專利名稱：具有細(xì)胞穿透性、序列特異性和核酸水解性的抗體、其制備方法及包含所述抗體的藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種具有細(xì)胞穿透能力和堿基序列特異性的核酸水解性抗體，其作為克服傳統(tǒng)SiRNA技術(shù)存在問題的新一代基因沉默技術(shù)。更特別的是，本發(fā)明涉及一種核酸水解性抗體，其通過改變無底物特異性的具有細(xì)胞穿透性、核酸水解性抗體的特定位點(diǎn)制備，而不改變抗體的核酸水解能力并賦予其序列特異性，當(dāng)其自身滲透到細(xì)胞內(nèi)或在細(xì)胞內(nèi)異位表達(dá)時(shí)，其與單鏈或雙鏈目標(biāo)核酸特異性結(jié)合并水解核酸，從而使目標(biāo)基因的表達(dá)下降。本發(fā)明同樣涉及一種該抗體的制備方法及包含該抗體的藥物組合物。
背景技術(shù)：
在分子生物學(xué)的中心法則中，主要有三類生物聚合物起重要作用DNA、RNA和蛋白質(zhì)。需要某些蛋白質(zhì)和核糖體的幫助才能將DNA轉(zhuǎn)錄為RNA。這些蛋白質(zhì)在特異位點(diǎn)與DNA結(jié)合以開始轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄得到的RNA在核糖體內(nèi)翻譯成蛋白質(zhì)。檢查蛋白質(zhì)產(chǎn)物具有哪些功能的典型方法包括從生物系統(tǒng)中去除該蛋白質(zhì)。生物體具有和不具有目標(biāo)蛋白質(zhì)所表現(xiàn)的不同解釋了該蛋白質(zhì)在生物系統(tǒng)中起的作用。然而，很難控制目標(biāo)蛋白質(zhì)在生物體內(nèi)隨意地表達(dá)水平。最近，已經(jīng)建立了各種能夠特異性識別并水解目標(biāo)RNA (包括 mRNA)特定區(qū)域的控制蛋白質(zhì)表達(dá)的以核酸為基礎(chǔ)的方法，其包括反義寡聚核苷酸、RNA干擾(RNAi)、核酶、DNA 酶等(Scherer 等，NatureBiotechnology, 21:1457-1465，2003 ； Tafech 等，Current Medical Chemistry, 13:863-881，2006)。尤其是，發(fā)現(xiàn)于 1998年的 RNA干擾，現(xiàn)在隨時(shí)可獲得，且與現(xiàn)有技術(shù)相比更容易實(shí)現(xiàn)RNA敲除(Fire A等，Nature， 391:806-811, 1998 ;Scherer 等，Nature Biotechnology, 21:1457-1465，2003)。所謂的siRNA(小分子干擾RNA)，21-23堿基長度的雙鏈(ds)RNA，是RNA干擾的核心。這些有特定序列的小分子RNA，不管其產(chǎn)生于內(nèi)部還是來自于外部轉(zhuǎn)移，能結(jié)合并水解特異性mRNA 以下調(diào)目標(biāo)蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)(稱為基因敲除)。雖然其原理的建立還不到10年，但 siRNA技術(shù)是目前在降低植物/動物細(xì)胞中蛋白質(zhì)表達(dá)水平方面應(yīng)用最廣泛的。然而，RNA 干擾的實(shí)際應(yīng)用存在幾個(gè)問題。一個(gè)典型的例子是脫靶效應(yīng)，在當(dāng)即使21堿基長度的RNA， 不能與目標(biāo)配對時(shí)發(fā)生。此外，如果siRNA與目標(biāo)只有1或2個(gè)堿基對不同時(shí)，則siRNA誘導(dǎo)的基因敲除顯著降低或不引起干擾。此外，RNA干擾可能在一靶基因的特定區(qū)域有效運(yùn)作，但在多數(shù)例子中在其他區(qū)域不工作。此外，包括不需要的免疫反應(yīng)，不恰當(dāng)?shù)募?xì)胞運(yùn)送， 核酸酶敏感性等作為siRNAs實(shí)際應(yīng)用中的抑制因子(Scherer LJ等，Nat Biotechnol, 21:1457-1465，2003 ;Tafech A 等，CurrMedChem, 13:863-881，2006)。1957年首次發(fā)現(xiàn)于系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)病人的血清中有核酸(DNA/RNA)結(jié)合抗體，其是一種自身抗體，在自身免疫性疾病的患者或小鼠中被檢測到(Robbins W等， Proc. Soc. Exp. Biol. Med.，96(3) 575-9，1957)。許多抗核酸自身抗體實(shí)際上發(fā)現(xiàn)于系統(tǒng)性紅斑狼瘡或多發(fā)性硬化癥患者中。通常，它們與缺乏序列特異性的核酸結(jié)合(Jang YJ 等·，Cell. Mol. Life Sci. , 60 (2) 309-20，2003 ；Marion TN 等，Methods 11:3-11，1997)。據(jù)報(bào)道，SLE患者和SLE小鼠模型的血清具有高濃度的抗核酸抗體，并且主要在自身免疫性疾病的患者中進(jìn)行自身抗體的研究(Dubrivskaya V等，Biochemistry (Mosc)，68(10) 1081-8，2003)。在1992年，首次發(fā)現(xiàn)了一種能夠水解核酸的核酸結(jié)合抗體(Shuster A等， Science, 256 (5057) 665-7，1992)。從那時(shí)起，生物化學(xué)研究集中于此(Nevinsky G等， J. Immunol. Methods, 269 (1-2) 235-49，2002)。因此，核酸水解抗體的研究在生物化學(xué)方面處于領(lǐng)先，但是卻仍然處于抗體工程方面的初級階段，如在各種應(yīng)用中抗體穩(wěn)定性、 親和力和特異性仍需改善(Cerutti M 等，J. Biol. Chem. , 276(16) 12769-73，2001 ； Kim YR 等，J. Biol. Chem. , 281 (22) 15287-95，2006)。多份報(bào)告中公開了抗體與核酸的結(jié)合及非抗體蛋白與核酸的結(jié)合。首先，鋅指結(jié)構(gòu)，非抗體蛋白，是自然發(fā)生的DNA結(jié)合基序的代表，如亮氨酸拉鏈和螺旋_轉(zhuǎn)角-螺旋(Jamieson A 等，Nat. Rev. Drug Discov. , 2(5) 361-8, 2003)。鋅指結(jié)構(gòu)，由大約 20-30個(gè)氨基酸殘基組成的小蛋白結(jié)構(gòu)域，使鋅離子(Zn2+)與4個(gè)不同方向的2個(gè)半胱氨酸和2個(gè)組氨酸殘基的常見組合物配位結(jié)合。作為DNA實(shí)際結(jié)合的原因，鋅指結(jié)構(gòu)的α-螺旋與DNA的大溝結(jié)合且與3個(gè)堿基相互作用。DNA三級結(jié)構(gòu)的不同取決于鋅指結(jié)構(gòu)的氨基酸序列。因此，當(dāng)α-螺旋改變但不發(fā)生構(gòu)象變化時(shí)，鋅指結(jié)構(gòu)可識別不同于之前的新堿基序列。自1999年，成功改變了 16 GNN三級結(jié)構(gòu)的特定指結(jié)構(gòu)(Segal D等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96 (6) 2758-63，1999)，開展了廣泛研究以建立改變底物特異性的方法 (Caroll D等，Nat. Protoc. 1 (3) 1329-41，2006)。因?yàn)?，它們只有結(jié)合核酸的能力，然而，改性后的鋅指結(jié)構(gòu)還需要用于與核酸水解酶結(jié)合的其他改變(Mani M.等，Biochem. Biophys. Res. Commun·，334(4)1191-7，2005)。第二種方法是一種經(jīng)驗(yàn)方法，其充分利用人乳頭狀瘤病毒(HPV) E2蛋白(E2C)的 DNA 結(jié)合域與靴 DNA 結(jié)合(M. Laura 等，J. Bio. Chem. , 276(16) 12769-73，2001)。 將DNA-E2C復(fù)合物注入小鼠，通過體細(xì)胞高頻突變產(chǎn)生抗DNA抗體。在這方面，小鼠將DNA 識別為抗原。為此，首先，DNA-蛋白(E2C)復(fù)合物通過內(nèi)部腹腔注射進(jìn)入小鼠以引起免疫反應(yīng)。當(dāng)DNA-E2C復(fù)合物在一定時(shí)間內(nèi)被重復(fù)注射以增強(qiáng)免疫應(yīng)答時(shí)，通過體細(xì)胞高頻突變產(chǎn)生了注入的DNA-E2C復(fù)合物DNA的特異性抗體。擴(kuò)增后，從小鼠中分離所產(chǎn)生的抗體。 從這些能夠與DNA特異性結(jié)合的分離物中，通過使其與目的DNA作用選擇對DNA親和性最高的抗體?！獋€(gè)合理設(shè)計(jì)提供了描述抗體與核酸結(jié)合的第三種方法。在這種方法中，使用人類Y-B-晶狀體的折疊，通過根據(jù)結(jié)構(gòu)和序列分析選擇的溶劑暴露氨基酸殘基的不規(guī)則分布，產(chǎn)生一通用的結(jié)合位點(diǎn)(Hilmar Ε.等，J. Mol. Biol. , 372:172-85，2007)。 作為一般規(guī)則，抗體被結(jié)構(gòu)性地分為閱讀框和靈活的、序列可變的CDRs (互補(bǔ)性決定區(qū))。 CDRs的靈活性允許抗體與抗原形成誘導(dǎo)契合。高特異性和親和性的另一個(gè)機(jī)理是——鎖鑰模 型。在這方面，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)已經(jīng)形成一互補(bǔ)結(jié)構(gòu)以維持與底物的高親和性，所以其能維持重要的抗體穩(wěn)定性并在結(jié)合時(shí)構(gòu)象不發(fā)生改變，因此能與底物更緊密地結(jié)合(Jackson R. 等，Protein Sci.，8:603-13，1999)。因此，蛋白質(zhì)工程和文庫篩選的近期研究趨勢從互補(bǔ)性決定區(qū)轉(zhuǎn)移到閱讀框。 實(shí)際上，首先，采用合理設(shè)計(jì)將功能性鋅結(jié)合位點(diǎn)引入到哺乳動物血清視黃醇結(jié)合蛋白3-筒(3^^1~儀1)的表面(] 111161·!!·等，Biochemistry, 33: 14126-35，1994)。其次， 源自里氏木霉CBH (纖維二糖水解酶)Cel7A的纖維素結(jié)合域的β -折疊通過突變被賦予結(jié)合活性(Lehtio J.等，Proteins: Struct. Funct. Genet. , 41:316—22，2000)。另一項(xiàng)研究是關(guān)于一由兩個(gè)反向平行的α-螺旋和一個(gè)β-轉(zhuǎn)角組成的錨蛋白重復(fù)蛋白(Binz H.等，J. Mol. Biol., 332:489-503，2003)。已知通過靶向特定基因以降低mRNA水平，從而下調(diào)編碼的蛋白質(zhì)表達(dá)的基因沉默是基因功能分析的極為重要工具和包括癌癥和病毒感染的人類疾病的有力的治療策略。傳統(tǒng)的基因沉默技術(shù)通常是基于核酸與單鏈核酸互補(bǔ)以抑制mRNA的翻譯的能力 (Scherer LJ 等，Nat Biotechnol, 21:1457-65，2003 ；Tafech A 等，Cur r Med Chem, 13:863-81，2006)。其中包括代表性的siRNA(小分子干擾RNA)。然而，siRNA具有缺少細(xì)胞穿透性的缺點(diǎn)，由于RNA酶的敏感性造成的低穩(wěn)定性，可能產(chǎn)生脫靶，導(dǎo)致免疫原性。如上所述，傳統(tǒng)的基因沉默技術(shù)如應(yīng)用SiRNA能引起特定基因在表達(dá)水平的下降，但是需要能夠水解核酸的其它的改性，以這種方式，其與核酸酶水解酶共軛。目前銷售的藥物和當(dāng)前研究下的藥物開發(fā)是以小分子，蛋白質(zhì)和單克隆抗體為基礎(chǔ)的。大多數(shù)被設(shè)計(jì)為能與可被控制活性而引起藥效的蛋白質(zhì)結(jié)合。尤其是，幾乎所有的單克隆抗體和蛋白都靶向膜蛋白或胞外蛋白。盡管許多不同的基因與多種疾病相關(guān)，但迄今為止藥物開發(fā)一直關(guān)注于靶向蛋白，產(chǎn)生數(shù)量非常有限的藥物。如果開發(fā)的藥物可在RNA 或DNA水平控制疾病，而不是蛋白質(zhì)水平，其能夠靶向胞內(nèi)RNA或DNA，可覆蓋更廣泛的疾病。此外，能夠滲透進(jìn)入細(xì)胞并識別特定堿基序列的核酸酶水解抗體極有可能發(fā)展為下一代基因沉默和抗病毒因子。因此，需要無外部蛋白運(yùn)輸系統(tǒng)時(shí)自身能夠滲透進(jìn)入細(xì)胞的抗體，且能與特定序列的單鏈/雙鏈靶核酸特異性結(jié)合并使其水解。發(fā)明內(nèi)容技術(shù)問題
本發(fā)明進(jìn)行了關(guān)于基因沉默的密集和深入的研究，以克服現(xiàn)有技術(shù)所遇到的問題為目標(biāo)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了一種無底物特異性的細(xì)胞穿透性、核酸水解性抗體可通過改變特異位點(diǎn)而被賦予單鏈或雙鏈目標(biāo)的特異性且不改變其核酸水解性，當(dāng)改性的抗體自身滲透進(jìn)入細(xì)胞或在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)時(shí)，可與單鏈或雙鏈核酸目標(biāo)特異性結(jié)合并使其水解，因此使特定基因的表達(dá)下調(diào)。解決方案
因此，本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種能夠滲透進(jìn)入細(xì)胞，與特定堿基序列的單鏈或雙鏈核酸靶標(biāo)特異性結(jié)合并使其水解的核酸水解性抗體。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一制備該核酸水解性抗體的方法。本發(fā)明的再一個(gè)目的在于提供一包括該核酸水解性抗體的藥物組合物。


圖1示意地示出了根據(jù)本發(fā)明的核酸水解性抗體(A)和特定堿基序列的單鏈或雙鏈目標(biāo)核酸的水解(B)。圖2是一過程示意圖，其中，具有本發(fā)明序列特異性的核酸水解性抗體通過細(xì)胞滲透移位進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)或通過轉(zhuǎn)染細(xì)胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)后，特異性識別并水解由外源物質(zhì)(例如，病毒)攜帶的外源性靶基因或內(nèi)源性靶mRNA，從而抑制病毒增殖或蛋白表達(dá)圖3示出了 3D8 VL的三級結(jié)構(gòu)(A)及(3-(4廣45位殘基)，(’-(50 54位殘基)和 f-β-鏈(9(Γ94位殘基)的氨基酸序列和堿基序列，其構(gòu)成野生型3D8 VL的推定的DNA/ RNA識別位點(diǎn)和用于突變的NNB密碼子(B)。圖4示出了基于3D8 VL 4Μ模板的核酸水解性抗體文庫的構(gòu)建㈧，通過電穿孔與酵母顯示載體(pCTCON)共轉(zhuǎn)化后該文庫在酵母細(xì)胞表面的表達(dá)(B)，以及該文庫表達(dá)水平的流式細(xì)胞儀分析(C)。圖5示出了分離優(yōu)先與來自酵母表面3D8 VL文庫的兩個(gè)單鏈DNA目標(biāo)底物G18 (A) 和Herf18 (B)結(jié)合的3D8 VL變體的代表性篩選程序。圖6示出了 3D8 VL野生型和通過18個(gè)堿基的目的單鏈DNA，G18 (4MG1-4MG6)禾口 Her218 (4MH1-4MH5)選擇的3D8 VL 4M變體的氨基酸序列比對，重點(diǎn)在于c_ (4廣45位殘基)，C’ - (50 54位殘基)和f-β -鏈(90 94位殘基)的15個(gè)隨機(jī)位置。圖7示出了純化的11個(gè)變體的SDS-PAGE分析數(shù)據(jù)(A)，及代表性變體(4MG3、 4MG5、4MH2)與3D8 VL野生型和4M相比的體積排阻HPLC (B)和遠(yuǎn)紫外⑶(圓形二色性) 光譜(C)。圖8示出了用于分析11個(gè)變體的DNA水解活性(A)和4MG3、4MG5和4MH2的RNA 水解活性(B)的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果。圖9 示出了作為 16nM 2μ M FRET 底物(A18, T18，C18，(G4T)3G3、Her218、N18)的濃度函數(shù)的3D8 VL野生型和3D8 VL 4M及其變體(4MG3、4MG5、4MH2)的酶動力學(xué)繪制圖。圖10示出了用于細(xì)胞內(nèi)表達(dá)3D8 VL野生型和其變體(4MG3、4MG5)的質(zhì)粒示意圖，(A, pcDNA3. 1)，GFP (B, pEGFP-Nl)，GFP (C，G18 在 pG18_EGFP 中位于 EGFP 的 N-末端上游)，和EGFP (D，Her218在pHer218_EGFP中位于EGFP的N-末端上游)。圖11示出了選定的3D8 VL變體的靶標(biāo)基因沉默活性，其在HeLa細(xì)胞中與攜帶 EGFP的靶序列異位共表達(dá)。HeLa細(xì)胞是未轉(zhuǎn)染的或由編碼質(zhì)粒的EGFP(完整EGFP，G18-EGFP 或Herf18-EGFP )單獨(dú)轉(zhuǎn)染或與編碼3D8 VLs(野生型，G18-選擇性4MG3和4MG5，及Her218-選擇性4MH2)的質(zhì)粒一起轉(zhuǎn)染，如上所述，然后通過流式細(xì)胞儀(A)，共聚焦熒光顯微鏡(B)， 免疫印跡(C，D)和RT-PCR (E，F(xiàn))監(jiān)測EGFP表達(dá)。圖12示出了 Her2基因表達(dá)上的Her218堿基序列特異性，核酸水解性4MH2在HeLa 細(xì)胞中的效果，其通過RT-PCR (A)進(jìn)行mRNA水平分析，并通過免疫印跡(B)進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)水平分析。圖13示出了說明3D8 VL變體滲透進(jìn)入活細(xì)胞并主要定位于細(xì)胞質(zhì)中的數(shù)據(jù)。(A) 野生型3D8 ￥1^和其變體(41^3、41^5、41^2)細(xì)胞內(nèi)化進(jìn)入人宮頸癌細(xì)胞(HeLa細(xì)胞)和人乳腺癌細(xì)胞(SK-BR3)的流式細(xì)胞儀數(shù)據(jù)?；?徹1^細(xì)胞中308 VLs內(nèi)化和亞細(xì)胞定位的共聚焦熒光顯微鏡。(C)分析可溶肝素或?qū)σ吧?D8 VL和其變體(4MG3、4MG5、4MH2)的細(xì)胞攝取特異性內(nèi)吞作用抑制劑的預(yù)處理效果的流式細(xì)胞儀數(shù)據(jù)。圖14示出了細(xì)胞穿透性3D8 VL變體在HeLa細(xì)胞中表達(dá)外源靶標(biāo)基因中的靶標(biāo)基因沉默活性。HeLa細(xì)胞是未轉(zhuǎn)染的或由編碼EGFP或G18-EGFP的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的，為未處理的或由野生型3D8 VL及G18-選擇性4MG3和4MG5處理的，且通過流式細(xì)胞儀(A)，RT-PCR(B)和免疫印跡(C)分析。Her2-陰性HeLa細(xì)胞是未轉(zhuǎn)染的或由編碼全長Her2基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，為未處理的或由3D8 VL野生型及Her218-選擇性4MG2處理的。Her2表達(dá)通過RT-PCR (D)和免疫印跡(E)分析。圖15示出了通過MTT法(A)和流式細(xì)胞儀(B)分析用Her218特異性4MH2變體處理的Her2-過表達(dá)人類乳腺癌細(xì)胞(SK-BR-3，MDA-MB-231)或Her2-陰性人類宮頸癌細(xì)胞 (HeLa細(xì)胞)的存活率。圖16示出了細(xì)胞穿透性Her218_選擇性4MH2敲除Her2_過表達(dá)SK-BR-3細(xì)胞中的內(nèi)源性Her2表達(dá)。Her2表達(dá)通過流式細(xì)胞儀在細(xì)胞表面監(jiān)測(A)，通過RT-PCR在mRNA 水平監(jiān)測(B)，并通過免疫印跡在蛋白質(zhì)水平監(jiān)測(C)。實(shí)施本發(fā)明的最佳模式
根據(jù)其中一個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種核酸水解性抗體，其具有細(xì) 胞穿透性，且能特異性結(jié)合并水解特定堿基序列的單鏈或雙鏈的靶核酸。根據(jù)其中另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種制備細(xì)胞穿透性、序列特異性和核酸水解性抗體的方法，其包括
1)構(gòu)建缺失底物特異性的細(xì)胞穿透性核酸水解性抗體模板的基因文庫；
2)通過表面顯示載體在細(xì)胞表面表達(dá)步驟1)構(gòu)建的基因文庫，以產(chǎn)生蛋白質(zhì)文庫；且
3)從步驟2)表達(dá)的蛋白質(zhì)文庫選擇能與特定堿基序列的核酸目標(biāo)特異性結(jié)合的變體。根據(jù)其中另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及一包括核酸水解性抗體的藥物組合物。以下，將對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)敘述。通過改變具有細(xì)胞穿透性但無底物特異性的核酸水解性抗體的特定區(qū)域作為抗體工程構(gòu)建的結(jié)果，根據(jù)本發(fā)明的核酸水解性抗體被進(jìn)一步賦予序列特異性。當(dāng)其滲透進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)或在胞內(nèi)表達(dá)時(shí)，本發(fā)明的核酸水解性抗體能夠特異性結(jié)合并水解特定堿基序列的單鏈或雙鏈核酸目標(biāo)以使特定基因的表達(dá)下調(diào)。本發(fā)明設(shè)計(jì)的核酸水解性抗體具有SEQ ID NOS 14 24的氨基酸序列，優(yōu)選為SEQ ID N0S:16、18和21。本發(fā)明核酸水解性抗體的堿基序列代表為SEQ ID N0S:25 35，優(yōu)選為 SEQ ID NOS :27、29 和 32。本發(fā)明的核酸水解性抗體可以是全部片段或是一個(gè)功能性片段。整個(gè)抗體可是一個(gè)單體或兩個(gè)或多個(gè)完整抗體相互結(jié)合成的多聚體，且包括整個(gè)IgG。本文中使用的關(guān)于抗體的術(shù)語“功能片段”意指具有重鏈可變區(qū)域和輕鏈可變區(qū)域的抗體片段，抗體片段可如整個(gè)抗體一樣，識別大致相同的抗原表位?？贵w功能片段的例子包括重鏈可變區(qū)域的單結(jié)構(gòu)域、輕鏈可變區(qū)域的單結(jié)構(gòu)域、單鏈可變片段(scFv)、(ScFv)2, Fab、Fab'、F(ab’)2、雙鏈抗體和二硫鍵穩(wěn)定可變片段(dsFv)，但不局限于此，優(yōu)選為輕鏈可變區(qū)域的單鏈區(qū)域。參照圖1，本發(fā)明的核酸水解性抗體示意圖說明其樣式(A)及特定堿基序列的單鏈或雙鏈靶標(biāo)核酸的水解(B)。參照圖2，顯示了一過程示意圖，其中，具有本發(fā)明序列特異性的核酸水解性抗體通過細(xì)胞滲透移位進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)或通過轉(zhuǎn)染細(xì)胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)后，可特異性識別并水解由外源物質(zhì)(例如，病毒)攜帶的外源靶基因或內(nèi)源性靶mRNA，從而抑制病毒增殖或蛋白表達(dá)。接下來，轉(zhuǎn)向制備本發(fā)明的核酸水解性抗體的方法，如下以循序漸進(jìn)的方式對其進(jìn)行描述。
步驟1)是使用缺乏序列特異性的細(xì)胞穿透性、核酸水解性抗體作為模板合成一基因文庫。因?yàn)樵摽贵w能滲透進(jìn)入細(xì)胞并水解核酸，但缺乏序列特異性，優(yōu)選為3D8 VL 4M或其變體。3D8 VL的結(jié)構(gòu)分析允許由c-，c’-和f-β-鏈組成的推定的核酸結(jié)合位點(diǎn)。這個(gè)推定的結(jié)合位點(diǎn)由簡并NNB密碼子(N=A/T/C/G，B=C/G/T)隨機(jī)組合，在酵母細(xì)胞表面構(gòu)建所有殘基的突變庫。步驟2)是在細(xì)胞表面構(gòu)建文庫。擴(kuò)增的3D8 VL基因通過電穿孔與顯示載體共轉(zhuǎn)化以在酵母細(xì)胞表面構(gòu)建3D8 VL文庫。本發(fā)明中使用的顯示載體的例子包括噬菌體顯示載體、細(xì)菌顯示載體、核糖體顯示載體、RNA顯示載體和酵母細(xì)胞顯示載體，但不局限于此。 在本發(fā)明中，用酵母顯示載體構(gòu)建文庫。文庫可在酵母細(xì)胞表面很好地表達(dá)。 在步驟3)中，3D8 VL 4M抗體文庫被靶標(biāo)核酸序列篩選以選擇可特異性結(jié)合的3D8 VL變體。在這方面，用5’-生物素化的靶標(biāo)核酸分析抗體的特異親和性。靶標(biāo)核酸可是內(nèi)源性或外源性的。優(yōu)選地，內(nèi)源性核酸可為編碼在癌細(xì)胞中過度特定反應(yīng)的蛋白質(zhì)。優(yōu)選的外源性核酸為病毒基因組核酸或編碼病毒蛋白的核酸。更詳細(xì)地，抗體庫由5’-生物素化的靶標(biāo)DNA (G18，，Herf18)篩選，在此期間通過磁性細(xì)胞分選和流式細(xì)胞儀分析其相比較于非靶標(biāo)核酸與各自靶標(biāo)(G18,，Herf18)的親和力。在分析的基礎(chǔ)上，選擇與靶標(biāo)(G18,， Her218)特異性強(qiáng)的變體。結(jié)果，六個(gè)變體，4MG1、4MG2、4MG3、4MG4、4MG5和4MG6被選擇用于單鏈0嫩靶標(biāo)(618)，然而據(jù)觀察，5個(gè)變體，41^1、41^2、41^3、41^4和4MH5與單鏈DNA靶標(biāo) (Herf18)有較強(qiáng)親和力?？偣策@11個(gè)變體分別具有SEQ ID NOS :14 24的氨基酸序列，優(yōu)選為SEQ ID NOS 16 (4MG3)，18 (4MG5)和21 (4MH2)。相應(yīng)地，11個(gè)變體的堿基序列分別代表為 SEQ ID N0S:25 35。因此，優(yōu)選為 SEQ ID NOS 27 (4MG3), 29 (4MG5)禾口 32 (4MH2)。選擇的變體被純化，純度大于90%，以具有二級結(jié)構(gòu)的可溶解的單體存在。而且，相比較于非靶標(biāo)，3D8 VL變體對于各自的靶標(biāo)底物顯現(xiàn)出10-100倍大的KD，4MH2對于Her218及4MG3 和4MG5對于G18，因?yàn)閷τ诎袠?biāo)底物其親和力大幅增加，但對于非靶標(biāo)其保持不變。此外， 與3D8 VL野生型和3D8 VL 4M相比，變異的抗體表現(xiàn)為底物降解率具有更高的Vmax值，更快的識別、特異性結(jié)合并水解靶標(biāo)核酸序列。因此，根據(jù)本發(fā)明的變體可適應(yīng)于具有序列特異性并保留了水解DNA和RNA的能力。無G18或Herf18靶標(biāo)序列的EGFP (增強(qiáng)型綠色熒光蛋白)的表達(dá)水平既不受本發(fā)明變體的影響，也不受3D8 VL野生型的影響。同時(shí)，細(xì)胞與攜帶本發(fā)明3D8 VL變體的載體和攜帶N-末端有G18或Herf18靶標(biāo)序列的載體一起共轉(zhuǎn)染比與3D8 VL野生型共轉(zhuǎn)染表達(dá)的EGFP信號低得多。強(qiáng)烈建議在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的變體水解攜帶靶標(biāo)序列的mRNA，如G18-EGFP mRNA和Her218-EGFP mRNA，從而降低GFP的表達(dá)水平。當(dāng)在胞內(nèi)表達(dá)時(shí)，突變?yōu)榭勺R別靶標(biāo)堿基序列的核酸水解性抗體能水解包含靶標(biāo)堿基序列的mRNA，從而下調(diào)由mRNA編碼的蛋白質(zhì)的表達(dá)。本發(fā)明的變體已被證明當(dāng)其在胞內(nèi)移位表達(dá)時(shí)，具有序列特異性和核酸水解活性。此外，本發(fā)明的變體被發(fā)現(xiàn)可滲透進(jìn)入人類宮頸癌細(xì)胞(HeLa)和人類乳腺癌細(xì)胞(SK-BR3)，某種程度類上似于3D8 VL野生型。變體內(nèi)化進(jìn)入細(xì)胞繼續(xù)行進(jìn)到氯丙嗪預(yù)處理細(xì)胞抑制網(wǎng)格蛋白依賴型內(nèi)吞作用和細(xì)胞松弛素D預(yù)處理細(xì)胞抑制大胞飲作用 (macropinocytosis)相似的程度。相反地，變體的細(xì)胞穿透能力因?yàn)閹д姾傻淖凅w和帶負(fù)電荷的細(xì)胞表面蛋白多糖(硫酸乙酰肝素)的電相互作用的干擾在具有肝素預(yù)處理的細(xì)胞上顯著降低，或因?yàn)橐种菩「C/脂筏內(nèi)吞作用在甲基-β-環(huán)糊精(MiiCD)預(yù)處理的細(xì)胞上顯著降低，證明變體是通過小窩/脂筏內(nèi)吞途徑進(jìn)入細(xì)胞，并與細(xì)胞表面豐富的蛋白多糖發(fā)生電相互作用。此外，根據(jù)本發(fā)明的變體顯示了對于人類乳腺癌細(xì)胞(SK-BR3，MDA_MB_231)或人類宮頸癌細(xì)胞(HeLa)的低細(xì)胞毒性。尤其是，Her2_過表達(dá)SK-BR-3 或MDA-MB-231細(xì)胞的存活率由于帶有Her2序列特異性的核酸水解性4MH2的強(qiáng)細(xì)胞毒性而顯著降低。該結(jié)果歸因于4MH2下調(diào)Her2表達(dá)，與以前的認(rèn)為隨著Her2表達(dá)的下降Her2_過表達(dá)細(xì)胞存活率降低的報(bào)告相一致。此時(shí)，觀察到細(xì)胞死亡顯示出凋亡模式(陽性膜聯(lián)蛋白V)。如上所述，根據(jù)本發(fā)明的核酸水解性抗體通過改變無底物特異性的細(xì)胞穿透性、 核酸水解性抗體的特定位點(diǎn)制備，賦予其序列特異性且不改變其核酸水解能力。當(dāng)該設(shè)計(jì)的核酸水解性抗體自身滲透進(jìn)入細(xì)胞或在胞內(nèi)表達(dá)時(shí)，其與單鏈或雙鏈核酸靶標(biāo)特異性結(jié)合并將其水解，從而下調(diào)特定基因的表達(dá)。因此，根據(jù)本發(fā)明的核酸水解性抗體可是如 siRNA傳統(tǒng)基因沉默技術(shù)的另一選擇或替代技術(shù)。尤其是，本發(fā)明的核酸水解性抗體能下調(diào)靶標(biāo)蛋白的表達(dá)或通過特異性結(jié)合并水解RNA或DNA下調(diào)靶標(biāo)基因組在RNA或DNA水平的增殖，但不在蛋白質(zhì)水平上，所以可用于癌癥或病毒疾病的治療。因此，本發(fā)明的核酸水解性抗體可開發(fā)為新的帶有進(jìn)入市場預(yù)期的抗癌藥物或抗病毒藥物。根據(jù)其另一方面，本發(fā)明涉及一藥物組合物，其包括單獨(dú)的作為一種活性成分的本發(fā)明核酸水解性抗體或包括該抗體與至少一種傳統(tǒng)抗癌或抗病毒成分的組合。用于實(shí)際給藥中，除了活性成分之外，該藥物組合為可能包括至少一種藥物學(xué)上可接受的賦形劑。藥物學(xué)上可接受的賦形劑的例子包括生理鹽水、無菌水、林格氏液、緩沖鹽水、葡萄糖溶液、麥芽糊精溶液、甘油、乙醇等?？蛇x地，其他典型的添加劑，如抗氧化劑、 緩沖劑、抑菌劑等可加入本發(fā)明的藥物組合物?？墒褂孟♂寗?、分散劑、表面活性劑、粘合劑和/或潤滑油將該組合物配制成如水溶液、懸浮液、乳化液等注射液、丸劑、膠囊、顆?；蚱RU。此外，該組合物可根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法或雷明頓藥物科學(xué)(最新的)(Mack出版公司， Easton PA)上公開的方法配制成合適的劑型。本發(fā)明的組合物可為口服地或非口服地(靜脈、皮下、內(nèi)腹部或局部)給藥。其劑量根據(jù)病人的體重、年齡、性別、健康狀況和飲食，給藥時(shí)間，給藥途徑，排泄率，疾病嚴(yán)重程度等變化。核酸水解性抗體的日給藥量約為0.0廣10mg/kg，優(yōu)選為日劑量為廣5mg/kg，一天一次或多次給藥。為了抑制致病蛋白的表達(dá)或病毒基因的增殖，本發(fā)明的組合物可單獨(dú)使用或與手術(shù)、荷爾蒙治療、化學(xué)治療或生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑相結(jié)合。
具體實(shí)施例方式將通過以下用于說明的實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行更好的理解，但其并不旨在限制本發(fā)明。實(shí)施例1 3D8 VL 4M抗體的設(shè)計(jì)
1. 3D8 VL 4M抗體在酵母細(xì)胞表面的表達(dá)
將3D8 VL抗體設(shè)計(jì)為序列特異性，核酸水解性抗體的第一步是在酵母細(xì)胞表面顯示該抗體。該抗體為3D8 VL 4M，其與野生型(WT)相比，具有更好的DNA/RNA水解活性。3D8VL 4M具有4個(gè)突變體一Q52R、Y55H、W56R和H100A。為了能夠在酵母細(xì)胞表面表達(dá)3D8 VL 4M抗體，將3D8 VL 4M基因從大腸桿菌表達(dá)載體pET23M 3D8 VL 4M亞克隆進(jìn)入酵母細(xì)胞表面顯示載體PCTC0N。為了擴(kuò)增3D8 VL4M基因，設(shè)計(jì)了具有Nhel/BamHI識別位點(diǎn)的引物對。通過堿基測序分析確定PCTCON中的3D8 VL 4M基因的準(zhǔn)確插入，接著將重組載體轉(zhuǎn)化到釀酒酵母EBY100。轉(zhuǎn)化的菌落在選擇性SD-CAA培養(yǎng)基(20g/L葡萄糖，6. 7g/L無氨基酸的酵母氮基，5. 4g/L Na2HPO4,8. 6g/L NaH2PO4 -H2O, 5g/L酪蛋氨基酸)中在30°C下振蕩培養(yǎng) 20小時(shí)。通過在選擇性SG-CAA培養(yǎng)基(20g/L葡萄糖，6. 7g/L無氨基酸的酵母氮基，5. 4g/ L Na2HPO4,8. 6g/L NaH2PO4 · H2O, 5g/L酪蛋氨基酸)中30°C下振蕩培養(yǎng)20小時(shí)完成蛋白質(zhì)的表達(dá)。使用FACS測定目標(biāo)蛋白質(zhì)的細(xì)胞表面表達(dá)。通過檢測C端myc標(biāo)簽?zāi)軌蜃R別酵母細(xì)胞表面的3D8 VL 4M表達(dá)。使用抗-myc9E10抗體(Sigma，USA)作為初級抗體和FITC 標(biāo)記的羊抗鼠IgG (Sigma, USA)作為第二抗體對該表達(dá)進(jìn)行定性和定量分析，該第二抗體用于識別初級抗體的恒定區(qū)。為了確定細(xì)胞表面表達(dá)和3D8 VL文庫的目標(biāo)底物結(jié)合水平， 大約有2xl06酵母細(xì)胞用生物素標(biāo)記的核酸在50 μ LTris緩沖液(25mM Tris, 137mM NaCl, 2. 7mM KCl，0. 1% BSA)被處理，然后用抗myc抗體處理，并用Tris緩沖液洗滌，用FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG標(biāo)記。在BD FACS Calibur (Becton Dickinson, USA)上進(jìn)行定量分析，其示出了在酵母細(xì)胞表面有高表達(dá)水平的3D8 VL 4M。模式序列的選擇
選擇一模式序列用于將3D8 VL 4M抗體修飾進(jìn)入一有序列特異性的變體中。在1中使用的生物素化核酸用作模式序列。相應(yīng)的序列為人類表皮生長因子_2 (Her2/ErbB2)，其已知在乳腺癌細(xì)胞中過表達(dá)并且因此與癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移有關(guān)。在整個(gè)Her2序列中，只有18個(gè)殘基，對應(yīng)的位置為2391-2408，確定為5’-AAT TCC AGT GGC CAT CAA-3’，這些被用于抗體工程，并且被稱為Her218。另一個(gè)模式序列，稱為G18，確定為5’-GGG GGG GGG GGG GGG GGG-3’，其也被用于模式目標(biāo)底物中。3D8 VL野生型和3D8 VL 4M的氨基酸序列分別為SEQ ID NOS :1和2。它們各自相應(yīng)的堿基序列分別用SEQ ID NOS 3和4表示。實(shí)施例2: 3D8 VL 4M抗體文庫的構(gòu)建
觀察到3D8 VL 4M在酵母細(xì)胞表面高水平表達(dá)之后，構(gòu)建3D8 VL 4M文庫。為了產(chǎn)生能夠特異性的結(jié)合并水解特定堿基序列的變體，文庫基于3D8 VL 4M的模板進(jìn)行構(gòu)建。首先，分析3D8 VL的結(jié)構(gòu)以確定由c-，c’-和f-β-鏈構(gòu)成的推定的核酸結(jié)合位點(diǎn)。設(shè)計(jì)其可以隨機(jī)地在c_(4廣45位殘基)，c’_ (50 54位殘基)和f-β-鏈(90 94位殘基)用簡并 NNB密碼子(N=A/T/C/G，B=C/G/T)靶定突變體殘基以在酵母細(xì)胞表面產(chǎn)生文庫。因?yàn)?D8 VL并不是所有的殘基都突變，使用4M作為模板和突變引物(其某些殘基突變)進(jìn)行重疊PCR 構(gòu)建酵母表面顯示的基因文庫。用于文庫構(gòu)建的引物(明、21 、31 、4 、51 、6 、710的堿基序列分別為SEQ ID NOS :5 11。在NNB密碼子中，N代表等摩爾的A、T、C和G (各25%)的核酸混合物，B代表等摩爾C、G和T的核酸混合物(各33%)。NNB密碼子是所有20種具有2. 1% 比率終止密碼子的氨基酸密碼子的組合。擴(kuò)增的文庫與酵母表面顯示載體一起通過同源重組轉(zhuǎn)化到酵母細(xì)胞中。為此，使用電穿孔技術(shù)將擴(kuò)增的基因組文庫(10 yg/mL)和酵母表面顯示載體(pCTCON，Colby等， Methods enzymol, 388:248-258) (1 μ g/mL)引入酵母細(xì)胞中以在酵母細(xì)胞表面顯示文庫(Lee HW 等，Biochem Biophys Res Communj 343:896-903，2006 ；Kim YS 等，Proteins: structure, function, and bioinformatics，62:1026-1035，2006)。文庫基因以總量 300 μ g制備，同時(shí)使用載體的量為30 μ g。通過在選擇性瓊脂平板上將連續(xù)稀釋轉(zhuǎn)化的細(xì)胞倒平板，測定的3D8 VL 4M文庫大小約為2X108。使用FACS定量分析文庫的表達(dá)。因?yàn)槿魏卧跇?gòu)建中發(fā)生的問題都不允許文庫基因的正常表達(dá)。FACS分析同樣也可以用于檢測是否正確構(gòu)建文庫。圖3示出了 3D8 VL (A)的三級結(jié)構(gòu)和氨基酸序列以及c_ (4廣45位殘基)，C’ -(50 54位殘基)和f-β-鏈(90 94位殘基)的堿基序列，其構(gòu)成了 3D8 VL野生型的推定的DNA/RNA識別位點(diǎn)和用于突變體⑶的NNB密碼子。參照圖4，以下的示意圖示出了 3D8 VL 4M (A)的模板上核酸水解性抗體的文 庫構(gòu)建，在通過電穿孔(B)將酵母顯示載體共轉(zhuǎn)移和用FACS (分析文庫的表達(dá)水平(C)之后進(jìn)行酵母細(xì)胞表面的文庫表達(dá)。在構(gòu)建體文庫中的突變體頻率如下表1所示 [表1]
權(quán)利要求
1.一種核酸水解性抗體，其能夠滲透進(jìn)入細(xì)胞并特異性結(jié)合特定堿基序列的單鏈或雙鏈核酸靶標(biāo)，且水解該靶標(biāo)核酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸水解性抗體，其中靶標(biāo)為G18或Her218。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的核酸水解性抗體，其中G18具有SEQID N0:12的堿基序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的核酸水解性抗體，其中Herf18具有SEQID NO 13的堿基序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸水解性抗體，其中抗體具有從包括SEQID NOS 14 24 氨基酸序列的組中選擇的氨基酸序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的核酸水解性抗體，其中抗體具有從包括SEQID N0S:25 35堿基序列的組中選擇的堿基序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸水解性抗體，其中抗體選自下組中的一個(gè)完整的IgG、 重鏈可變區(qū)域的單結(jié)構(gòu)域、輕鏈可變區(qū)域的單結(jié)構(gòu)域、單鏈可變片段(scFv)、(ScFV)2、Fab、 Fab，、F(ab，)2、雙鏈抗體和dsFv及其組合。
8.一制備權(quán)利要求1中所述核酸水解性抗體的方法，包括1)構(gòu)建一沒有底物特異性的細(xì)胞穿透性、核酸水解性抗體的模板的基因文庫；2)通過使用表面顯示載體在細(xì)胞表面表達(dá)步驟1)中構(gòu)建的基因文庫以生成蛋白質(zhì)文庫；3)從步驟2)中表達(dá)的蛋白質(zhì)文庫中選擇能特異性結(jié)合特定堿基序列的核酸靶標(biāo)的變體。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中沒有底物特異性的細(xì)胞穿透性、核酸水解性抗體是從包括一完整的IgG，重鏈可變區(qū)域的單結(jié)構(gòu)域，輕鏈可變區(qū)域的單結(jié)構(gòu)域，單鏈可變片段(scFv)，(scFv) 2，F(xiàn)ab, Fab'，F(xiàn) (ab，)2，雙鏈抗體和dsFv及其組合的組中選擇的。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中沒有底物特異性的細(xì)胞穿透性、核酸水解性抗體是3D8 VL 4M或其變體。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中3D8VL 4M是以這樣的方式突變的，包括θα 廣 45 位殘基 )， c’- (50 54位殘基)和f-β-鏈(90 94位殘基)的3D8 VL的DNA/RNA 結(jié)合位點(diǎn)用NNB密碼子(N=A/T/C/G，B=C/G/T)隨機(jī)組合。
12.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中步驟2)中的表面顯示載體是從包括噬菌體顯示載體、細(xì)菌顯示載體、核糖體顯示載體、RNA顯示載體和酵母細(xì)胞顯示載體及其組合的組中選擇的。
13.據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中步驟3)中的核酸靶標(biāo)是內(nèi)源性核酸或外源性核酸。
14..據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中內(nèi)源性核酸是編碼在癌細(xì)胞中特異性過表達(dá)的蛋白質(zhì)的核酸。
15.據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中外源性核酸是病毒基因組核酸或編碼病毒蛋白的核酸。
16.一種預(yù)防或治療癌癥的組合物，其包括權(quán)利要求1中所述的核酸水解性抗體作為活性成分。
17.一種預(yù)防或治療病毒增殖的組合物，其包括權(quán)利要求1中所述的核酸水解性抗體作為活性成分。
全文摘要
公開了一具有細(xì)胞穿透性，堿基序列特異性和核酸水解性的抗體、其制備方法及包含所述抗體的藥物組合物。所述抗體可通過改變無底物特異性的細(xì)胞穿透性，核酸水解性抗體的特定位點(diǎn)制備，不改變抗體的核酸水解能力并賦予其序列特異性。當(dāng)該抗體自身滲透到細(xì)胞內(nèi)或在細(xì)胞內(nèi)異位表達(dá)時(shí)，其與單鏈或雙鏈目標(biāo)核酸特異性結(jié)合并水解核酸，因此下調(diào)了目標(biāo)基因的表達(dá)。
文檔編號C07K16/28GK102209726SQ200980144976
公開日2011年10月5日 申請日期2009年11月11日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月11日
發(fā)明者權(quán)明姬, 李又覽, 金容星 申請人:亞州大學(xué)校產(chǎn)學(xué)協(xié)力團(tuán)