下游連接GUS報告基因。
5.如權利要求4所述的重組載體的構(gòu)建方法，其特征在于構(gòu)建步驟為:(1)根據(jù)啟動子序列設計片段相對應的包含及 m/Nco I酶切位點的特異引物；(2)分別用及 HI和Nco I雙酶切pCAMBIA1301和啟動子ProPDR3，回收pCAMBIA1301載體和ProPDR3啟動子片段；(3)將兩片段連接并轉(zhuǎn)化DH5 α，通過卡那霉素篩選、PCR鑒定和及 HI/Afco I雙酶切鑒定，即獲得所述重組載體pCAMBIA1301-ProroR3::⑶S。
6.根據(jù)權利要求5所述的方法，其特征在于:所述步驟(I)中根據(jù)啟動子序列設計片段相對應的包含漢挪HI/Afco I酶切位點的特異引物如SEQ ID N0.4和SEQ ID N0.5所示。
7.根據(jù)權利要求5或6所述的`方法，其特征在于:所述步驟(3)中PCR鑒定所設計的引物對如 SEQ ID N0.6 和 SEQ ID N0.7 所示。
8.根據(jù)權利要求1所述啟動子ProPDR3在調(diào)控人參皂苷轉(zhuǎn)運與積累或人參育種中的應用。
9.根據(jù)權利要求4所述的重組載體pCAMBIA1301-ProroR3:AUS在調(diào)控人參皂苷轉(zhuǎn)運與積累或人參育種中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種茉莉酸甲酯應答的人參PgPDR3基因啟動子及其應用。該人參PgPDR3基因啟動子序列如SEQ ID NO.1所示，或是與SEQ ID NO.1具有99%以上同源性的DNA序列。本發(fā)明采用Genomewalker技術克隆得到PDR轉(zhuǎn)運蛋白基因啟動子序列，并構(gòu)建啟動子表達載體pCAMBIA1301-ProPDR3::GUS，在轉(zhuǎn)基因煙草中該啟動子驅(qū)動GUS表達，并且較強地受人參皂苷、水楊酸、赤霉素和脫落酸的調(diào)控，表明該啟動子參與調(diào)控人參皂苷的轉(zhuǎn)運和積累，這為克隆人參皂苷轉(zhuǎn)運信號途徑中關鍵的調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子基因、以及調(diào)控人參皂苷等萜類化合物的轉(zhuǎn)運與積累等奠定了基礎。通過該啟動子或其衍生物調(diào)控或改良人參及其它植物，可獲得人參皂苷含量高的優(yōu)良植物品種。
文檔編號C12N15/10GK103103194SQ20131004389
公開日2013年5月15日 申請日期2013年2月5日 優(yōu)先權日2013年2月5日
發(fā)明者羅志勇, 張儒, 祝捷, 黃景嘉, 陳湘暉, 李繼佳 申請人:中南大學