本發(fā)明屬于中藥領(lǐng)域，具體涉及五味子提取物在制備防治禽流感的藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：禽流感病毒，屬于甲型流感病毒。禽流感是人畜共患傳染病，自1878年在意大利首次暴發(fā)以來，已在世界范圍內(nèi)發(fā)生了20多次，每次暴發(fā)都造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失和社會恐慌。1997年我國香港地區(qū)首次報(bào)告發(fā)現(xiàn)禽流感病毒突破種間障礙直接感染人并致人死亡的事件。目前全世界很多國家均有禽流感病例，并有不斷擴(kuò)大的趨勢。目前用于防治禽流感病毒的西藥主要有：扎那米韋、奧司他韋(達(dá)菲)、金剛烷胺、金剛乙胺和帕拉米韋等。但是扎那米韋口服生物利用度低，臨床只有氣霧劑應(yīng)用，而無口服劑型限制了該藥物的應(yīng)用，奧司他韋易產(chǎn)生耐藥性的問題限制了其應(yīng)用，且該藥生產(chǎn)能力有限，難以應(yīng)對較大規(guī)模的禽流感疫情。金剛烷胺和金剛乙胺神經(jīng)毒副作用大，也易產(chǎn)生耐藥病毒株。帕拉米韋是國家食品藥品監(jiān)督管理局在2013年4月5日批準(zhǔn)的一種新型的流感病毒神經(jīng)氨基酸酶抑制劑，對甲型和乙型流感有效，但易產(chǎn)生耐藥病毒株，還有腹瀉、惡心、嘔吐等不良反應(yīng)。對于病毒性傳染病，抗生素、磺胺類藥物又無治療作用，因此，開發(fā)研究中藥抗病毒迫在眉睫。我國中藥資源豐富，而且中藥抗病毒效果好、價(jià)格低廉，相對于化學(xué)合成藥而言，中藥有多種有效成分，不僅具有毒性低、不易產(chǎn)生副作用、多靶點(diǎn)、病原微生物對其不易產(chǎn)生耐藥性的優(yōu)點(diǎn)，而且在抗病毒的同時(shí)，還有增強(qiáng)免疫機(jī)能，提高機(jī)體抵抗力作用。五味子，異名玄及、會及、五梅子、山花椒，為五味子科植物五味子Schisandruchinensis(Turcz)Baill.的果實(shí)。具有收斂固澀，益氣生津，寧心安神作用。主治久咳虛喘，夢遺滑精，尿頻遺尿，久瀉不止，自汗盜汗，津傷口渴，心悸失眠。迄今，尚未見有五味子防治禽流感傳染病的報(bào)道。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供五味子提取物在制備防治禽流感的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的技術(shù)問題是通過以下技術(shù)方案實(shí)施的：五味子提取物在制備防治禽流感的藥物中的應(yīng)用。前述五味子提取物包括五味子水或有機(jī)溶劑提取物或以五味子為主要活性成分的制劑。本發(fā)明五味子提取物為采用水或有機(jī)溶劑作為溶劑，所述的有機(jī)溶劑是指乙醇或甲醇。優(yōu)選采用質(zhì)量百分比濃度為50％～80％的乙醇溶液或質(zhì)量百分比濃度為65％～85％的甲醇溶液。水提取物優(yōu)選按照如下方法制備得到：取五味子，粉碎，過20目篩，按藥材重量的5～20倍加水浸泡后，煎煮1～4次，每次1～3h，合并煎煮液，脫水濃縮至稠膏狀烘干即得五味子提取物。有機(jī)溶劑提取物優(yōu)選按照如下方法制備得到：取五味子，粉碎，過20目，加入按藥材重量的5～20倍重量的50％～80％乙醇溶液(質(zhì)量百分比濃度)或65％～85％甲醇溶液(質(zhì)量百分比濃度)浸泡1～4小時(shí)后，滲漉，回收乙醇或甲醇，濃縮至稠膏狀,低溫減壓烘干，得到提取物。五味子提取物可直接粉碎制成散劑，或加入藥學(xué)上可接受的輔料，采用常規(guī)方法制成口服制劑。所述口服制劑優(yōu)選為合劑、片劑或口服液。用于患者時(shí)，本發(fā)明所述的五味子提取物劑量也可以為90mg-180mg/kg.天(以70kg體重計(jì)算)，該劑量或用量通常根據(jù)患者或使用者的年齡和體重以及身體狀況或患者的狀況來決定，優(yōu)選為100mg-130mg/kg.天。本發(fā)明的有益效果：發(fā)明人以五味子及其提取物防治禽流感，療效確實(shí)穩(wěn)定。本發(fā)明提供了五味子提取物用于制備防治禽流感傳染病的藥物中的應(yīng)用，為臨床防治禽禽流感傳染病提供了一種新的選擇。以下通過實(shí)例形式的具體實(shí)施方式，對本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。下面就本發(fā)明的臨床效果進(jìn)一步說明本發(fā)明的療效：一、五味子提取物雞胚接種抗禽流感病毒試驗(yàn)。1、藥品：(1)五味子提取物樣品1：按照實(shí)施例1方法制備得到，用生理鹽水配成每mL藥液含1g生藥的濃度。(2)五味子提取物樣品2：按照實(shí)施例2方法制備得到，用生理鹽水配成每mL藥液含1g生藥的濃度。(3)西藥對照藥品：將金剛烷胺粉劑，稀釋成0.2mg/mL溶液。2、禽流感毒株由中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒學(xué)研究所提供，雞胚尿囊液的HA效價(jià)9log2，經(jīng)測定，半數(shù)致死量為1：5000萬倍稀釋。3、SPF雞胚購自南京生物藥廠養(yǎng)殖中心。4、試驗(yàn)分組SPF雞胚50個(gè)，具體分組情況見表1。5、試驗(yàn)方法(1)藥物毒性實(shí)驗(yàn)將五味子提取物樣品1和五味子提取物樣品2分別用生理鹽水稀釋，將原液及不同濃度的藥液分別接種于3只10日齡雞胚的尿囊腔中，每只0.2mL，置37.8℃溫箱孵育72h，每天觀察存活情況，雞胚全部存活的最高藥液濃度為正式實(shí)驗(yàn)起始濃度，同時(shí)設(shè)生理鹽水對照組，藥物對雞胚毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。表1實(shí)驗(yàn)分組情況編號組別數(shù)量(枚)處理1試驗(yàn)I組10五味子樣品12試驗(yàn)II組10五味子樣品23試驗(yàn)III組10金剛烷胺4陽性對照組10接種病毒尿囊液，按試驗(yàn)量給生理鹽水5空白對照組10不接種病毒尿囊液、不給藥表2中藥對雞胚毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n＝4)*分母為接種胚數(shù)，分子為存活胚數(shù)。(2)具體方法：試驗(yàn)I組每個(gè)雞胚尿囊腔同時(shí)接種五味子提取物樣品1原液0.2mL，病毒稀釋液0.1mL。試驗(yàn)Ⅱ組每個(gè)雞胚尿囊腔同時(shí)接種五味子提取物樣品2原液0.2mL，病毒稀釋液0.1mL。試驗(yàn)III組每個(gè)雞胚尿囊腔同時(shí)接種0.2mg/mL的金剛烷胺0.2mL，病毒稀釋液0.1mL。陽性對照組每個(gè)雞胚尿囊腔同時(shí)接種生理鹽水0.2mL，病毒0.1mL。空白對照組不接種病毒，不給藥。上述雞胚在37.8℃恒溫箱中繼續(xù)孵化，每天照蛋2～3次，棄去24h內(nèi)死胚，收取24～72h死胚和72h活胚的尿囊液，低溫保存?zhèn)溆?。以血?HA)實(shí)驗(yàn)檢測雞胚尿囊液的病毒效價(jià)。(3)五味子提取物對禽流感病毒增殖的影響，結(jié)果見表3。表3五味子提取物對禽流感病毒增殖的抑制作用測定結(jié)果分組24～72h死亡胚數(shù)72h活胚數(shù)HA效價(jià)五味子提取物樣品1原液3**7**0**五味子提取物樣品2原液2**8**0**金剛烷胺1006log2*陽性對照組1009log2空白對照組0100與陽性對照組比較：*P<0.05，**P<0.01二、本發(fā)明對小白鼠感染禽流感病毒的保護(hù)作用小白鼠140只，體重18～22g，雌雄各半，隨機(jī)分為7組，每組20只?？瞻捉M，病毒對照組，金剛烷胺組(15mg/kg)，五味子提取物(按照實(shí)施例3方法制備得到)低、中、高劑量(200、400、800mg生藥/kg)組，五味子藥材組(400mg生藥/kg)，除空白組外，其余各組小白鼠以60微升禽流感病毒尿囊液滴鼻。病毒液半數(shù)致死量為血凝滴度9log2原液稀釋7倍。2h后分別給藥，空白組口服生理鹽水，病毒對照組感染病毒后口服生理鹽水，金剛烷胺組、五味子低、中、高劑量組及五味子藥材組按用量灌胃給藥。各組給藥體積為0.5mL/只，每天給藥2次，連續(xù)給藥5d。觀察至14天，記錄小白鼠的死亡數(shù)及生存時(shí)間，計(jì)算成活率及生命延長率。五味子對禽流感病毒感染小白鼠生存時(shí)間的影響，見表4。生命延長率＝(給藥組平均生存時(shí)間-病毒對照組平均生存時(shí)間)/病毒對照組平均生存時(shí)間×100％。表4五味子提取物對禽流感病毒感染小白鼠生存時(shí)間的作用與病毒對照組比較：*P<0.05，**P<0.01三、五味子對禽流感病毒感染小白鼠肺指數(shù)的影響1、分組與方法：小白鼠140只，體重18～22g，雌雄各半，隨機(jī)分為7組，每組20只?？瞻捉M，病毒對照組，金剛烷胺組(15mg/kg)，五味子(按照實(shí)施例3方法制備得到)低、中、高劑量(200、400、800mg生藥/kg)組，五味子藥材組(400mg生藥/kg)空白組、病毒對照組口服生理鹽水，金剛烷胺組、五味子低、中、高劑量組及五味子藥材組按用量灌胃給藥。各組給藥體積為0.5mL/只，每天給藥2次，連續(xù)給藥5d。各組小白鼠(空白對照組除外)給藥第二天在乙醚淺麻醉下，以60微升禽流感病毒尿囊液滴鼻，病毒尿囊液半數(shù)致死量為血凝滴度9log2原液稀釋7倍。2、指標(biāo)測定：實(shí)驗(yàn)至第6天，各組小白鼠稱重，脫頸椎處死，解剖取肺，準(zhǔn)確稱重，計(jì)算肺指數(shù)、肺指數(shù)抑制率，結(jié)果見表5。肺指數(shù)＝小白鼠肺重量/小白鼠體重肺指數(shù)抑制率＝(病毒對照組肺指數(shù)均值-治療組肺指數(shù)均值)/病毒對照組肺指數(shù)均值×100％表5五味子提取物對禽流感病毒感染小白鼠的肺指數(shù)抑制率的影響組別劑量(mg/kg)肺指數(shù)肺指數(shù)抑制率(％)空白組00.89±0.180病毒對照組02.15±0.330金剛烷胺組151.47±0.21*31.63五味子提取物低劑量組2001.67±0.31*22.32五味子提取物中劑量組4001.25±0.28**41.86五味子提取物高劑量組8001.04±0.24**51.62五味子藥材組4001.49±0.3930.69與病毒對照組比較：*P<0.05，**P<0.01四、本發(fā)明對小白鼠的急性毒性試驗(yàn)五味子提取物口服液(按實(shí)施例4方法制備得到)按9000mg/kg、12000mg/kg、15000mg/kg、18000mg/kg的劑量對小白鼠進(jìn)行灌服給藥，經(jīng)7天觀察，全部小白鼠的精神、食欲、飲水等情況和對照組比較均無異常。據(jù)此確定小白鼠服五味子1800mg/kg的劑量后，仍未出現(xiàn)中毒死亡。按毒理學(xué)評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，可不必測定半數(shù)致死量(LD50)，即LD50>15000mg/kg。結(jié)果表明，五味子提取物屬于實(shí)際無毒類物質(zhì)。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的描述：實(shí)施例1本發(fā)明提取物1的制備取五味子500g，粉碎，按藥材重量的10倍加水浸泡5h后，置煎煮罐熬1h，濾出藥液，再加藥材重量的10倍水煎1h，濾出藥液，合并兩次藥液，脫水濃縮至稠膏狀，低溫減壓烘干，共得105g提取物。實(shí)施例2本發(fā)明提取物2的制備取五味子500g，粉碎，用五味子粉末重量10倍量，質(zhì)量百分濃度為80％乙醇溶液浸泡4小時(shí)后，滲漉，回收乙醇，濃縮至稠膏狀,低溫減壓烘干,共得90g提取物。實(shí)施例3本發(fā)明口服液1的制備取五味子500g，粉碎，按藥材重量的8倍加水浸泡5h，置煎煮罐熬2h，濾出藥液，再加藥材重量的8倍水煎2h，濾出藥液，合并兩次藥液，濃縮至500mL，裝瓶，封口、滅菌即可。實(shí)施例4本發(fā)明口服液2的制備取五味子500g，粉碎，在五味子藥材重量10倍量50％乙醇溶液中浸泡4小時(shí)后，滲漉，回收乙醇，濃縮至500mL，裝瓶，封口、滅菌即可。實(shí)施例5本發(fā)明提取物3的制備取五味子500g，粉碎，用五味子粉末重量10倍量，質(zhì)量百分濃度為60％乙醇溶液浸泡4小時(shí)后，滲漉，回收乙醇，濃縮至稠膏狀,低溫減壓烘干,共得102g提取物。實(shí)施例6本發(fā)明提取物4的制備取五味子500g，粉碎，用五味子粉末重量10倍量，質(zhì)量百分濃度為85％甲醇溶液浸泡4小時(shí)后，滲漉，回收甲醇，濃縮至稠膏狀，低溫減壓烘干，共得93g提取物。實(shí)施例7本發(fā)明片劑的制備將按照實(shí)施例1方法制備得到的五味子提取物加糊精，混勻制粒，60℃烘干，過20目篩整粒，壓片。實(shí)施例8取五味子生藥材，干燥，粉碎，用蒸餾水配成每mL藥液含1g生藥的濃度。當(dāng)前第1頁1 2 3