專利名稱：：外切特異性的淀粉酶多肽、編碼那些多肽的核酸及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及淀粉酶多肽和編碼所述多肽的核酸及其應(yīng)用。本發(fā)明的淀粉酶被設(shè)計(jì)為，具有更多的有益性質(zhì)。具體來說，本發(fā)明的淀粉酶顯示了改變的外切特異性(exospecifity)。
背景技術(shù)：
：改進(jìn)的淀粉酶可以改善在某些過程如烘焙中的內(nèi)在問題。在烘焙后數(shù)天，在淀粉顆粒中發(fā)生支鏈淀粉的結(jié)晶，這導(dǎo)致面包的堅(jiān)硬性增加，并引起面包變得不新鮮(staling)。當(dāng)面包不新鮮時(shí)，面包喪失了面包屑(crumb)的軟度和面包屑的濕度。結(jié)果是，面包屑變得彈性降低，面包變?yōu)閳?jiān)韌的干面包片。支鏈淀粉側(cè)鏈的酶促水解(例如，通過淀粉酶)可以減少結(jié)晶并增強(qiáng)保鮮能力。結(jié)晶取決于支鏈淀粉側(cè)鏈的長度側(cè)鏈越長，結(jié)晶越多。大多數(shù)淀粉顆粒是由兩種聚合物的混合物組成的支鏈淀粉和直鏈淀粉，其中大約75%是支鏈淀粉。支鏈淀粉是非常大的分支的分子，由通過(l-4)鍵連接的(x-D-吡喃葡萄糖基單位構(gòu)成的鏈組成，其中鏈通過a-(l-6)鍵進(jìn)行連接，從而形成分支。直鏈淀粉是(l-4)鍵接的a-D-吡喃葡萄糖基單位構(gòu)成的線性鏈，幾乎不帶有oc-(l-6)分支。烘焙含淀粉面包產(chǎn)品如白面包、由篩選的黑麥粉和小麥粉制成的面包以及面包巻，是通過烘焙面團(tuán)完成的，爐溫為180至250。C，持續(xù)大約15至60分鐘。在烘焙過程中，急驟的溫度梯度(200—12(TC)遍及面團(tuán)外層，此時(shí)，烘焙產(chǎn)品的硬皮生成。然而，由于蒸氣，在烘焙過程的末期，面包屑的溫度僅為大約IO(TC。在高于大約85"C的溫度，可能發(fā)生酶的失活，酶將不具有保鮮特性。因此，只有熱穩(wěn)定的淀粉酶能夠在烘焙期間有效地修飾淀粉。由于支鏈糊精的積累會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生粘性的或膠粘的面包屑，內(nèi)切淀粉酶活性會(huì)對(duì)最終面包產(chǎn)品的質(zhì)量產(chǎn)生負(fù)面影響。外切淀粉酶活性是優(yōu)選的，因?yàn)槠渫瓿闪似谕牡矸坌揎棧鲂揎棇?dǎo)致老化(不新鮮化)的延遲，而與內(nèi)切淀粉酶活性相關(guān)的負(fù)面效應(yīng)則較少。內(nèi)切淀粉酶活性的降低可以導(dǎo)致更高的外切特異性，這可以減少支鏈糊精并產(chǎn)更高質(zhì)量的面包。本發(fā)明涉及具有改變的外切特異性的多肽。發(fā)明概述在第一方面，本發(fā)明提供了包括PS4變異體的多肽，PS4變異體衍生自親代多肽(parentpolypeptide)。親代酶可以優(yōu)選地是嗜糖假單胞菌(i^ewcfowowassacc/2ara/7/na)的非產(chǎn)麥芽夕卜切淀粉酶(non-maltogenicexoamylase)，如具有SEQIDNO:l或SEQIDNO:5中列出的氨基酸序列的外切淀粉酶。親代酶可以優(yōu)選地是施氏假單胞菌(i^^/o"w朋w加zm')的非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶，如具有SEQIDNO:7或SEQIDNOll中列出的氨基酸序列的多肽。PS4家族的其它成員可以被用作親代酶。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，親代多肽是來自嗜糖假單胞菌的非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶，其具有SEQIDNO:l或SEQIDNO:5中列出的氨基酸序列。在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，親代多肽是來自施氏假單胞菌的非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶，其具有SEQIDNO:7或SEQIDNO:11中列出的氨基酸序列。在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，PS4變異體通過包含氨基酸取代而不同于親代多肽，取代所處的位置包括選自下列的至少一個(gè)位置4、、70、71、87、99、100、108、113、121、131、134、135、141、153、157、158、160、161、166、170、171、178、179、184、188、198、199、221、223、238、270、277、290、307、315、334、335、342、343、372、392、398、399、405、415、425，其中對(duì)位置所進(jìn)行的編號(hào)是參照SEQIDNO:l列出的嗜糖假單胞菌序列。在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，PS4變異體通過包含氨基酸取代而不同于親代多肽，所述取代所處的位置包括選自下列的至少一個(gè)位置4、33、34、70、71、87、99、108、113、121、131、134、141、157、158、171、178、179、188、198、199、223、290、307、315、334、343、399和405，其中位置編號(hào)是參照SEQIDNO:l列出的嗜糖假單胞菌序列。優(yōu)選地，所述位置是選自下列的至少一個(gè)位置33、34、71、87、121、134、141、157、178、179、223、307、334和343。優(yōu)選地，PS4變異體包括至少一個(gè)取代，其選自N33Y、D34N、K71R、G87S、G121D、G134R、A141P、L178F、A179T、G223A、H307L、S334P和D343E。在另一種實(shí)施方案中，所述外切淀粉酶還包括至少一個(gè)另外的取代，位置選自108、158、171和188。優(yōu)選地，PS4變異體包括選自下列的至少一個(gè)取代K108R、G158D、Y171S和G188A。優(yōu)選地，PS4變異體包括選自下列的至少一個(gè)取代G4D、N33Y、D34N、G70D、K71R、G87S、A99V、K108R、V113I、G121D、G134R、A141P、1157L、G158D、Y171S、L178F、A179T、G188A、Y198F、Y198L、A199V、G223A、V290I、H307L、1315V、S334P、D343E、S399P、A405F和A405E。優(yōu)選地，PS4變異體包括下列取代N33Y、D34N、G134R、A141P、1157L、G223A、H307L和S334P，帶有至少一個(gè)另外的取代L178F或A179T。優(yōu)選地，PS4變異體包括下列取代中的至少一個(gè)N33Y、D34N、1157L、L178F、A179T、G223A或H307L。優(yōu)選地，PS4變異體包括下列取代中的至少一個(gè)G87S、G134R、A141P或S334P。在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，PS4變異多肽包括選自下列的組合G134R,A141PI157LG223AH307LS334PD343EG121D;G134RA141PI157LG223AH307LS334PD343EN33Y;10G134R，A141PI157LG223AH307LS334PD343EN33YD34NK71RL178FA179TG87SG121DS214NT375A;G134R,A141PI157LG223AH307LS334PD343EN33YD34NK71RL178FA179TG121DY171SG188AN138D;G134R,A141PI157LG223AH307LS334PD343EN33YD34NK71RL178FA179TG121D;G87SG121DG134R，A141PI157LG223AH307LS334PD343EN33YD34NK71RL178FA179T;G87SG121DG134R,A141PI157LG223AH307LS334PD343EN33YD34NK71RL178FA179TG188A;G134R,A141PI157LG223AH307LS334PK71RL178FA179T;G134R,A141PI157LG223AH307LS334PL178FA179T;G134R,A141PI157LG223AH307LS334PN33YD34NL178FA179T;G134R，A141PI157LG223AH307LS334PL178FA179TG87SG121D;G134R,A141PI157LG223AH307LS334PL178FA179TG121D;G134R,A141PI157LG223AH307LS334PD343EN33YD34NK71RL178FA179TG121DE343D;G87SG121DG134R，A141PI157LG223AH307LS334PD343EN33YD34NK71RL178FA179T;G87SG121DG134R，A141PI157LG223AH307LS334PD343EN33YD34NK71RL178FA179TY33NN34DE343D;G134R,A141PI157LG223AH307LS334PD343EN33YD34NK71RL178FA179TG121D;G134R，A141PI157LG223AH307LS334PK71RU78FA179TG121D;G87S，VI131,G134R，A41P,1157L，Y淺F，G223A，V290I，H307L，S334P，D343E;113F，A141P,1157L，Y198F，G223A，V290I,H307L，S334P，D343E;A99V，V113I,A141P，1157L，Y198F,G223A，V290I,H307L，S334P，D343E;V1131,1157L，Y198F，G223A，V290I,H307L，S334P,D343EVI131,G134R，A141P，I157L,Y198F，G223A,V2卯I，H307L,S334P,D343E;A141P，I157L,Y198F，G223A,V2卯I，H307L,S334P,D343E;A199V,D343E，V113I,A141P,U57L，Y198F，G223A，V2卯I，H307L，S334P;VI131，A141P,I157L,Y198F，G223A，V2卯I，S334P，D343E;VI131,G121D，G134R，A141P,I157L,Y198F，G223A，V290I,H307L,S334P，D343E;V113I,G121D,G134R，A141P,I157L,Y198F，G223A，V290I,H307L,S334P，D343E;V113I,A141P，I157L,Y198F，G223A，V290I,H307L,S334P,D343E;V113I,A141P，Y198F，G223A，V290I,H307L;VI131,A141P,Y198F,G223A,V290I,S334P,D343E;V113I,A141P,Y198F,G223A，A268P，V290I,S399PV113I,A141P，Y198F，G223A,V290I,S399P;VI131,A141P,Y198W,G223A,V290I;V113I,A141P,Y198F,G223A，V290I;Y198F,G223A,V290I;Y198W，G223A,V2術(shù)；V113I,A141P，1157L，Y198F，G223A,V290I;V113M;V113A;VI131，G134R,A141P,1157L，Y198F，G223A，V290I,H307L，S334P,D343E;V113I,G134R，A141P,I157L,Y198F,G223A，V290I,H307L,I315V,S334P,D343E;D34N,VI131,G134R，A141P，I157L,Y198F,G223A，V2謹(jǐn)，H307L，S334P,D343E;VI131，G134R,A141P，1157L，G188S，Y198F，G223A,V290I,H307L，S334P,D343E;K71R，VI131，G134R,A141P，1157L，L178L，Y198F，G223A,V290I,H307L,G313G,S334P，D343E;D34N,VI131,G134R，A141P，1157L，Y198F，G223A，V290I,H307L,G313G,S334P,D343E;V113I,G134R,A141P,I157L,A179V,Y198F,G223A，V2卯I，H307L,S334P,D343E;VI131,G134R,A141P，I157L,I170I,Y198F，G223A,V290I,H307L，G313G,S334P,D343EVI131,G134R，A141P，I157L,A179V,Y198F，G223A,V290I,H307L，G313G,S334P，D343E;G87S,V113I,G134R,A141P，I157L,Y198F，G223A，V290I,H307L，S334P，D343E;VI131,G134R,A141P,1157L，Y198F，G223A,V2頻，H307L，S334P,D343E,A405E;VI131,G134R,A141P，I157L,Y198F，G223A,V2卯I，H307L，S334P，D343E，A405V;A141P，1157L，Y198F，G223A，V290I,H307L,S334P，D343E;V113I,G134R，A141P,I157L,Y198L，G223A,V290I,H307L,S334P，D343E;VI131,G134R,A141P,I157L,Y198F,G223A，V290I,H307L，S334P，D343E;K71R,V113I,G134R，A141P，1157L，Y198F，G223A，V2雨，H307L,S334P，D343E;K108R,V113I,G134R，A141P，I157L,Y198F，G223A,V290I,H307L,S334P,D343E;D34G，V113I,G134R,A141P，I157L,Y198F,G223A，V290I,H307L，S334P，D343E;G4D，V113I,A141P，1157L，Y198F，G223A,V290I,H307L，S334P,D343E;和A141P,G134R，G223A,H307L,I157L,V113I,V290I,Y198F,G188A;在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，PS4變異體多肽包括選自下列的組合G134R，A141P，I157L,G223A，H307L和S334P;G121D,G134R，A141P,1157L，G223A,H307L和S334;G87S,G121D,G134R，A141P，I157L,G223A,H307L和S334P;G134R，A141P,1157L，L178F,A179T,G223A,H307L和S334P;G87S,G121D,G134R，A141P,I157L,L178F，A179T,G223A，H307L和S334P;G121D，G134R，A141P，1157L，L178F，A179T，G223A，H307L和S334P;N33Y，D34N，G134R,A141P，I157L,L178F,A179T，G223A,H307L和S334P;N33Y,D34N，G121D，G134R,A141P,I157L,L178F,A179T，G223A,H307L和S334P;和N33Y,D34N，G87S,G121D,G134R，A141P，I157L,L178F,A179T,G223A，H307L和S334P。在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，PS4變異體多肽包括選自下列的組合:N33Y,D34N，G134R，A141P，1157L，L178F，A179T,G223A,H307L和S334P;N33Y,D34N,G87S，G121D，G134R,A141P,I157L,L178F，A179T，G223A，H307L和S334P;禾口N33Y,D34N，G87S,G121D,G134R,A141P，I157L,L178F,A179T,G223A,H307L和S334P在優(yōu)選的實(shí)施方案中，PS4變異體是包含在SEQIDN0:2;SEQIDN0:3;SEQIDNO:4;SEQIDNO4a，SEQIDNO4b，SEQIDNO4c，SEQIDNO:8，SEQIDNO:9或SEQIDNO:IO中列出的序列的氨基酸。PS4變異體可以是源自假單胞菌(尸^^omo"^w)。在一種實(shí)施方案中，假單胞菌某種是選自嗜糖假單胞菌和施氏假單胞菌。PS4變異多肽可以包括除上面列出的那些突變之外的一種或多種突變。也可以包括其它突變，例如在一個(gè)或多個(gè)其它位點(diǎn)的刪除、插入、取代、顛換、轉(zhuǎn)換和倒位(inversions)。同樣地，多肽可以缺失上面列出的取代的至少一個(gè)。在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，多肽被截短。截短(truncation)可以在N末端或C末端。親代酶或PS4變異體可以缺少一個(gè)或多個(gè)部分，例如子序列(sub-sequences)、信號(hào)序列、結(jié)構(gòu)域或部分(moieties),不論其是有活性或是沒有活性的。例如，如本文所描述，親代酶或PS4變異體多肽可以缺乏信號(hào)序列。作為選擇地，或者附加地，親代酶或PS4變異體可以缺乏一個(gè)或多個(gè)催化結(jié)構(gòu)域或結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，親代酶或PS4變異體可以缺乏存在于非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶中的一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)域，如淀粉結(jié)合結(jié)構(gòu)域。例如，PS4多肽可以僅具有直至位置429的序列，這是相對(duì)于SEQIDNO:l中列出的嗜糖假單胞菌非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶的編號(hào)而言的。在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，提供了PS4變異體pSac-d34(SEQIDNO4c，圖8c)、pSac-D20(SEQIDN04a，圖8a)和pSac-D14(SEQIDN04b，圖8b)，所述變異體具有如圖中列出的氨基酸序列。PS4變異體也可以包括同源序列。同源序列包括核苷酸序列，其與編碼PS4變異體多肽酶的核苷酸序列有至少75X、80%、85%或90%是相同的(indentical)，優(yōu)選地有至少95%、96%、97%、98%或99%是相同的。優(yōu)選的實(shí)施方案也包括功能上的等價(jià)物(functionalequivalents)。本文中描述的PS4變異多肽來源于優(yōu)選地顯示出非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶活性的多肽或者是優(yōu)選地顯示出非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶活性的多肽的變異體。優(yōu)選地，親代酶本身是非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶。優(yōu)選實(shí)施方案中的PS4變異多肽也顯示出非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶活性。本文描述的PS4變異體將優(yōu)選地具有外切特異性，例如，由本文所描述的外切特異性指數(shù)(exospecificityindices)所量度的，這和它們是外切淀粉酶相一致。而且，與親代酶或它們的起源多肽相比較，它們優(yōu)選地具有更高的或增加的外切特異性。因此，例如，PS4變異多肽可以具有20或更大的外切特異性指數(shù)，g卩，其總淀粉酶活性(包括外切淀粉酶活性)比其內(nèi)切淀粉酶活性多20倍或更多。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，外切淀粉酶的外切特異性指數(shù)是30或更多、40或更多、50或更多、60或更多、70或更多、80或更多、90或更多、或100或更多。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，外切特異性指數(shù)是150或更多、200或更多、300或更多、或400或更多。優(yōu)選地，PS4變異體將比親代更加熱穩(wěn)定。優(yōu)選地，PS4變異多肽能夠在從大約55"C至大約8(TC或更高的溫度下降解淀粉。優(yōu)選地，PS4變異體在暴露于高達(dá)大約95。C的溫度后保持其活性。本文描述的PS4變異多肽相對(duì)于親代酶，具有延長的半衰期，優(yōu)選地延長10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%或更多，這優(yōu)選地在從55"C至大約95t:或更高的高溫下，優(yōu)選地在大約8(TC發(fā)生。優(yōu)選地，將樣品在80"C或更高溫度下加熱1-10分鐘。優(yōu)選地，PS4變異多肽是更加pH穩(wěn)定的。優(yōu)選地，它比其同源親代多肽的pH穩(wěn)定性高。優(yōu)選地，PS4變異多肽能夠在pH從大約5至大約10.5時(shí)降解淀粉。在相同的pH條件下，和它們的親代多肽相比較時(shí)，PS4變異多肽可以具有多出10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%或更長的半衰期。在另一種實(shí)施方案中，可以通過測(cè)定酶在特定pH條件下的活性或比活性來分析pH穩(wěn)定性的程度。特定的pH條件可以是從pH5至pH10.5的任何pH。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，功能上的等價(jià)物將和PS4家族成員中的至少一個(gè)具有序列同源性。功能上的等價(jià)物將和上面提及的嗜糖假單胞菌和施氏假單胞菌非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶中的任一個(gè)具有序列同源性，優(yōu)選地，和兩者都具有序列同源性。功能上的等價(jià)物也可以和SEQIDNOs:1至12中所示序列的任一個(gè)，優(yōu)選地和SEQIDNO:1或SEQIDNO:7或兩者具有序列同源性。序列同源性優(yōu)選地至少是60%、優(yōu)選地是65%或更多、優(yōu)選地是75%或更多、優(yōu)選地是80%或更多、優(yōu)選地是85%或更多、優(yōu)選地是90%或更多、優(yōu)選地是95%或更多。序列同源性可以通過本文列出的任何程序或所有程序生成。在其它的實(shí)施方案中，功能性等價(jià)物將能夠特異地和上面列出的任何序列雜交。在第二方面，本發(fā)明提供了核酸，該核酸編碼包括PS4變異體的多肽，多肽可以從親代多肽得到，如上所述。親代酶可以優(yōu)選地是SEQIDNO:1中列出的或SEQIDNO:5中列出的嗜糖假單胞菌非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶。親代酶可以優(yōu)選地是SEQIDNO:7列出的或SEQIDNO:11中列出的施氏假單胞菌非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶。PS4家族的其它成員可以被用作親代酶。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，親代多肽是來自嗜糖假單胞菌非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶的非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶，其具有如SEQIDNO:1列出的或SEQIDNO:5列出的序列。在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，親代多肽包括來自施氏假單胞菌的非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶，其具有如SEQIDNO:7列出的或SEQIDNO:11列出的序列。在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，編碼PS4變異體的核酸通過編碼氨基酸取代而不同于親代核酸，所述取代所處的位置包括至少一個(gè)位置，其選自4、9、13、33、34、42、70、71、87、99、100、108、113、121、131、134、135、141、153、157、158、160、161、166、170、171、178、179、184、188、198、199、221、223、238、270、277、290、307、315、334、335、342、343、372、392、398、399、405、415、425，其中對(duì)位置所作的編號(hào)是參照SEQIDN0:1列出的嗜糖假單胞菌序列。優(yōu)選地，所述位置選自下列的至少一個(gè)位置33、34、87、121、134、141、157、178、179、223、307禾口334。優(yōu)選地，編碼PS4變異體的核酸包括編碼多肽中至少一個(gè)取代的核酸，所述取代選自N33Y、D34N、G87S、G121D、G134R、A141P、1157L、L178F、A179T、G223A、H307L和S334P。優(yōu)選地，編碼PS4變異體的核酸包括下列取代N33Y、D34N、G134R、A141P、1157L、G223A、H307L和S334P，并帶有至少一個(gè)另加的L178F或A179T取代。優(yōu)選地，編碼PS4變異體的核酸包括下列取代中的一個(gè)N33Y、D34N、1157L、L178F、A179T、G223A或H307L。優(yōu)選地，編碼PS4變異體的核酸包括下列取代中的一個(gè)G87S、G134R、A141P或S334P。在另一種實(shí)施方案中，編碼PS4變異體的核酸包括編碼下列取代中的至少—個(gè)的核酸K71R、K108R、G158D、Y171S、G188A和D343E。在另一種實(shí)施方案中，編碼PS4變異體的核酸包括這樣的核酸，其編碼下列的至少一個(gè)組合G134R，A141PI157LG223AH307LS334PD343EG121D;G134RA141PI157LG223AH307LS334PD343EN33YG121D;G134RA141PI157LG223AH307LS334PD343EN33Y;G134R,A141PI157LG223AH307LS334PD343EN33YD34NK71RL178FA179TG87SG121DS214NT375A;G134R，A141PI157LG223AH307LS334PD343EN33YD34NK71RL178FA179TG121DY171SG188AN138D;G134R,A141PI157LG223AH307LS334PD343EN33YD34NK71RL178FA179TG121D;G87SG121DG134R,A141PI157LG223AH307LS334PD343EN33YD34NK71RL178FA179T;G87SG121DG134R,A141PI157LG223AH307LS334PD343EN33YD34NK71RL178FA179TG188A;G134R,A141PI157LG223AH307LS334PK71RL178FA179T;G134R，A141PI157LG223AH307LS334PL178FA179T;G134R，A141PI157LG223A訓(xùn)7LS334PN33YD34NL178FA179T;G134R,A141PI157LG223AH307LS334PL178FA179TG87SG121D;G134R,A141PI157LG223AH307LS334PL178FA179TG121D;G134R，A141PI157LG223AH307LS334PD343EN33YD34NK71RL178FA179TG121DE343D;G87SG121DG134R,A141PI157LG223AH307LS334PD343EN33YD34NK71RL178FA179T;G87SG121DG134R,A141PI157LG223AH307LS334PD343EN33YD34NK71RL178FA179TY33NN34DE343D;G134R,A141PI157LG223AH307LS334PD343EN33YD34NK71RL178FA179TG121D;G134R,A141PI157LG223AH307LS334PK71RL178FA179TG121D;G87S，VI131，G134R,A141P,1157L，Y198F，G223A,V290I,H307L,S334P，D343E;113F,A141P，I157L,Y198F,G223A，V290I,H307L,S334P,D343E;A99V，VI131，A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L，S334P,D343E;VU3I,I157L,Y198F,G223A，V2卯I，H307L，S334P，D343EVI131,G134R,A141P，1157L，Y198F,G223A，V2婦，H307L，S334P,D343E;A141P,I157L,Y198F，G223A，V290I,H307L,S334P，D343E;A199V，D343E，V113I,A141P，I157L,Y198F，G223A，V290I,H307L，S334P;VI131,A141P,1157L，Y198F,G223A,V2卯I，S334P,D343E;VI131，G121D，G134R,A141P，I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E;VI131,G121D，G134R,A141P，I157L,Y198F,G223A,V290I,咖7L,S334P,D343E;VI131,A141P,I157L,Y198F，G223A,V290I,H307L,S334P，D343E;VI131,A141P,Y198F,G223A,V2卯I，H307L;VI131,A141P,Y198F,G223A，V290I,S334P,D343E;V113I,A141P，Y198F,G223A，A268P,V290I,S399PVI131,A141P，Y198F,G223A,V290I,S399P;V113I，A141P,Y198W，G223A,V290I;VI131，A141P，Y198F，G223A,V290I;Y198F,G223A，V2卯I;Y198W,G223A，V290I;V1131,A141P，1157L，Y198F，G223A,V2卯I;V113M;V113A;VI131，G134R，A141P，1157L，Y198F，G223A，V290I,H307L,S334P,D343E;V113I,G134R,A141P，1157L，Y198F，G223A,V2卯I，H307L,I315V,S334P，D343E;D34N，V113I,G134R,A141P,1157L，Y淺F,G223A,V290I,H307L，S334P,D343E;V113I,G134R,A141P,1157L，G188S,Y198F，G223A,V290I,H307L,S334P，D343E;K71R,VI131，G134R,A141P,1157L，L178L,Y198F,G223A，V290I,H307L,G313G，S334P,D343E;D34N,VI131，G134R，A141P，I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,G313G,S334P,D343E;V3I，G134R，A41P，I157L,A179V,Y198F，G223A，V290I,H307L，S334P，D343E;VI131，G134R,A141P，1157L，11701，Y198F，G223A，V290I,H307L，G313G，S334P，D343EVI131，G134R，A141P,1157L，A179V，Y198F，G223A,V290I,H307L,G313G,S334P,D343E;G87S,VI131，G134R,A141P，I157L,Y198F，G223A,V290I,H307L,S334P,D343E;VI131,G134R,A141P,1157L，Y198F，G223A,V290I,H307L,S334P,D343E,A405E;VI131，G134R,A141P，I157L,Y198F,G223A，V2卯I，H307L,S334P，D343E,A405V;A141P,I157L，Y198F，G223A,V290I,H307L，S334P,D343E;VI131，G134R，A141P,1157L，Y198L，G223A，V290I,H307L，S334P，D343E;VI131，G134R,A141P,I157L,Y198F，G223A,V290I,H307L,S334P，D343E;K71R，VI131，G134R,A141P，I157L,Y198F，G223A,V290I,H307L,S334P，D343E;K108R，VI131，G134R，A141P,I157L,Y198F，G223A，V290I,H307L，S334P,D343E;D34G,VI131，G134R,A141P，I157L,Y198F，G223A，V290I,H307L,S334P，D343E;G4D，V113I,A141P，I157L,Y198F,G223A，V290I,H307L，S334P，D343E;禾卩A141P，G134R，G223A，H307L，I157L,VI131，V290I,Y198F,G188A;G134R，A141P,I157L,G223A,H307L和S334P;G121D，G134R,A141P，I157L,G223A,H307L和S334;G87S,G121D,G134R,A141P,I157L,G223A，H307L和S334P;G134R,A141P,1157L，L178F,A179T,G223A,H307L和S334P;G87S，G121D,G134R,A141P，I157L,L178F,A179T,G223A,H307L和S334P;G121D，G134R，A141P，1157L，L178F,A179T,G223A,H307L和S334P;N33Y，D34N，G134R，A141P，U57L，L178F，A179T，G223A,H307L和S334P;N33Y,D34N,G121D,G134R,A141P，I157L,L178F，A179T,G223A，H307L和S334P;和N33Y，D34N,G87S，G121D,G134R,A141P，I157L,L178F，A179T,G223A,H307L和S334P;N33Y,D34N,G134R，A141P，I157L,L178F,A179T，G223A,H307L和S334P;N33Y,D34N,G87S,G121D,G134R,A141P,I157L,L178F,A179T，G223A,H307L和S334P;和N33Y，D34N，G87S，G121D，G134R，A141P，I157L,L178F，A179T,G223A，訓(xùn)7L和S334P20在優(yōu)選的實(shí)施方案中，編碼PS4變異體的核酸編碼氨基酸序列，所述氨基酸序列包括SEQIDNO:2;SEQIDNO:3;SEQIDNO:4;SEQIDN04a;SEQIDN04b;SEQIDN04c;SEQIDNO:8，SEQIDNO:9或SEQIDNO:IO。在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，核酸編碼截短的多肽。截短可以在N末端或C末端。親代酶或PS4變異體可以缺少一個(gè)或多個(gè)部分，如子序列、信號(hào)序列、結(jié)構(gòu)域或部分(moieties)，不論是有活性的或是沒有活性的。例如，親代酶或PS4變異多肽可以缺乏信號(hào)序列。替代地，或附加地，親代酶或PS4變異體可以缺乏一個(gè)或多個(gè)催化結(jié)構(gòu)域或結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，親代酶或PS4變異體可以缺乏存在于非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶中的一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)域，如淀粉結(jié)合結(jié)構(gòu)域。例如，PS4多肽可以具有僅至位置429的序列，這是相對(duì)于SEQIDNO:l中顯示的嗜糖假單胞菌非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶的編號(hào)而言的。在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，核酸編碼如圖中列出的PS4變異體pSac-d34、pSac-D20禾口pSac-D14。編碼PS4變異多肽的核酸可以包括除上面列出的那些突變之外的一個(gè)或多個(gè)突變。也可以包括其它突變，例如在一個(gè)或多個(gè)其它位置的刪除、插入、取代、顛換、轉(zhuǎn)換和倒位。同樣地，核酸編碼的多肽可以缺少至少一個(gè)在上面列出的取代。編碼PS4變異體的核酸也可以包括同源序列。同源序列包括核苷酸序列，其與編碼PS4變異多肽酶的序列是至少75X、80%、85%或90%相同的，優(yōu)選的是至少95%、96%、97%、98%或99%相同的。優(yōu)選的實(shí)施方案也包括編碼多肽的核酸，所述多肽是PS4變異體的功能上的等價(jià)物。編碼本文中描述的PS4變異多肽的核酸衍生自這樣的核酸或是這樣的核酸的變異體，所述核酸優(yōu)選地編碼具有非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶活性的酶。優(yōu)選地，由核酸編碼的親代酶本身是非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶。優(yōu)選實(shí)施方案中由核酸編碼的PS4變異多肽也顯示出非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶活性。如本文描述，由核酸編碼的PS4變異體將優(yōu)選地具有外切特異性，例如，由外切特異性指數(shù)所量度的。而且，優(yōu)選地，在相同條件下，與親代酶或它們的起源多肽相比較，它們優(yōu)選地具有更高的或增加的外切特異性。因此，例如，PS4變異多肽可以具有10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90°%、100%、200%或更高的外切特異性指數(shù)。優(yōu)選地在相同條件下，當(dāng)和它們的親代多肽相比較時(shí)，它們具有1.5x或更高、2x或更高、5x或更高、10x或更高、50x或更高、100x或更高的外切特異性。優(yōu)選地，由核酸編碼的PS4變異體將比親代更加熱穩(wěn)定。優(yōu)選地，PS4變異多肽能夠在從大約55。C至大約8(TC或更高的溫度下降解淀粉。優(yōu)選地，PS4變異體在暴露于高達(dá)大約95X:的溫度后保持其活性。本文描述的PS4變異多肽相對(duì)于親代酶，具有延長的半衰期，優(yōu)選地延長10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%或更多，這優(yōu)選地在從55'C至大約95。C或更高的高溫下，優(yōu)選地在大約8(TC發(fā)生。優(yōu)選地，將樣品在8(TC或更高的溫度下加熱1-10分鐘。優(yōu)選地，由核酸編碼的PS4變異多肽是pH穩(wěn)定的。優(yōu)選地，它比其親代多肽的pH穩(wěn)定性高。優(yōu)選地，PS4變異多肽能夠在pH從大約5至大約10.5時(shí)降解淀粉。具體的pH條件可以是從pH5至pH10.5的任何pH。在相同的條件下，和親代多肽相比較時(shí)，該核酸編碼的PS4變異多肽可以具有更長的半衰期或更高的活性(取決于分析方法)。在相同的pH條件下，和親代多肽相比較時(shí)，PS4變異多肽可以有10X、200/。、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%或更長的半衰期。替代地，或附加地，在相同的pH條件下，和親代多肽相比較時(shí)，它們可以具有更高的活性。在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，該核酸編碼的功能上的等價(jià)物將和PS4家族成員中的至少一個(gè)具有序列同源性。功能上的等價(jià)物將和上面提及的嗜糖假單胞菌和施氏假單胞菌非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶中的任一個(gè)具有序列同源性，在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，優(yōu)選地和兩者都具有序列同源性。功能上的等價(jià)物也可以和SEQIDNOs:1至12中的任何一個(gè)，優(yōu)選地和SEQIDNO:1或SEQIDNO:7或兩者具有序列同源性。序列同源性優(yōu)選地至少是60%、優(yōu)選地是65%或更多、優(yōu)選地是75%或更多、優(yōu)選地是80%或更多、優(yōu)選地是85%或更多、優(yōu)選地是90%或更多、優(yōu)選地是95%或更多。在其它實(shí)施方案中，提供了核酸，所述核酸和編碼本文列出的任意PS4變異體的核酸互補(bǔ)。此外，提供了能夠和該互補(bǔ)序列雜交的核酸。在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，編碼功能上等價(jià)物的核酸將能夠特異地和上面列出的任意序列雜交，它和它的互補(bǔ)物提供于此。在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，用于本文描述的方法和組合物的序列是合成序列。其包括但不限于，利用宿主生物體的最佳密碼子使用所形成的序列，宿主生物體如甲基營養(yǎng)酵母畢赤酵母(P/c/2&)和漢遜酵母(ifame肌/a)。本發(fā)明的第三方面提供了組合物，其包括至少一種PS4變異多肽和另一組分。另一組分可以是酶，其選自氧化還原酶、水解酶、脂肪酶、酯酶、糖苷酶、淀粉酶、支鏈淀粉酶、木聚糖酶、纖維素酶、半纖維素酶、淀粉降解酶、蛋白酶和脂加氧酶。在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，組合物包括至少一種PS4變異體和來自桿菌的產(chǎn)麥芽淀粉酶，如WO91/04669中所公開的。優(yōu)選的實(shí)施方案包括PS4變異體和面粉。另外的酶可以和任何面團(tuán)成分共同加入，面團(tuán)成分包括面粉、水或任選的其它組分或添加劑或面團(tuán)改良組合物(doughimprovingcomposition)。可以在面粉、水或任選的其它組分或添加劑或面團(tuán)改良組合物之前或之后加入另外的酶。另外的酶可以是液體制備物，或干燥組合物的形式。第四方面提供了包括PS4變異多肽的載體、包括PS4變異多肽的細(xì)胞和表達(dá)PS4變異多肽的方法。在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及重組的可復(fù)制載體，其帶有編碼PS4變異多肽的核酸。載體可以附加地包括本文列出的任何元素。另一種優(yōu)選的實(shí)施方案提供了宿主細(xì)胞，其包含編碼PS4變異體的核酸。宿主細(xì)胞可以是本文列出的任何細(xì)菌、真菌或酵母細(xì)胞。在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，如本文所提供，本發(fā)明涉及表達(dá)PS4多肽的方法。本發(fā)明的其它方面可以在相關(guān)申請(qǐng)中找到，其律師案巻編號(hào)為674510-2007和GC806P，它們?cè)诖瞬⑷胱鳛閰⒖迹ㄈ魏螆D表、參考文獻(xiàn)和附圖。圖1顯示了PS4變異體的熱穩(wěn)定性改善。PS4ccl是表達(dá)的對(duì)照酶，其來自嗜糖假單胞菌，不帶有信號(hào)序列并缺乏淀粉結(jié)合結(jié)構(gòu)域。對(duì)PS4ccl、pSac-D3、pSac-D20和pSac-D14，以半衰期對(duì)溫度作圖，半衰期以分鐘表示，溫度以攝氏度表示。圖2顯示了在模型面團(tuán)體系試驗(yàn)(modeldoughsystemtrial)中，PSac-D34的劑量效應(yīng)。面包屑的固體含量是通過NMR測(cè)定的。對(duì)于對(duì)照、D340.5、1、2ppm，以通過固體含量來量度的堅(jiān)硬度對(duì)烘焙后的天數(shù)作圖。圖3顯示了烘焙試驗(yàn)(bakingtrial)的結(jié)果，結(jié)果顯示了以每kg面粉lmg的劑量加入PSac-D3和Psac-D14時(shí)，降低的堅(jiān)硬性和堅(jiān)硬速度。對(duì)對(duì)照組，以通過hPa量度的堅(jiān)硬性對(duì)烘焙后的天數(shù)作圖。圖4顯示了烘焙試驗(yàn)，顯示了相比于不帶有N33Y、D34N、K71R、L178F、A179T的PSac匿D3，PSac-D3(G134R、A141P、1157L、G223A、A307L、S334P、K71R、D343E、N33Y、D34N、L178F、A179T)的增加軟化的效應(yīng)，在75C時(shí)，禾nPSac-D3的9，3分鐘相比，其t1/r75是3,6。圖5顯示了PS4(SEQIDNO:l)參照序列，來自嗜糖假單胞菌麥芽四糖水解酶氨基酸序列。圖6顯示了PS4變異體的序列(SEQIDNO:2);嗜糖假單胞菌麥芽四糖水解酶氨基酸序歹U，其帶有G134R、A141P、I157L、G223A、H307L、S334P、N33Y、D34N、L178F和A179T取代。圖7顯示了PS4變異體的序列(SEQIDNO:3);嗜糖假單胞菌麥芽四糖水解酶氨基酸序歹iJ，其帶有G134R、A141P、I157L、G223A、H307L、S334P、N33Y、D34N、L178F、A179T和G121D取代。圖8A顯示了PS4變異體的序列(SEQIDNO.4);嗜糖假單胞菌麥芽四糖水解酶氨基酸序列，其帶有G134R、A141P、1157L、G223A、H307L、S334P、N33Y、D34N、L178F、A179T、G121D禾口G87S取代。圖8B顯示了PSac-D20序列(SEQIDNO:4a);嗜糖假單胞菌麥芽四糖水解酶氨基酸序列，其帶有13個(gè)取代和淀粉結(jié)合結(jié)構(gòu)域的刪除。圖8C顯示了PSac-D14序列(SEQIDNO:4b);嗜糖假單胞菌麥芽四糖水解酶氨基酸序列，其帶有14個(gè)取代和淀粉結(jié)合結(jié)構(gòu)域的刪除。圖8D顯示了PSac-D34序列的序列；嗜糖假單胞菌麥芽四糖水解酶氨基酸序列，其帶有11個(gè)取代和淀粉結(jié)合結(jié)構(gòu)域的刪除。圖9顯示了嗜糖假單胞菌麥芽四糖水解酶的氨基酸序列(SEQIDNO:5)。嗜糖假單胞菌葡聚糖1，4-a-麥芽四糖水解酶前體(EC3.2丄60)(G斗-淀粉斷(麥芽四糖形成淀粉酶)(外切麥芽四糖水解酶)(麥芽四糖形成外切淀粉酶)。SWISS-PROT登記號(hào)(accessionnumber)是P22%3。圖10A和10B顯示了嗜糖假單胞菌麥芽四糖水解酶的核酸序列(SEQIDNO:6)。編碼麥芽四糖水解酶的嗜糖假單胞菌mta基因(EC登記號(hào)=3.2.1.60)。GenBank登記號(hào)是X16732。圖11顯示了施氏假單胞菌麥芽四糖水解酶的氨基酸序列(SEQIDNO:7)。圖12顯示了PStu-D34的序列(SEQIDNO:8);施氏假單胞菌麥芽四糖水解酶的氨基酸序列，其帶有G134R、A141P、U57L、G223A、H307L、S334P、N33Y、D34N取代。圖13顯示了PStu-D20的序列(SEQIDNO:9);施氏假單胞菌麥芽四糖水解酶的氮基酸序列，其帶有G134R、A141P、1157L、G223A、H307L、S334P、N33Y、D34N和G121D。圖14顯示了PStu-D14的序列(SEQIDNO:10);施氏假單胞菌麥芽四糖水解酶的氨基酸序列，其帶有G134R、A141P、1157L、G223A、H307L、S334P、N33Y、D34N、G121D和G87S。圖15顯示了施氏假單胞菌CPse"fifomo"asper/ectomaW"a)的序列(SEQIDNO:11)。葡聚糖l，4-a-麥芽四糖水解酶前體(EC3.2丄60)(G4-淀粉酶)(麥芽四糖形成淀粉酶)(外切麥芽四糖水解酶)(麥芽四糖形成外切淀粉酶)。SWISS-PROT登記號(hào)P13507。圖16顯示了施氏假單胞菌麥芽四糖水解酶核酸序列的序列。施氏假單胞菌麥芽四糖形成淀粉酶(amyP)基因的全長編碼序列(completecds.)GenBank登記號(hào)M24516(SEQIDNO:12)。優(yōu)選實(shí)施方案詳述如無其它指明，本發(fā)明的實(shí)踐將采用常規(guī)的化學(xué)、分子生物學(xué)、微生物學(xué)、重組DNA和免疫學(xué)技術(shù)，這些都包含在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。這些技術(shù)在文獻(xiàn)中得到闡述。參見，例如，J.Sambrook,E.F.Fritsch,禾口T.Maniatis，1989,A/b/ecw/arC7om'"g:』Z^6om/o^yMiawwcjf/,SecondEdition,Books1-3,ColdSpringHarborLaboratoryPress;Ausubel，F(xiàn).M.等(1995和定期增刊；Owre"f尸rotoco/smAfo/ecw/ar說o/ogV，ch,9,13,和16,JohnWiley&Sons,NewYork,N.Y.);B.Roe,J.Cmbtree,禾卩A.Kahn,1996，DiVJZso/aWo"朋diSegwewc/wg:五we""a/rec/7m々wej,JohnWiley&Sons;J,M.Polak和JamesO'D.McGee,19%,幼w/fy6n'必油'ow.■/W腦》/es朋d尸rac"'ce;OxfordUniversityPress;M.J.Gait(編者)，1984，(9"gorac/eof油5y牆es&:j尸rac"ca/v4p戸ac/j,IrlPress;D.M.J.Lilley禾卩J.E.Dahlberg，1992,JWe^ocfeo/五wzjwo/ogyD則S/ra"臟尸ar".'5y"/Zz加'j尸/2戸.ca""a/j^o/ZWylMethodsinEnzymology,AcademicPress;UsingAntibodies:ALaboratoryManual:PortableProtocolNO.I，作者是EdwardHarlow,DavidLane，EdHarlow(1999，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ISBN0-87969-544-7);Antibodies:ALaboratoryManual,^(乍者是EdHarlow(Editor),DavidLane(Editor)(1988,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ISBN0-87969-314-2),1855,Lars-IngeLarsson"/附mimocytoc/zerw'sfry:r/ieor_yW細(xì)c"ce"，CRCPressinc.,BacaRaton,Florida,1988，ISBN0-8493-6078-1,JohnD.Pound(ed);V歸簡oc/j簡'ca/戶ratoc油，vo/柳'，來自系歹U:"MethodsinMolecularBiology",HumanaPress,Totowa，NewJersey,1998,ISBN0-89603-493-3,HandbookofDrugScreening,由RamakrishnaSeethala,PrabhavathiB.Femandes編輯(2001,NewYork,NY,MarcelDekker，ISBN0-8247-0562-9);和LabRef:AHandbookofRecipes,Reagents,andOtherReferenceToolsforUseattheBench,JaneRoskams禾卩LindaRodgers,2002，ColdSpringHarborLaboratory,ISBN0-87969-630-3。這些普通文獻(xiàn)中的每一個(gè)在此并入，作為參考。如本文所應(yīng)用，"PS4"是指有關(guān)嗜糖假單胞菌非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶或施氏假單胞菌非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶的家族成員，或與嗜糖假單胞菌非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶或施氏假單胞菌非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶具有序列同源性或功能上同源性的家族成員，嗜糖假單胞菌非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶如具有SEQIDNO:l或SEQIDNO:5列出的氨基酸序列的外切淀粉酶，施氏假單胞菌非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶如具有SEQIDNO:7或SEQIDNO:11列出的氨基酸序列的多肽。其它的家族成員在表1中列出。對(duì)來源于嗜糖假單胞菌外切淀粉酶的PS4變異體的位置編號(hào)是參照SEQIDNO:1:1,GKSPAGVRYHCSGDEIILqg5",JWREAPM。W額LRQQAST濕e)GreA細(xì)PVCT61,SSWTDGGKSGGGSGYFWHDFNSDAQLRQMGALGGAGVKV;LYDV卿腳RUlgyh3眼MLPAGQGFWRWDCADPGNY訓(xùn)C咖DRFIGGESDLI則raDELAMi81LRSGyGAGGfJkFDFV3GYAl5EBVI3SWKSDSADSSFCVGE乙WKGPSEYPSWDW隨ASWIM241IIK咖SDRAKCPVt'D亂KE;RMQNGSVAGWKHGU1G,RWREVAVTFVO卵OTGYSPG30iONGGQ,ALQ3GLIBQ雄YII/TSPGTPVVWS鵬WGYGDFtRQLIQVfWTAGVRAD13(31SA工SFHSGYSGLWTVSGSQQTLWALMSD園PG'CJVASGSFSH:AWASNGQVRVWRSGS'l"GDGGG醒GSGGLV讓FRCDHGVTQMGDSVYAVGMVSQLCSPASAVRLTDTSSYPW4B〗KGSIALPDGQ跳WKCLIRHEADATLA/RQWQSGG,VQAAAGASTSGSF參照序列來自嗜糖假單胞菌序列，其SWISS-PROT登記號(hào)是P22963，但是沒有信號(hào)序列MSHILRAAVLAAVLLPFPALA。盡管是用特定的序列作為基本參照點(diǎn)，但該編號(hào)系統(tǒng)也可以適用于所有相關(guān)的同源序列。例如，該位置編號(hào)可以被用于來自其它假單胞菌種的同源序列，或來自其它細(xì)菌的同源序列。優(yōu)選地，這種同源序列有60%或更多的同源性，例如70%或更多、80%或更多、90%或更多或95%或更多的同源性，這是相對(duì)于參照序列SEQIDNO:1而言的?？梢杂帽疚拿枋龅墓穆?lián)配程序和雜交技術(shù)確認(rèn)蛋白之間的序列同源性。對(duì)來源于施氏假單胞菌的PS4變異體的位置進(jìn)行的編號(hào)是參照SEQIDNO:7:1DQAGKSP,脂IG'SDEIILQGF翻vvr1c柳DWTOILRQQAATIAADG61RDFSSWSDGSKSGGGB3YFW瞎t柳GRYGSDA柳C:AASALGGAGVKVt.121GYPDKEI歸柳GFWKWDCAD,mJDCDDGDKi.JGGDadlntgj1pqvISlL卿，V3'SrRFTiFVRGYAPKRVWSWMTDS腳SFCVGELWKGPSEY麼'2"mi:WSDKAKCPVH3ra跳卿WGSI'Wrt'腦LWCT冊(cè)Ri、'REVAWFV301驛GQ細(xì).肌Q'DGLI咖YAYIU"Srci'PVV簡K腦WGYGDFIRQLIQ3sisaisfissgysglvm'vs卿qtlvw跳dix'npgqvasgsfse肌nasngsc;;gsspgalvsvsfrcatqkgdsvyavgn卿lgkwspaaa亂td481lalp卿nse匿l，s朋,vrqwqgga隨itpssgat丁vg:化如本文所應(yīng)用，"PS4變異核酸"(PS4variantnucleicacids)是指編碼PS4多肽的核酸，所述多肽是PS4家族成員的變異體。如本文所應(yīng)用，"PS4變異多肽"(PS4variantpolypeptides)或"PS4變異體"(PS4variant)是指多肽，所述多肽是PS4家族成員的變異體。如本文所應(yīng)用，"親代酶"(parentenzymes)、"親代序列"(parentsequence)、"親代多肽"(parentpolypeptide)、"親代多肽"(parentpolypeptides)是指酶和多肽，PS4變異多肽是基于所述的酶和多肽。親代酶可以是前體酶(即，實(shí)際上被突變的酶)或其可以被從頭制備。親代FSA連PVPWYDVVPNH,YGMF"RDSFTNTSGYPTWKGS27酶可以是野生型的酶。如此處所應(yīng)用，"變異體"(variant)意味著衍生自親代分子的分子。變異體將包括多肽以及核酸。其中，變異體將包括在一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)處的取代、插入、顛換和倒位。變異體也將包括截短。變異體將包括親代分子的同源衍生物和功能衍生物。變異體還包括這樣的序列，其與能夠雜交于本文列出的核苷酸序列的序列互補(bǔ)。例如，變異體序列互補(bǔ)于這樣的序列，所述序列能夠在嚴(yán)緊條件下(例如5(TC和0.2xSSC(lxSSC-0.15MNaCl，0.015M檸檬酸三鈉pH7.0})和本文出現(xiàn)的核苷酸序列雜交。更優(yōu)選地，術(shù)語變異體包括互補(bǔ)于下述序列的序列，其能夠在高度嚴(yán)緊的條件下(例如，65。C和0.1xSSC{1xSSC=0.15MNaCl，0.015M檸檬酸三鈉pH7.0})和本文出現(xiàn)的核苷酸序列雜交。如本文所應(yīng)用，"前體"(precursor)是指用于產(chǎn)生修飾的酶的酶。前體可以是通過突變被修飾的酶。同樣地，前體可以是野生型的酶、變異的野生型酶或已經(jīng)突變的酶。如本文所應(yīng)用，親代酶的"功能上的等價(jià)物"(functionalequivalent)是指，和親代分子有相似或相同功能的分子。親代分子可以是嗜糖假單胞菌非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶或施氏假單胞菌非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶或從其它來源得到的多肽。功能上等價(jià)的酶可以有不同的氨基酸序列但具有非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶活性。本文描述了確定功能的分析的實(shí)例，這對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員是已知的。如本文所應(yīng)用，"分離的"(isolated)是指，序列至少基本上游離于至少一種其它組分，所述組分是與所述序列天然聯(lián)系的并在天然中發(fā)現(xiàn)的。如本文所應(yīng)用，"純化的"(purified)是指，序列處于相對(duì)純的狀態(tài)——例如，至少大約卯％純度，或至少大約95%純度或至少大約98%純度。如本文所應(yīng)用，"淀粉酶"(amylase)是指這樣的酶，其尤其能夠催化淀粉的降解。淀粉酶是水解酶，其切割淀粉中的a-D-(1—4)0-糖苷鍵。通常地，a-淀粉酶(E.C.3.2丄l，a-D-(1—4)-葡聚糖葡聚糖水解酶)被定義為，以隨機(jī)方式切割淀粉分子中的a-D-(l—4)0-糖苷鍵的內(nèi)作用酶(endo-actingenzymes)。與之對(duì)照，外作用淀粉分解酶(exo-actingamylolyticenzymes)如P-淀粉酶(E.C.3.2.1.2，a-D-(l—4)-葡聚糖麥芽水解酶)和一些產(chǎn)物特異性淀粉酶如產(chǎn)麥芽a-淀粉酶(E.C.3.2丄133)，從底物的非還原末端切割淀粉分子。e-淀粉酶、a-葡萄糖苷酶(E.C.3.2.1.20，a-D-葡糖苷葡糖水解酶)、葡糖淀粉酶(E.C.3.2丄3，a-D-(l—4)-葡聚糖葡糖水解酶)，和產(chǎn)物特異性淀粉酶可以從淀粉產(chǎn)生特定長度的麥芽寡糖。如本文所應(yīng)用，"非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶"(non-maltogenicexoamylaseenzyme)是指這樣的酶，其起初并不降解淀粉為實(shí)質(zhì)量的麥芽糖。用于實(shí)施這種確認(rèn)的分析方法提供于本文。如本文所應(yīng)用，"線性的麥芽寡糖"(linearmalto-oligosaccharide)是指，由a-(1—4)鍵連接的2-20個(gè)單位的a-D-吡喃型葡萄糖。如本文所應(yīng)用，"熱穩(wěn)定的"(thermostable)涉及酶暴露于升高的溫度之后保持活性的能力。酶如非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶的熱穩(wěn)定性是通過其半衰期來測(cè)定的。半衰期(t^)是以分鐘表示的時(shí)間，在此時(shí)間期間內(nèi)，在限定的條件下，酶活性的一半喪失。半衰期值是通過測(cè)定殘留的淀粉酶活性而計(jì)算的。半衰期分析如實(shí)施例中更詳細(xì)的描述而進(jìn)行。如本文所應(yīng)用，"pH穩(wěn)定的"(pHstable)是指酶在寬范圍的pHs下保持活性的能力。pH分析如實(shí)施例所描述而進(jìn)行。如本文所應(yīng)用，"外切特異性的"(exo-specific)涉及改進(jìn)的，例如，增加的"外切特異性指數(shù)"(exo-specificityindex),如與未取代的外切淀粉酶的外切特異性比率相比較時(shí)。如本文所應(yīng)用，"外切特異性指數(shù)"(exo-specificityindex)是指總淀粉酶活性與總內(nèi)切淀粉酶活性的比率。測(cè)定淀粉酶和內(nèi)切淀粉酶活性的分析方法提供于本文。如本文所應(yīng)用，"食物"將包括制備好的食物以及食物的成分，如面粉。如本文所應(yīng)用，"食物成分"(foodingredient)將包括配方(制劑)，其可以是功能食品(functionalfoods)或食品原料(foodstuffs)或可以被加入功能食品或食品原料，并包括以低水平應(yīng)用于寬范圍產(chǎn)品中的配方，所述產(chǎn)品需要例如酸化或乳化。食物成分可以是溶液的形式或固體形式——這取決于用途和/或應(yīng)用的方式和/或給予的方式。如本文所應(yīng)用，"功能食品"是指這樣的食品，其不僅能夠提供營養(yǎng)效果和/或味覺上的滿足，也可以向消費(fèi)者傳遞進(jìn)一歩的有益效果。如本文所應(yīng)用，"氨基酸序列"和術(shù)語"多肽"和/或術(shù)語"蛋白質(zhì)"同義。在一些情況下，術(shù)語"氨基酸序列"和術(shù)語"肽"同義。在一些情況下，術(shù)語"氨基酸序列"和術(shù)語"酶"同義。如本文所應(yīng)用，"類肽形式"(peptoidform)是指變異的氨基酸殘基，其中a-碳取代基是在殘基的氮原子上而不是在ci-碳上。制備類肽衍生物形式的肽的方法在本領(lǐng)域中是已知的，例如，SimonRJetd.，PNAS(1992)89(20)，9367-9371和HorwellDC，Tm^y5/o,ec/wo/.(1995)13(4),132-134。如本文所應(yīng)用，"核苷酸序列"或"核酸序列"是指寡核苷酸序列或多核苷酸序列，及其變異體，同源物，片段和衍生物(如其部分)。核苷酸序列可以是基因組來源或合成來源或重組來源，其可以是雙鏈或單鏈，不論代表正義鏈或反義鏈。如此處所應(yīng)用，術(shù)語核苷酸序列包括基因組DNA、cDNA、合成的DNA和RNA。優(yōu)選地，它是指DNA，更優(yōu)選地，是編碼PS4變異多肽的cDNA序列。如本文所應(yīng)用，"淀粉"是指淀粉本身或其組分，特別是支鏈淀粉。術(shù)語"淀粉介質(zhì)"(starchmedium)是指包括淀粉的任何合適的介質(zhì)。術(shù)語"淀粉產(chǎn)物"(starchproduct)是指包含淀粉或基于淀粉或來自淀粉的任何產(chǎn)物。優(yōu)選地，淀粉產(chǎn)物包含或基于或來自從小麥粉得到的淀粉。如本文所應(yīng)用，"面粉"是指小麥或其它谷物的細(xì)磨粉末(finely-groundmeal)。例如，面粉可以從小麥本身而不是從其它谷物得到。小麥粉一般指小麥粉本身以及存在于介質(zhì)如面團(tuán)中的小麥粉。如本文所應(yīng)用，"烘焙的含淀粉的面包產(chǎn)品"(bakedfarinaceousbreadproduct)是指基于面團(tuán)的任何烘焙產(chǎn)品，所述面團(tuán)可以在形成面團(tuán)的條件下，通過混合面粉、水和發(fā)酵劑得到。可以向面團(tuán)混合物中加入其它的成分。如本文所應(yīng)用，"同源物"(homologue)禾卩"同源"(homology)是指這樣的實(shí)體，它和目標(biāo)氨基酸序列(subjectaminoacidsequence)和目標(biāo)核苷酸序列有一定程度的同一性(identity)。同源序列被認(rèn)為包括與目標(biāo)序列有至少75%、80%、85%或90%同一性的氨基酸序列，優(yōu)選地有至少95%、96%、97%、98%或99%是同一的。典型地，同源物將包括和目標(biāo)氨基酸序列相同的活性位點(diǎn)。如本文所應(yīng)用，"雜交"將包括核酸鏈通過堿基配對(duì)與互補(bǔ)鏈結(jié)合的過程以及如在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)中進(jìn)行的擴(kuò)增過程。PS4核酸可以作為單鏈或雙鏈DNA或RNA、RNA/DNA異源雙鏈或RNA/DNA共聚物而存在。如本文所應(yīng)用，"共聚物"(copolymer)是指這樣的單條核酸鏈，其包括核糖核苷酸和脫氧核糖核苷酸。PS4核酸甚至可以是被密碼子最優(yōu)化以進(jìn)一步增加表達(dá)。如本文所應(yīng)用，"合成的"是指通過體外化學(xué)合成或酶合成產(chǎn)生的物質(zhì)。它包括但不限于由宿主生物體如甲基營養(yǎng)酵母畢赤酵母和漢遜酵母的最佳密碼子使用而生成的PS4核酸。如本文所應(yīng)用，"轉(zhuǎn)化的細(xì)胞"包括應(yīng)用重組DNA技術(shù)被轉(zhuǎn)化了的細(xì)胞。轉(zhuǎn)化通常通過向細(xì)胞內(nèi)插入一個(gè)或多個(gè)核苷酸序列而發(fā)生。插入的核苷酸序列可以是異源核苷酸序列(即，該序列對(duì)于欲被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞不是天然的)。此外，或替代地，插入的核苷酸序列可以是同源核苷酸序列(即，該序列對(duì)于欲被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞是天然的)。由此細(xì)胞接受一個(gè)或多個(gè)額外的核苷酸序列拷貝，所述序列已存在于細(xì)胞內(nèi)。如本文所應(yīng)用，"可操作地連接的"(opemblylinked)是指，所描述的組分處于一種關(guān)聯(lián)中，所述關(guān)聯(lián)允許它們以其所期望的方式起作用?？刹僮鞯剡B接于編碼序列的調(diào)節(jié)序列以這樣的方式被連接在和該調(diào)控序列相容的條件下，編碼序列的表達(dá)被實(shí)現(xiàn)。如本文所應(yīng)用，"生物學(xué)上有活性"(biologicallyactive)是指這樣的序列，它和天然發(fā)生的序列具有相似的結(jié)構(gòu)功能(但是不一定是相同的程度)，和域相似的調(diào)節(jié)功能(但是不一定是相同的程度)，和/或相似的生物化學(xué)功能(但是不一定是相同的程度)。1.對(duì)本發(fā)明多肽的詳述在第一方面，本發(fā)明通提供了包括PS4變異體的多肽，PS4變異體來自親代多肽。親代酶可以優(yōu)選地是非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶，優(yōu)選地是細(xì)菌非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶。親代酶可以優(yōu)選地是顯示出非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶活性的多肽。親代酶可以是嗜糖假單胞菌非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶，如SEQIDNO:1或SEQIDNO:5列出的外切淀粉酶。親代酶可以是施氏假單胞菌非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶，如SEQIDNO:7或SEQIDNO:11列出的多肽。PS4家族的其它成員可以被用作親代酶，如下面的表1所列出。優(yōu)選地，PS4家族成員將通常地和SEQIDNO:1、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7或SEQIDNO:ll列出的外切淀粉酶相似、同源或功能上等價(jià)，并可以用標(biāo)準(zhǔn)方法鑒定，如用探針對(duì)合適的文庫進(jìn)行雜交篩選，或用基因組測(cè)序分析。鑒定方法如下列出。同系物/變異體<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>166、170、171、178、179、184、188、198、199、221、223、238、270、277、290、307、315、334、335、342、343、372、392、398、399、405、415、425，其中對(duì)位置所作的編號(hào)是參照SEQIDNO:l列出的嗜糖假單胞菌外切淀粉酶序列。優(yōu)選地，所述位置選自下列的至少一個(gè)位置33、34、87、m、134、141、157、178、179、223、和334。在另一種實(shí)施方案中，變異體進(jìn)一步包括選自下列位置的取代:71、108、158、171、188和343。在另一種實(shí)施方案中，變異體進(jìn)一步包括選自位置113、198和2卯的取代。優(yōu)選地，PS4變異體包括至少一個(gè)取代，其選自N33Y、D34N、G87S、G121D、G134R、A141P、H57L、L178F、A179T、G223A、H307L和S334P。優(yōu)選地，PS4變異體包括下列取代N33Y、D34N、G134R、A141P、1157L、G223A、H307L和S334P，并帶有至少一個(gè)另外的取代L178F或A179T。優(yōu)選地，PS4變異體包括下列取代之一N33Y、D34N、1157L、L178F、A179T、G223A或H307L。優(yōu)選地，PS4變異體包括下列取代之一G87S、G134R、A141P或S334P。在另一種實(shí)施方案中，PS4變異體包括下列取代之一K71R、K108R、G158D、Y171S、G188A和D343E。在另一種實(shí)施方案中，PS4變異體包括下列取代之一V113I、Y198F、Y198W和V2901。盡管不希望受限于理論，但發(fā)明人提出，與提出的底物模型結(jié)合位點(diǎn)相關(guān)的假單胞菌淀粉酶三維晶體結(jié)構(gòu)(由從ChemicalComputingGroup,Inc.,MontrealCanada獲得的MolecularOperatingEnvironment[MOE]軟件程序得出)提示，殘基位點(diǎn)121、157、223和307將密切接近(closeproximity)底物結(jié)合位點(diǎn)。由于如實(shí)施例所顯示的數(shù)據(jù)證明，G121D既改善酶的穩(wěn)定性又改善外切特異性，G223A改善酶的熱穩(wěn)定性，假定已經(jīng)觀察到改善，并且預(yù)期的位點(diǎn)接近底物結(jié)合位點(diǎn)，進(jìn)一步的改善可以通過在每一這樣的位點(diǎn)制造所有可能的氨基酸替代而獲得。在一種實(shí)施方案中，密切接近是指，特定位點(diǎn)在底物結(jié)合位點(diǎn)的10.0埃之內(nèi)。在另一種實(shí)施方案中，密切接近是指，特定位點(diǎn)在底物結(jié)合位點(diǎn)的7.5埃之內(nèi)。在一種實(shí)施方案中，密切接近是指，特定位點(diǎn)在底物結(jié)合位點(diǎn)的6.0埃之內(nèi)，例如，G121C-a至底物大約5.9埃；G223C-a至底物大約5.82埃。在一種實(shí)施方案中，PS4變異體包括選自下列的組合G134R,A141P,I157L,G223A,H307L，S334P，D343E和G121D;G134R,A141P，1157L，G223A，H307L，S334P，D343E，N33Y和G121D;G134R,A141P,U57L，G223A，H307L，S334P,D343E和N33Y;G134R，A141P,I157L,G223A,H307L,S334P,D343E，N33Y,D34N，K71R，L178F,A179T,G87S，G121D,S214N和T375A;G134R,A141P,I157L,G223A，H307L，S334P，D343E，N33Y，D34N，K71R，L178F，A179T,G121D，Y171S，G188A和N138D;G134R,A141P，I157L,G223A,H307L,S334P,D343E，N33Y，D34N,K71R，L178F,A179T和G121D;G87S，G121D，G134R,A141P,1157L，G223A，H307L,S334P，D343E，N33Y，D34N,K71R,L178F和A179T;G87S,G121D，G134R，A141P，1157L，G223A,H307L,S334P,D343E,N33Y,D34N,K71R,L178F,A179T和G188A;G134R,A141P,I157L,G223A，H307L，S334P,K71R,L178F和A179T;G134R，A141P,I157L,G223A，H307L,S334P，L178F和A179T;G134R，A141P，I157L,G223A，H307L,S334P，N33Y,D34N,L178F禾口A179T;G134R，A141P,1157L，G223A,H307L,S334P,L178F，A179T，G87S和G121D;G134R，A141P,I157L,G223A，H307L，S334P，U78F,A179T和G121D;G134R,A141P，1157L，G223A，H307L，S334P，N33Y,D34N，K71R,L178F,A179T和G121D;G87SG121DG134R,A141PI157LG223AH307LS334PD343EN33YD34NK71RL178FA179T;G87SG121DG134R,A141PI157LG223AH307LS334PK71RL178FA179T;G134R,A141PI157LG223AH307LS334PD343EN33YD34NK71RL178FA179TG121D;和G134R,A141PI157LG223AH307LS334PK71RL178FA179TG121D。在另一種實(shí)施方案中，至少一種取代包括選自下列的組合A141P,1157L，G223A,H307L和S334P;G121D,G134R,A141P,U57L，G223A，H307L和S334;G87S,G121D，G134R,A141P，I157L,G223A,H307L和S334P;G134R，A141P，I157L,L178F,A179T，G223A,H307L和S334P;G87S,G121D，G134R,A141P，I157L,L178F，A179T,G223A,H307L禾口S334P;G121D，G134R,A141P，I157L,L178F，A179T,G223A,H307L和S334P;N33Y,D34N,G134R,A141P,1157L，L178F,A179T，G223A,H307L禾口S334P;N33Y，D34N,G121D，G134R,A141P,I157L,L178F，A179T，G223A，H307L和S334P;和N33Y，D34N,G87S,G121D，G134R,A141P，I157L,L178F，A179T，G223A,H307L和S334P。在另一種實(shí)施方案中，含有至少一個(gè)取代的外切淀粉酶包括選自下列的組合N33Y,D34N,G134R，A141P，1157L，L178F，A179T，G223A,H307L和S334P;N33Y,D34N,G87S,G121D,G134R，A141P，I157L,L178F，A179T，G223A,H307L和S334P;和N33Y，D34N,G87S,G121D,G134R，A141P,I157L,L178F，A179T，G223A,H307L和S334P。在另一種實(shí)施方案中，含有至少一個(gè)取代的外切淀粉酶包括選自下列的組合.-G87S，VI131，G134R,A141P,1157L，Y198F,G223A，V290I,H307L,S334P和D343E;113F，A141P，1157L，Y198F，G223A，V2卯I，H307L，S334P和D343E;A99V，V113I,A141P,1157L，Y198F，G223A，V290I,H307L,S334P和D343E;VI131，1157L，Y198F，G223A,V290I,H307L，S334P和D343EVI131,G134R,A141P，I157L,Y198F,G223A，V2卯I，H307L,S334P和D343E;A141P，I157L,Y198F，G223A,V290I,H307L,S334P和D343E;A199V，D343E，VI131，A141P,1157L，Y198F,G223A,V290I,H307L和36S334P;VI131,A141P,1157L，Y198F，G223A,V290I,S334P和D343E;VI131，G121D，G134R,A141P，I157L,Y198F,G223A，V290I,H307L，S334P和D343E;V113I,G121D,G134R，A141P，I157L,Y198F，G223A，V290I,H307L，S334P和D343E;VI131，A141P，I157L,Y198F，G223A，V2卯I，H307L，S334P和D343E;V113I,A141P,Y198F,G223A，V290I和H307L;V113I,A141P,Y198F,G223A,V290I,S334P和D343E;V113I,A141P,Y198F，G223A，A268P,V2卯I和S399PV113I,A141P,Y198F，G223A，V290I和S399P;V113I,A141P,Y198W,G223A和V2卯I;V113I,A141P,Y198F，G223A和V290I;Y198F,G223A和V2卯I;Y198W，G223A和V290I;VI131,A141P,1157L，Y198F，G223A和V290I;V113M;V113A;VI131,G134R，A141P，1157L，Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P和D343E;VI131，G134R，A141P,I157L,Y198F,G223A，V290I,H307L,1315V，S334P和D343E;D34N，VI131，G134R,A141P，1157L，Y198F，G223A，V290I,H307L，S334P和D343E;VI131，G134R,A141P,I157L,G188S,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P和D343E;K71R，V113I,G134R,A141P，1157L，L178L，Y198F,G223A,V2卯I，H307L,G313G,S334P和D343E;D34N,VI131，G134R，A141P,I157L,Y198F，G223A，V2卯I，H307L,G313G,S334P和D343E;VI131，G134R，A141P,1157L，A179V，Y198F,G223A,V2卯I，H307L,S334P和D343E;V113I，G134R,A141P，I157L,I簡，Y198F，G223A,V290I,H307L,G313QS334P和D343EVI131，G134R，A141P，I157L,A179V，Y198F，G223A，V2頻，H307L，G313G，S334P和D343E;G87S,V113I,G134R，A141P，I157L,Y198F，G223A，V290I,H307L，S334P和D343E;V113I,G134R,A141P，I157L,Y198F，G223A，V290I,H307L，S334P,D343E和A405E;V113I,G134R,A141P，1157L，Y198F,G223A,V290I,H307L，S334P，D343E和A405V;A141P,1157L，Y198F，G223A，V290I,H307L，S334P和D343E;VI131,G134R，A141P,I157L,Y198L,G223A,V290I,H307L，S334P禾口D343E;VI131,G134R,A141P，I157L,Y198F,G223A，V290I,H307L，S334P和D343E;K71R,VI131，G134R,A141P，1157L，Y198F,G223A,V290I,H307L，S334P和D343E;K雨R，V113I,G134R，A141P,U57L，Y198F，G223A,V2簡,H307L,S334P和D343E;D34G，VI131，G134R，A141P，1157L，Y198F，G223A，V290I,H307L,S334P和D343E;G4D,V113I,A141P，1157L，Y198F,G223A，V290I,H307L，S334P和D343E;A141P,G134R,G223A，H307L,1157L，V113I，V290I,Y198F和G188A;在優(yōu)選的實(shí)施方案中，PS4變異體是包括SEQIDNO:2;SEQIDNO:3;SEQIDNO:4;SEQIDNO4a，SEQIDNO4b，SEQIDNO4c，SEQIDNO:8，SEQIDNO:9或SEQIDNO:10的氮基酸序列。PS4變異體多肽可以包括除上面列出的那些突變之外的一個(gè)或多個(gè)突變。也可以包括在一個(gè)或多個(gè)其它位置的其它突變?nèi)鐒h除、插入、取代、顛換、轉(zhuǎn)換和倒轉(zhuǎn)(inversions)。同樣地，多肽可以缺少至少一個(gè)上面列出的取代。PS4變異體也可以包括保守性置換，其可以是類似物-X寸-類似物的取代(例如，堿性對(duì)堿性，酸性對(duì)酸性，極性對(duì)極性等)。非保守性置換也可以發(fā)生，即，從一類殘基變?yōu)榱硪活?，或者替代地，涉及含有非天然的氨基酸如鳥氨酸(此后稱為Z)、二氨基丁酸鳥氨酸(此后稱為B)、正亮氨酸鳥氨酸(norleucineom池ine)(此后稱為O)、吡啶丙氨酸、噻吩丙氨酸、萘基丙氨酸和苯基甘氨酸。序列也可以有氨基酸的刪除、插入或取代，其導(dǎo)致沉默改變(silentchange)并導(dǎo)致功能上的等價(jià)物質(zhì)。有意的氨基酸取代可以基于氨基酸性質(zhì)的相似性而制造(如殘基的極性、電荷、溶解性、疏水性、親水性、和減兼性性質(zhì))，因而以功能基團(tuán)將氨基酸分組是有用的?？梢詢H根據(jù)氨基酸側(cè)鏈的性質(zhì)將氨基酸分組。然而，當(dāng)同時(shí)納入突變數(shù)據(jù)時(shí)，是更加有用的。這樣產(chǎn)生的氨基酸集合由于結(jié)構(gòu)原因可能是保守的。這些集合可以用溫氏圖(Venndiagram)的形式來描述(LivingstoneC.D.和BartonGJ.(1993)"Proteinsequencealignments:astrategyforthehierarchicalanalysisofresidueconservation"Co附戸[說cwd.9:745-756)(TaylorW.R.(1986)"Theclassificationofaminoacidconservation"/r&o:編.119;205-218)。保守性置換可以例如，根據(jù)下面的表來制造，下面的表描述了普遍被接受的氨基酸分類溫氏圖。<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>除氨基酸間隔物(spacers)如甘氨酸或P-丙氨酸殘基之外，變異的氨基酸序列也可以包括在序列的任何兩個(gè)氨基酸殘基之間插入的合適的間隔基團(tuán)，包括烷基如甲基、乙基或丙基。變異的其它形式涉及類肽衍生物形式的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的存在。PS4變異體也可以包括同源序列。同源序列包括這樣的核苷酸序列，它和編碼PS4變異體的核苷酸序列至少75X、80%、85%或90%是相同的，優(yōu)選地至少95%、96%、97%、98%或99%是相同的。通常，同源物將包含編碼與目標(biāo)序列的活性位點(diǎn)相同的序列。同源性比較可以通過目測(cè)來進(jìn)行，或更通常地，在容易得到的序列比對(duì)程序的協(xié)助下進(jìn)行。這些商業(yè)上可以利用的計(jì)算機(jī)程序可以計(jì)算兩個(gè)或更多個(gè)序列之間的同源性百分?jǐn)?shù)(％同源)。同源性百分?jǐn)?shù)可以在連續(xù)序列的范圍內(nèi)計(jì)算，S口，一個(gè)序列和另一序列聯(lián)配，在一個(gè)序列中的每一氨基酸和另一序列中的相應(yīng)氨基酸按每一次一個(gè)殘基來直接進(jìn)行比較。這被稱為"無空位的"(ungapped)聯(lián)配。典型地，這樣的無空位的聯(lián)配僅在相對(duì)短的殘基數(shù)的范圍中進(jìn)行。盡管這是非常簡單和可靠的方法，但它沒有考慮到，例如，在原本相同的序列對(duì)中，一個(gè)插入或一個(gè)刪除將導(dǎo)致其后的氨基酸殘基伸出聯(lián)配之外，因此很可能導(dǎo)致進(jìn)行全面聯(lián)配時(shí)，同源性百分?jǐn)?shù)大大降低。因此，大多數(shù)序列比較方法被設(shè)計(jì)為，可以形成最佳的聯(lián)配，所述聯(lián)配考慮了可能的插入或刪除而不過度罰掉總同源性分?jǐn)?shù)。這是通過在序列聯(lián)配中插入"空位"以試圖最大化局部同源性而獲得的。然而，這些更為復(fù)雜的方法為聯(lián)配中出現(xiàn)的每一空位設(shè)定了"空位罰分"，因而，對(duì)于相同數(shù)目的相同氨基酸，帶有盡可能少的空位的序列聯(lián)配一一反映了兩個(gè)比較序列之間的更高的相關(guān)性一一將得到比帶有許多空位的序列聯(lián)配更高的分?jǐn)?shù)。"仿射空位成本(Affmegapcosts)"通常被應(yīng)用，其對(duì)空位的延伸記入相對(duì)高的成本(cost),對(duì)空位中的每一后續(xù)殘基記入較小的罰分。這是最普遍應(yīng)用的空位記分系統(tǒng)。高的空位罰分將必然地產(chǎn)生帶有較少空位的最優(yōu)化聯(lián)配。大多數(shù)聯(lián)配程序允許修改空位罰分。然而，當(dāng)應(yīng)用這樣的軟件進(jìn)行序列比對(duì)時(shí)，優(yōu)選地應(yīng)用缺省值。例如，當(dāng)應(yīng)用GCGWisconsinBestfit軟件包時(shí)，氨基酸序列的缺省空位罰分是每一空位-12，每一延伸-14。因此，計(jì)算最大同源性百分?jǐn)?shù)首先需要考慮空位罰分，生成最佳的聯(lián)配。進(jìn)行這種聯(lián)配的合適的計(jì)算機(jī)程序是GCGWisconsinBestfit軟件包(Devereuxetal1984Nuc.AcidsResearch12p387)。可以進(jìn)行序列比對(duì)的其它軟件的例子包括但不限于，BLAST軟件包(參見Ausubeletal.,1999ShortProtocolsinMolecularBiology,她Ed-Chapter18),FASTA(Altschuletal.，1990J.Mol.Biol.403-410)和GENEWORKS比對(duì)工具組。BLAST和FASTA可以用于離線和在線檢索(參見Ausubeletal.,i999,ShortProtocolsinMolecularBiology,第7-58至7-60頁)。然而，對(duì)于一些用途，優(yōu)選使用GCGBestfit程序。BLAST2Sequences也可以用于比對(duì)蛋白序列和核苷酸序列(參見FEMSMicrobiolLett1999174(2):247-50;FEMSMicrobiolLett1999177(1):187-8禾口tatiana@ncbi.nlm.nih.gov)。盡管最終的同源性百分?jǐn)?shù)可以以同一性來量度，聯(lián)配過程本身通常地不以全有或全無的(all-or-nothing)配對(duì)比較為基礎(chǔ)。替代地，通常應(yīng)用尺度式相似性記分矩陣(scaledsimilarityscorematrix),其根據(jù)化學(xué)相似性或進(jìn)化距離對(duì)每一兩兩比較設(shè)定分?jǐn)?shù)。通常應(yīng)用的這種矩陣的例子是BLOSUM62矩陣一一BLAST程序組的的缺省矩陣。如果被提供，GCGWisconsin程序通常應(yīng)用公共缺省值或自定義符號(hào)比較表(customsymbolcomparisontable)(關(guān)于進(jìn)一步的細(xì)節(jié)，參見使用指南)。對(duì)于一些用途，GCG軟件包優(yōu)選應(yīng)用公共缺省值，或在其它軟件情況下，優(yōu)選應(yīng)用缺省矩陣，如BLOSUM62。替代地，可以用DNASISTM(HitachiSoftware)中的多重聯(lián)配特征(multiplealignmentfeature)計(jì)算同源性百分?jǐn)?shù)，這基于運(yùn)算法則，其類似于CLUSTAL(HigginsDG&SharpPM(1988)，Gene73(1)，237-244)。一旦軟件生成了最佳聯(lián)配，可能計(jì)算同源性百分?jǐn)?shù)，優(yōu)選地是序列同一性的百分?jǐn)?shù)。軟件通常將此作為序列比對(duì)的一部分來進(jìn)行，并生成數(shù)字結(jié)果。優(yōu)選的實(shí)施方案也包括功能上的等價(jià)物。本文中描述的PS4變異多肽來源于這樣的多肽，或是這樣的多肽的變異體，所述多肽優(yōu)選地顯示出非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶活性。優(yōu)選地，這些親代酶本身是非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶。優(yōu)選實(shí)施方案中的PS4變異多肽也顯示出非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶活性。本文描述的PS4變異體將優(yōu)選地具有外切特異性，例如，如上所述，由外切特異性指數(shù)所量度的，這和它們是外切淀粉酶相一致。而且，與親代酶或它們的起源多肽相比較，它們優(yōu)選地具有更高的或增加的外切特異性。因此，例如，優(yōu)選地在相同條件下，當(dāng)與其親代多肽相比較時(shí)，PS4變異多肽可以具有10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、卯％、100%、200%或更高的外切特異性指數(shù)。優(yōu)選地在相同的條件下，當(dāng)與其親代多肽相比較時(shí)，它們可以有1.5x或更高、2x或更高、5x或更高、10x或更高、50x或更高、100x或更高的外切特異性。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，功能上的等價(jià)物將和PS4家族的至少一個(gè)成員有序列同源性。功能上的等價(jià)物將和上面提及的嗜糖假單胞菌和施氏假單胞菌非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶中的任一個(gè)具有序列同源性，優(yōu)選地，和兩者都具有序列同源性。功能上的等價(jià)物也可以和SEQIDNOs:l至12中列出的任意序列，優(yōu)選地和SEQIDNO:1或SEQIDNO:7或兩者具有序列同源性。這些序列之間的序列同源性優(yōu)選地至少是60%、優(yōu)選地是65%或更多、優(yōu)選地是75%或更多、優(yōu)選地是80%或更多、優(yōu)選地是85%或更多、優(yōu)選地是90%或更多、優(yōu)選地是95%或更多。在其它實(shí)施方案中，功能上的等價(jià)物將能夠特異地和上面列出的任意序列雜交。確定一個(gè)序列是否能夠和另一序列雜交的方法是本領(lǐng)域中已知的，例如，描述于Sambrooketal(上述)和Ausubel,F.M.etal.(上述)中。在高度優(yōu)選的實(shí)施方案中，功能上的等價(jià)物將能夠在嚴(yán)緊的條件下雜交，例如，在65。C和0.1xSSC時(shí)OxSSC=0.15MNaCl,0.015M擰檬酸三鈉pH7.0}?？梢詮暮线m的來源制備/分離氨基酸序列，或可以通過合成方法來制備或可以通過應(yīng)用重組DNA技術(shù)制備氨基酸序列。幾種方法描述于下。2.對(duì)本發(fā)明核酸的詳述在第二方面，本發(fā)明提供了核酸，該核酸編碼包括PS4變異體的多肽，所述多肽可來源于親代多肽，如上所述。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將意識(shí)到核酸序列和多肽序列之間的關(guān)系，具體來說，是遺傳密碼和此密碼簡并性之間的關(guān)系，并且能夠容易地構(gòu)建出這樣的PS4核酸。例如，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將意識(shí)到，對(duì)于PS4變異多肽序列中的每一氨基酸取代，可以有一個(gè)或多個(gè)密碼子，所述密碼子編碼該取代的氨基酸。因此，顯而易見的是，根據(jù)有關(guān)具體氨基酸殘基的密碼子簡并性，對(duì)應(yīng)于PS4變異多肽序列可以生成一個(gè)或多個(gè)PS4核酸序列。因此，例如，PS4變異核酸序列可以來源于編碼多肽的親代序列，其中PS4變異核酸編碼下列位點(diǎn)的氨基酸取代-G134、A141、1157、G223、H307、S334、N33禾QD34，同時(shí)帶有L178和A179的取代中的一個(gè)或兩個(gè)。氨基酸序列和核酸序列的突變可以用許多技術(shù)形成，如本領(lǐng)域所知的那些。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，應(yīng)用合適的引物，通過PCR方法(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))將突變導(dǎo)入親代序列，如實(shí)施例所說明?？梢栽诎被崴交蚝怂崴叫揎椨H代酶，生成本文描述的PS4變異體序列。因此，本發(fā)明的本方面的優(yōu)選實(shí)施方案提供了產(chǎn)生PS4變異多肽，這是通過在編碼非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶多肽的核苷酸序列處導(dǎo)入一個(gè)或多個(gè)相應(yīng)的密碼子變化來實(shí)施的。將被理解的是，上面的密碼子變化可以在任意PS4家族核酸序列中進(jìn)行。例如，可以對(duì)嗜糖假單胞菌和施氏假單胞菌非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶核酸序列進(jìn)行序列變化(例如，X16732，SEQIDNO:6或M24516，SEQIDNO:12)。親代酶可以包括"完全的"酶，即，以其全長存在，如在天然中發(fā)生的(或有突變的)，或可以包括其截短形式。因而，來源于此的PS4變異體可以是被截短的或是"全長的"。截短可以在N末端或C末端。親代酶或PS4變異體可以缺乏一個(gè)或多個(gè)部分(portions),如子序列、信號(hào)序列、結(jié)構(gòu)域或部分(moieties)，不論它們有無活性。例如，如上所述，親代酶或PS4變異多肽可以缺乏信號(hào)序列。替代地，或附加地，親代酶或PS4變異體可以缺乏一個(gè)或多個(gè)催化結(jié)構(gòu)域或結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在高度優(yōu)選的實(shí)施方案中，親代酶或PS4變異體可以缺乏存在于非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶中的一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)域，如淀粉結(jié)合結(jié)構(gòu)域。例如，PS4多肽可以僅具有達(dá)位點(diǎn)429的序列，這是相對(duì)于SEQIDNO:l中列出的嗜糖假單胞菌非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶的編號(hào)而言的。例如，PS4變異體pSac-d34、pSac-D20、pSac-D14或?qū)嵤├忻枋龅钠渌儺愺w是其中的例子。典型地，PS4變異核苷酸序列是應(yīng)用重組DNA技術(shù)制備的。然而，在一種替代的實(shí)施方案中，可以用本領(lǐng)域中已知的化學(xué)方法，以整體或部分，合成核苷酸序列(參見CaruthersMH"a/.，(1980)iVwdc油5^wpSer215-23禾口HornTa/.，(1980)A^c」c/cfei&yiS^wp225-232)。可以從產(chǎn)生所述酶的任何細(xì)胞或生物體中鑒定和/或分離和/或純化出編碼酶的核苷酸序列，所述酶或是具有本文所定義的特殊性質(zhì)的酶，或是適于修飾的酶如親代酶。在本領(lǐng)域中，用于鑒定和/或分離和/或純化核苷酸序列的各種方法是已知的。作為舉例，一旦鑒定和/或分離和/或純化出合適的序列，可以應(yīng)用制備更多這樣的序列的PCR擴(kuò)增技術(shù)。作為進(jìn)一步的舉例，應(yīng)用來自產(chǎn)生該酶的生物體的染色體DNA或信使RNA，構(gòu)建基因組DNA文庫和/或cDNA文庫。如果酶的氨基酸序列或酶氨基酸序列的一部分是已知的，可以合成標(biāo)記的寡核苷酸探針并用其從生物體制備的基因組文庫鑒定出編碼酶的克隆。替代地，可以用標(biāo)記的寡核苷酸探針鑒定編碼酶的克隆，所述探針包含與另一已知酶基因同源的序列。在后一情況下，應(yīng)用較低嚴(yán)緊性的雜交和洗滌條件。替代地，通過下列步驟鑒定編碼酶的克隆將基因組DNA片段插入表達(dá)載體如質(zhì)粒，用得到的基因組DNA文庫轉(zhuǎn)化酶陰性的細(xì)菌，然后將轉(zhuǎn)化了的細(xì)菌鋪板在瓊脂平板上，所述平板含有酶的底物(例如，麥芽糖)，從而使表達(dá)酶的克隆被鑒定出來。在更進(jìn)一步的選擇方案中，可以通過已確立的標(biāo)準(zhǔn)方法合成制備編碼酶的核苷酸序列，例如，BeucageS.L.etal.(1981)r咖W廳丄efera22，p1859-1869描述的phosphoroamidite方法，或Matthes"(1984)^kffl(9乂3,p801-805描述的方法。在phosphoroamidite方法中，寡核苷酸被合成、純化、退火、連接并克隆入合適的載體中，合成是例如，在自動(dòng)DNA合成儀上進(jìn)行的。核苷酸序列可以是混合的基因組來源和合成來源，混合的合成來源和cDNA來源或混合的基因組來源和cDNA來源，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，通過連接合成的、基因組或cDNA來源的片段而制備。每一被連接的片段對(duì)應(yīng)于整個(gè)核苷酸序列的不同部分。也可以用特定的引物，用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)制備DNA序列，例如US4，683，202或SaikiRK"a/.，(6We"ce(1988)239,pp487-491)所描述。本文描述的核苷酸序列，和適用于本文描述的方法和組合物的核苷酸序列可以包含合成或修飾的核苷酸。對(duì)寡核苷酸的許多不同類型的修飾是本領(lǐng)域中己知的。這些包括甲基膦酸酯和硫代磷酸酯骨架和/或在分子的3'和/或5'末端加入吖啶或聚賴氨酸鏈。對(duì)于本文的目的，應(yīng)該理解，可以用本領(lǐng)域中的任何可利用的方法修飾此處描述的核苷酸序列。為了增強(qiáng)核苷酸的體內(nèi)活性或壽命，可以進(jìn)行這種修飾。本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方案提供了核苷酸序列和核苷酸序列的用途，所述核苷酸序列互補(bǔ)于此處提出的序列，或是其任何衍生物、片段或衍生物。如果序列互補(bǔ)于其片段，則該序列可以被用作探針以鑒定其它生物體中的相似的編碼序列?？梢杂迷S多方法得到與PS4變異體序列不是100%同源的多核苷酸?？梢缘玫酱颂幟枋龅男蛄械钠渌儺愺w，例如，通過用探針雜交從一系列個(gè)體——例如從不同群體的個(gè)體——制備的DNA文庫而得到。此外，可以得到其它同源物，這樣的同源物及其片段通常將能夠選擇性地和本文的序列表中顯示的序列雜交?？梢酝ㄟ^用探針雜交cDNA文庫或基因組DNA文庫得到這樣的序列，所述文庫是從其它物種制備的，在中度至高度嚴(yán)緊的條件下，用包含所附序列表中的任一序列的全部或部分序列的探針雜交這樣的文庫。相似的考慮可以用來獲得本文描述的多肽或核苷酸序列的種同源物(specieshomologues)和等位基因變異體(allelicvariants)。也可以用簡并PCR得到變異體和株/種同源物，簡并PCR應(yīng)用的引物被設(shè)計(jì)成耙向變異體和同源物內(nèi)的序列，所述序列編碼保守的氨基酸序列。用于簡并PCR的引物將包含一個(gè)或多個(gè)簡并位點(diǎn)，并且，將用于嚴(yán)緊條件下，所述條件的嚴(yán)緊性低于用針于已知序列的單一序列引物來克隆序列時(shí)的條件的嚴(yán)緊性。保守序列可以被預(yù)期，例如，通過比對(duì)來自幾個(gè)變異體/同源物的氨基酸序列。用本文描述的本領(lǐng)域中的已知計(jì)算機(jī)軟件，可以進(jìn)行序列聯(lián)配。替代地，可以通過對(duì)特征性序列進(jìn)行定點(diǎn)誘變得到這樣的多核苷酸。這可以用于例如，需要沉默密碼子序列變化(silentcodonsequencechanges)來最優(yōu)化特定宿主細(xì)胞的密碼子偏好的情況，在所述宿主細(xì)胞中多核苷酸序列被表達(dá)。為了導(dǎo)入限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)或改變多核苷酸編碼的多肽的性質(zhì)或功能，其它的序列變化可以被期望。多核苷酸可以被用來生成引物和探針，或多核苷酸可以被克隆入載體，所述引物例如，PCR引物、用于選擇性擴(kuò)增反應(yīng)的引物，所述探針例如，用放射性或非放射性標(biāo)記通過傳統(tǒng)方法進(jìn)行標(biāo)記的探針。這些引物、探針和其它片段的長度將是至少15，優(yōu)選地至少20，例如至少25、30或40個(gè)核苷酸，它們也包括在術(shù)語多核苷酸內(nèi)。多核苷酸如DNA多核苷酸和探針可以重組產(chǎn)生、合成產(chǎn)生或用本領(lǐng)域技術(shù)人員可得到的任何方法產(chǎn)生。通常地，引物將通過合成方法得到，包括每次一個(gè)核苷酸逐步地制備所需的核酸序列。用自動(dòng)技術(shù)完成此合成的技術(shù)是本領(lǐng)域容易得到的。更長的多核苷酸通常用重組方法產(chǎn)生，例如，用PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))克隆技術(shù)?？梢詫⒁镌O(shè)計(jì)為，含有合適的限制性酶識(shí)別位點(diǎn)，以便擴(kuò)增的DNA可以被克隆入合適的克隆載體。優(yōu)選地，變異序列至少和本文提供的序列同樣具有生物學(xué)活性。本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案包括，互補(bǔ)于PS4變異體核酸序列的序列，或能夠雜交于PS4變異體核苷酸序列(包括本文提供的序列的互補(bǔ)序列)的序列，以及互補(bǔ)于能夠和PS4變異體核苷酸序列(包括本文提供的序列的互補(bǔ)序列)雜交的序列的核苷酸序列。優(yōu)選的實(shí)施方案提供了這樣的多核苷酸序列，其能夠在中度至最大嚴(yán)緊的條件下，和本文提供的核苷酸序列雜交。一種優(yōu)選的實(shí)施方案包括這樣的核苷酸序列，其能夠在嚴(yán)緊條件下(例如，5(TC和0.2xSSC),和PS4變異體核酸的核苷酸序列或其互補(bǔ)物雜交。更優(yōu)選地，在高度嚴(yán)緊的條件下(例如，65"和0.1xSSC)，核苷酸序列可以和PS4變異體的核苷酸序列或其互補(bǔ)物雜交。一旦編碼酶的核苷酸序列被分離出來，或推定的編碼酶的核苷酸序列被鑒定出來，則可以使該序列突變，從而制備出酶。因此，可以從親代序列制備出PS4變異體序列。突變可以用合成的寡核苷酸導(dǎo)入。這些寡核苷酸含有在期望的突變位點(diǎn)側(cè)翼的核苷酸序列。Morinaga""/.，(歷ofec/wo/ogy(1984)2，p646-649)中公開了一種合適的方法。Ndson和Long(^^/,'ca/5Zoc/2e/m'^7(1989)，180,p147-151)中描述了將突變導(dǎo)入編碼酶的核苷酸序列的另一種方法。Sarkar禾HSommer(5/otec/zm々wes(1990)，8,p404-407"Themegaprimermethodofsitedirectedmutagenesis")中描述了其它的方法。在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，用于本文描述的方法和組合物的序列是重組序列，即，用重組DNA技術(shù)制備的序列。這種技術(shù)例如在文獻(xiàn)中被說明，例如J.Sambrook，E.F.Frisch，和T.Maniatis,1989，Afo/ecwtorC7ow'"gvJZ^ZwratojAfoww"/,SecondEdition,Books1-3,ColdSpringHarborLaboratoryPress03.對(duì)本發(fā)明組合物的詳述本發(fā)明的第三方面提供了包括多肽的組合物，所述多肽是具有非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶活性的多肽的變異體，本發(fā)明也提供了這種變異多肽和組合物的用途，所述組合物包括多肽變異體和另一組分。本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方案包括PS4變異多肽，任選地加之另外的成分或另外的酶或兩者均加入。除了PS4變異多肽之外，可以加入一種或多種酶，例如，向食品、面團(tuán)制備物、食品原料或淀粉組合物加入?？梢约尤朊鎴F(tuán)的另外的酶包括氧化還原酶、水解酶，例如脂肪酶(諸如能夠水解羧酸酯鍵以釋放羧酸鹽的脂肪酶(EC3丄1)或諸如三?；视椭久?EC3.1.1.3)、半乳糖脂肪酶(EC3.1丄26)、磷脂酶Al(EC3丄1.32)、磷脂酶A2(EC3丄1.4)和脂蛋白脂肪酶A2(EC3丄U4))和酯酶以及糖苷酶如a-淀粉酶、支鏈淀粉酶和木聚糖酶?？梢詰?yīng)用氧化還原酶如麥芽糖氧化酶、葡萄糖氧化酶(EC1丄3.4)、糖氧化酶、甘油氧化酶、吡喃糖氧化酶、半乳糖氧化酶(EC1丄3.10)和己糖氧化酶(ECl丄3.5)來加強(qiáng)面團(tuán)和控制烘焙產(chǎn)品的體積，并可以加入木聚糖酶和其它半纖維素酶改善面團(tuán)操作性、面包屑軟度和面包體積。脂肪酶用作面團(tuán)強(qiáng)化劑和面包屑軟化劑，a-淀粉酶和其它淀粉分解酶可以被加入面團(tuán)以控制面包體積并進(jìn)一步減低面包屑的堅(jiān)硬性?？梢詰?yīng)用的另外的酶可以選自纖維素酶、半纖維素酶、淀粉降解酶、蛋白酶、脂加氧酶。在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，PS4變異多肽可以和淀粉酶組合，具體地，和產(chǎn)麥芽淀粉酶組合。產(chǎn)麥芽a-淀粉酶(葡聚糖1,4-a-麥芽糖水解酶，E.C.3.2丄133)能夠水解直鏈淀粉和支鏈淀粉為a-構(gòu)型的麥芽糖。來自桿菌(EP120693)的產(chǎn)麥芽ci-淀粉酶是商業(yè)上可得到的(NovoNordiskA/S,Denmark),由于其降低淀粉退化(retrogradation)的能力，它作為保鮮劑被廣泛用于烘焙工業(yè)(參見，例如，WO91/04669)。產(chǎn)麥芽a-淀粉酶和環(huán)糊精淀粉葡聚糖轉(zhuǎn)移酶(CGTases)共同擁有幾種特性，包括序列同源性(HenrissatB，BairochA;Biochem.J.,316,695-696(1996))和形成轉(zhuǎn)糖基作用產(chǎn)物(Christophersen,C.，etal.,1997，Starch,vol.50，No.1,39-45)。一種優(yōu)選的實(shí)施方案包括含有PS4變異體多肽和a-淀粉酶或其任意變異體的組合。這種組合被用于食品生產(chǎn)如烘焙。美國專利6,162,628中公開的變異體、同源物和變異體的突變體，可以和本文描述的PS4變異體多肽組合應(yīng)用，該專利的全部公開內(nèi)容在此并入，作為參考。具體地，可以應(yīng)用該文獻(xiàn)所描述的任意多肽，特別是美國專利6,162,628的SEQIDNO:1的變異體，變異位置是在對(duì)應(yīng)于Q13、116、D17、N26、N28、P29、A30、S32、Y33、G34、L35、K40、M45、P73、V74、D76N77、D79、N86、R95、N99、1100、H103、0119、N120、N131、S141、T142、A148、N152、A163、H169、N171、G172、1174、N176、N187、F188、A192、Q201、N203、H220、N234、G236、。247、K249、D261、N266、L268、肪2、N275、N276、V279、N280、V281、D285、N287、F297、Q299、固5、K316、N320、L321、N327、A341、N342、A348、。365、N371、N375、M378、G397、A381、F389、N401、A403、K425、N436、S442、N454、N468、N474、S479、A483、A486、V487、S493、T494、S495、A496、S497、A498、Q500、N507、1510、N513、K520、。526、A555、A564、S573、N575、Q581、S583、F586、K589、N595、G618、N621、Q624、A629、F636、K645、N664和/或T681的任何一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)。另外的酶可以和任何面團(tuán)組分共同加入，所述面團(tuán)組分包括面粉、水或任選的其它組分或添加劑或面團(tuán)改良組合物?？梢栽诿娣?、水或任選的其它組分或添加劑或面團(tuán)改良組合物之前或之后加入另外的酶。另外的酶可以是液體制備物，或干燥組合物的形式。在面團(tuán)狀態(tài)下，面團(tuán)改良組合物的一些酶能夠彼此相互作用，達(dá)到一種程度，其中對(duì)面粉面團(tuán)的流變學(xué)禾El/或機(jī)械力(machineability)性質(zhì)和/或通過酶由面團(tuán)制備的產(chǎn)品的質(zhì)量的改善效應(yīng)不僅僅是附加的，而且該效應(yīng)是協(xié)同的。由面團(tuán)制成的產(chǎn)品(成品)被改善，與之相關(guān)的是，發(fā)現(xiàn)上述聯(lián)合對(duì)面包屑結(jié)構(gòu)也產(chǎn)生了實(shí)質(zhì)上的協(xié)同效應(yīng)。同時(shí)，就烘焙產(chǎn)品的比體積而言，也可以發(fā)現(xiàn)協(xié)同效應(yīng)。4.載體、細(xì)胞和表達(dá)PS4多肽的方法第四方面提供了包括PS4變異多肽的載體、包含PS4變異多肽的細(xì)胞和表達(dá)PS4變異多肽的方法。用于本文描述的方法和組合物的核苷酸序列可以被整合入重組的可復(fù)制載體。載體可以被用來在相容的宿主細(xì)胞中和/或從相容的宿主細(xì)胞，復(fù)制和以酶的形式表達(dá)核苷酸序列?？梢杂谜{(diào)控序列如調(diào)節(jié)序列來調(diào)控表達(dá)。根據(jù)序列和/或應(yīng)用的載體，通過表達(dá)核苷酸序列而由宿主重組細(xì)胞產(chǎn)生的酶可以被分泌或包含在細(xì)胞內(nèi)。編碼序列可以被設(shè)計(jì)為帶有信號(hào)序列，信號(hào)序列指導(dǎo)序列編碼物分泌穿過特定的原核或真核細(xì)胞膜。多核苷酸可以被整合入重組的可復(fù)制載體。載體可以被用于在相容的宿主細(xì)胞中復(fù)制核酸。包含多核苷酸序列的載體可以被轉(zhuǎn)化入合適的宿主細(xì)胞。合適的宿主細(xì)胞可以包括細(xì)菌、酵母、昆蟲和真菌細(xì)胞?？梢酝ㄟ^將多核苷酸導(dǎo)入可復(fù)制載體，將載體導(dǎo)入相容性宿主細(xì)胞，并使宿主細(xì)胞在載體可復(fù)制的條件下生長，表達(dá)PS4變異多肽和多核苷酸。載體可以從宿主細(xì)胞回收。PS4核酸可以被可操作地連接于在感興趣的宿主細(xì)胞中有活性的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件和翻譯調(diào)節(jié)元件。PS4核酸也可以編碼融合蛋白，融合蛋白包括信號(hào)序列如，例如，來自^/wawrn'om;^"o"/Je"to/^的葡糖淀粉酶基因，來自釀酒酵母"acc/zarom，escerev&^)的a-因子接合型基因(a-factormatingtypegene)禾口來自米曲霉(^sperg說附o^ct^)的TAKA-淀粉酶的信號(hào)序列。替代地，PS4核酸可以編碼融合蛋白，融合蛋白包含膜結(jié)合結(jié)構(gòu)域。用表達(dá)載體，可以按期望的水平在宿主生物體內(nèi)表達(dá)PS4變異體。包含pS4核酸的表達(dá)載體可以是，能夠在選出的宿主生物體內(nèi)表達(dá)編碼PS4核酸的基因的任何載體，載體的選擇取決于欲被導(dǎo)入的宿主細(xì)胞。因此，載體可以是自主復(fù)制的載體，即，以附加型實(shí)體(印isomalentity)存在的載體，其復(fù)制獨(dú)立于染色體復(fù)制，如，例如，質(zhì)粒、噬菌體或附加體元件、微型染色體或人工染色體。替代地，載體可以是這樣的載體，當(dāng)其被導(dǎo)入細(xì)胞時(shí)，其整合入宿主基因組并和染色體一同復(fù)制。表達(dá)載體通常包括克隆載體的組件如，例如，允許載體在選出的宿主生物體中自主復(fù)制的元件，和一種或多種用于篩選目的的表型上可檢測(cè)的標(biāo)記。表達(dá)載體通常包括調(diào)控核苷酸序列，所述序列編碼啟動(dòng)子、操縱子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、翻譯起始信號(hào)和任選地，阻遏基因或一個(gè)或多個(gè)激活基因(activatorgenes)。另外，表達(dá)載體可以包括編碼氨基酸序列的序列，所述氨基酸序列能夠?qū)S4變異體靶向至宿主細(xì)胞的細(xì)胞器如過氧化物酶體，或靶向至特定的宿主細(xì)胞區(qū)室。這樣的靶向序列包括但不限于序列SKL。為了在調(diào)控序列的指導(dǎo)下進(jìn)行表達(dá)，PS4變異體的核酸序列以適于表達(dá)的合適方式被可操作地連接于調(diào)控序列。優(yōu)選地，載體中的多核苷酸被可操作地連接于調(diào)控序列，調(diào)控序列能夠使宿主細(xì)胞表達(dá)編碼序列，即，載體是表達(dá)載體。調(diào)控序列可以被修飾，例如通過加入另外的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件來修飾，使調(diào)控序列所指導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄水平對(duì)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物更加具有反應(yīng)性。調(diào)控序列可以特別地包括啟動(dòng)子。在載體中，編碼變異的PS4多肽的核酸序列可操作地和合適的啟動(dòng)子序列聯(lián)合。啟動(dòng)子可以是任何DNA序列，其在選出的宿主生物體內(nèi)具有轉(zhuǎn)錄活性，并且可以從和宿主生物體同源或異源的基因中得到。用于指導(dǎo)修飾的核苷酸序列轉(zhuǎn)錄——例如指導(dǎo)PS4核酸在細(xì)菌宿主中轉(zhuǎn)錄——的合適的啟動(dòng)子的例子包括，大腸桿菌(Eco/Z)/ac操縱子的啟動(dòng)子、藍(lán)色鏈霉菌(6^印to"^cMcoe/z'co/wO瓊脂糖酶基因d"g^啟動(dòng)子、地衣芽孢桿菌(Ba"7/似/aem/c&)a-淀粉酶基因(amyL)啟動(dòng)子、枯草芽孢桿菌(B鎖7/wrato7/)的aprE啟動(dòng)子、嗜熱脂肪芽孢桿菌(&c!7/附5feara論mw//w7w力產(chǎn)麥芽淀粉酶基因(amyM)啟動(dòng)子、液化淀粉芽孢桿菌C8a"7/MSw，/o//，e/a"'em)a-淀粉酶基因(amyQ)啟動(dòng)子、枯草芽孢桿菌(5ac///^rato'fc)jc;/"和砂W基因的啟動(dòng)子和來自乳球菌屬某種(Z""o""wsp.)衍生啟動(dòng)子的啟動(dòng)子，包括P170啟動(dòng)子。當(dāng)編碼PS4變異體多肽的基因在細(xì)菌如大腸桿菌中表達(dá)時(shí)，可以從例如噬菌體啟動(dòng)子選擇合適的啟動(dòng)子，噬菌體啟動(dòng)子包括T7啟動(dòng)子和噬菌體入啟動(dòng)子。對(duì)于在真菌中的轉(zhuǎn)錄，有用啟動(dòng)子的例子是那些來自編碼下列的基因的啟動(dòng)子米曲霉TAKA淀粉酶、米赫根毛霉(朋izom^wmzWze/)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉(^^wg說^m'gw)中性a-淀粉酶、黑曲霉酸穩(wěn)定a-淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米赫根毛霉脂肪酶、米曲霉堿性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖異構(gòu)酶或構(gòu)巢曲霉04wew7/MM油tom)乙酰胺酶。用于在酵母中的表達(dá)的合適的啟動(dòng)子的例子包括但不限于釀酒酉孝母(Sacc/7araw少CM"Ww'"e)的Gall禾BGal10啟動(dòng)子，禾n尸!'c/2/ap^to^爿aw或^ao啟動(dòng)子。合適的細(xì)菌宿主生物體的例子是，革蘭氏陽性菌如芽孢桿菌C8acz7/flceae)，包括枯草芽孢桿菌(5^7'//^^Mfc)、地衣芽孢桿菌(Sa"'〃M//c/zem/onw》、遲緩芽包桿菌(5a"7/船fe"m力、短芽孢桿菌(5ac/〃w6/^v&)、嗜熱月旨肪芽孢桿菌0S""7/"s1s/eflra//7enwo//7//MS)、嗜堿芽孢桿菌(Bac///wa汰a/opMws)、解淀粉芽孢桿菌(5a"7/船a附y(tǒng)/o/z々we/a",e/w)、凝結(jié)芽孢桿菌(5ac/〃z^coagw/(my)、燦爛芽孢桿菌(B"c/〃ws/"w/附)、巨大芽孢桿菌CS(3C"/wsmega^7'Mm)禾Q蘇云金芽孢桿菌CBa"'〃Msf/zwn'"g^似^)，鏈霄菌屬(5^e//cwyc")的菌禾中如6Vre/7tom7cesw訓(xùn)'w做，乳酸菌種包括乳球菌(丄flCtoCOCCM)如乳酸乳球菌(丄flctococcw5/acfc)、孚L桿菌(Lacto6ad//w;^p.)包括羅伊乳桿菌(丄a"。6ac飾s固fm')，明串珠菌屬(丄ewco薩toc卿.)，片球菌屬(P^/zbcoccMJ^/7.)和鏈球菌屬0S"/reptococcw^;.)。替代地，屬于包括大腸桿菌在內(nèi)的腸桿菌屬(^7tera^cten'aceae)或?qū)儆诩賳伟鷮?i^M6fomom^flceae)的革蘭氏陰性菌種的菌株可以被選作宿主生物體。合適的酵母宿主生物體可以選自生物技術(shù)上相關(guān)的酵母菌種，例如但不限于酵母菌種如畢赤酵母(尸/c/n'a平)、漢遜酵母(/forae肌^印)或克魯維酉孝母(A7^veramycey)、菌禾中或酉孝母菌(Sacc/wro^yces)禾中包括酉良酒酉孝母OSflcc/2ara77^ca5:cerev/s/ae)或?qū)儆赟c/w'zo犯cc/zaromyce的禾中例如，裂殖酵母OS.尸ompe)菌種。優(yōu)選地，甲基營養(yǎng)酵母種巴氏畢赤酵母(巧d^p^to^)的菌株被用作宿主生物體。優(yōu)選地，宿主生物體是漢森酵母(i^似e""/a)菌種。在絲狀真菌中合適的宿主生物體包括曲霉菌(As/7erg/〃z^)禾中，例如，黑曲霉(y^;e^g7'〃z^m'ge。、米曲霉(y^/erg/〃wor_yz—、^^sperg///^fwZ)/ge服》、Aperg〃/附或/1sperg///^"/^/Amy。替代地，鐮刀霉(7^rar/ww)種的菌株例如尖孢鐮刀菌(尸w",/wwox3Asporwm)或根毛霉(i/n'zomMco)禾中的菌株例如米赫根毛霉(i/H'zomwcor朋W^')可以被用作宿主生物體。其它合適的菌株包括高溫菌(T7ze〃"om;^M)禾P毛霄菌(Afweor)菌禾中。包含多核苷酸的宿主細(xì)胞可以被用于表達(dá)多肽，例如變異的PS4多肽、其片段、同源物、變異體或衍生物。可以在允許蛋白表達(dá)的合適條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞。多肽的表達(dá)可以是組成型的，這樣它們被持續(xù)產(chǎn)生，或是誘導(dǎo)型的，這需要刺激以起始表達(dá)。在誘導(dǎo)型表達(dá)的情況下，可以在需要時(shí)起始蛋白表達(dá)，這是通過例如，向培養(yǎng)基中加入誘導(dǎo)物質(zhì)，例如地塞米松或IPTG實(shí)施的。用本領(lǐng)域已知的各種技術(shù)將多肽從宿主細(xì)胞中提取出來，包括酶學(xué)的、化學(xué)的和/或滲透壓裂解和物理破解。多肽也可以在體外無細(xì)胞系統(tǒng)中重組產(chǎn)生，如TnN(Promega)兔網(wǎng)織紅細(xì)胞系統(tǒng)。5.用途如果上下文沒有其它指明，在下面的描述和實(shí)施例中，PS4變異體多肽的劑量是以在面粉中的百萬比率(每克中的微克數(shù))給出的。例如，如表2中使用的"1D34"是指，1百萬分之一的pSac-D34。本文描述的PS4取代突變體可以被用于親代酶適用的各種用途。具體地，它們可以被用于應(yīng)用外切麥芽四糖水解酶的任何用途。在高度優(yōu)選的實(shí)施方案中，它們具有額外的優(yōu)勢(shì)更高熱穩(wěn)定性、或更高外切淀粉酶活性或更高pH穩(wěn)定性或任何組合。PS4變異多肽和核酸的合適用途的例子包括食品生產(chǎn)，特別是烘焙，以及食品原料生產(chǎn)；進(jìn)一步的實(shí)施例詳細(xì)描述于下。下述系統(tǒng)被用于表征具有非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶活性的多肽，所述多肽適于按照本文描述的方法和組合物被應(yīng)用。此系統(tǒng)可以，例如被用于表征本文描述的PS4親代或變異多肽。作為初步的背景信息，蠟質(zhì)玉米支鏈淀粉(waxymaizeamylopectin)(WAXILYS200，從Roquette,France得至lj)是具有高支鏈淀粉含量(高于90%)的淀粉。將20mg/ml的蠟質(zhì)玉米淀粉在pH6.0的50mMMES(2-(N-嗎啉)乙磺酸)，2mM氯化鈣緩沖液中煮沸3分鐘，隨后在5(TC溫育并在半小時(shí)內(nèi)應(yīng)用。一個(gè)單位的非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶被定義為在5(TC，在試管中與4ml10mg/ml蠟質(zhì)玉米淀粉溫育時(shí)，釋放相當(dāng)于每分鐘1ymol還原糖的水解產(chǎn)物的酶量，蠟質(zhì)玉米淀粉如上所制備溶于pH6.0的50mMMES、2mM氯化鈣中。還原糖是用麥芽糖作為標(biāo)準(zhǔn)并用Bemfdd，Me//wA￡^ymo/.，(1954)，1,149-158的二硝基水楊酸法或本領(lǐng)域已知的用于定量還原糖的其它方法測(cè)定的。非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶的水解產(chǎn)物情況是如下測(cè)定的在50°C，在試管中，溫育0.7單位的非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶和4ml10mg/ml蠟質(zhì)玉米淀粉15或300分鐘，蠟質(zhì)玉米淀粉如上述制備溶于緩沖液中。將試管在沸騰的水浴中浸沒3分鐘，以終止反應(yīng)。用陰離子交換HPLC分析和定量水解產(chǎn)物，用DionexPA100柱，用乙酸鈉、氫氧化鈉和水作為洗脫液，脈沖電流檢測(cè)，以從葡萄糖到麥芽七糖的已知線性麥芽寡糖作為標(biāo)準(zhǔn)。用于麥芽八糖至麥芽十糖的響應(yīng)因子(responsefactor)是麥芽七糖的響應(yīng)因子。優(yōu)選地，PS4親代多肽(和PS4變異多肽)具有非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶活性，以致于如果0.7單位的所述非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶在pH6.05(TC下在4ml水溶液中溫育15分鐘時(shí)，則酶將產(chǎn)生水解產(chǎn)物，所述水溶液為每毫升緩沖液中有1011^預(yù)煮沸蠟質(zhì)玉米淀粉，緩沖液含有50111]\12-^-嗎啉)乙磺酸和2mM氯化鈣，所述水解產(chǎn)物由一個(gè)或多個(gè)線性麥芽寡糖組成，線性麥芽寡糖是從兩個(gè)至十個(gè)D-吡喃葡萄糖基單位(D-glucopyranosylunits)，可任選地有葡萄糖；以致于由從兩個(gè)至十個(gè)D-吡喃葡萄糖基單位以及可任選的葡萄糖組成的所述水解產(chǎn)物中的至少60%%、至少70%、至少80%和/或至少85%重量是由從三至十個(gè)D-吡喃葡萄糖基單位的線性麥芽寡糖組成，優(yōu)選地由從四至八個(gè)D-吡喃葡萄糖基單位構(gòu)成的線性麥芽寡糖組成。為了便于參照，和針對(duì)本應(yīng)用，在pH6.05(TC下在4ml水溶液中溫育0.7單位的非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶15分鐘，可以被稱為"蠟質(zhì)玉米淀粉溫育實(shí)驗(yàn)"(WaxyMaizeStarchIncubationTest),所述水溶液是每毫升緩沖液中含有l(wèi)Omg預(yù)煮沸蠟質(zhì)玉米淀粉，緩沖液含有50mM2-(N-嗎啉)乙磺酸和2mM氯化f丐。因此，換一種表達(dá)，優(yōu)選的非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶被表征為，在蠟質(zhì)玉米淀粉溫育實(shí)驗(yàn)中有能力產(chǎn)生水解產(chǎn)物，所述產(chǎn)物由一個(gè)或多個(gè)線性麥芽寡糖組成，線性麥芽寡糖從兩個(gè)至十個(gè)D-吡喃葡萄糖基單位，任選地是葡萄糖；以致于由從兩個(gè)至十個(gè)D-吡喃葡萄糖基單位，任選地是葡萄糖組成的所述水解產(chǎn)物中的至少60%%、至少70%、至少80%和/或至少85%重量份是由從三至十個(gè)D-吡喃葡萄糖基單位的線性麥芽寡糖組成的，優(yōu)選地由從四至八個(gè)D-吡喃葡萄糖基單位的線性麥芽寡糖組成。蠟質(zhì)玉米淀粉溫育實(shí)驗(yàn)中的水解產(chǎn)物包括從兩個(gè)至十個(gè)D-吡喃葡萄糖基單位的一種或多種線性麥芽寡糖，以及任選的葡萄糖。蠟質(zhì)玉米淀粉溫育實(shí)驗(yàn)中的水解產(chǎn)物也可以包括其它水解產(chǎn)物。而且，三個(gè)至十個(gè)D-吡喃葡萄糖基單位的線性麥芽寡糖的重量百分?jǐn)?shù)是以這樣的水解產(chǎn)物的量為基礎(chǔ)的，所述水解產(chǎn)物由兩個(gè)至十個(gè)D-吡喃葡萄糖基單位的一種或多種線性麥芽寡糖以及任選的葡萄糖組成。換言之，三個(gè)至十個(gè)D-吡喃葡萄糖基單位的線性麥芽寡糖的重量百分?jǐn)?shù)不是以除了兩個(gè)至十個(gè)D-吡喃葡萄糖基單位的一種或多種線性麥芽寡糖和葡萄糖之外的水解產(chǎn)物的量為基礎(chǔ)的?？梢杂萌魏魏线m的方法分析水解產(chǎn)物。例如，可以用DionexPA100柱經(jīng)陰離子交換HPLC分析水解產(chǎn)物，用脈沖電流檢測(cè)并用例如已知的葡萄糖到麥芽七糖的線性麥芽寡糖作為標(biāo)準(zhǔn)。優(yōu)選地，本文描述的PS4變異體在烘焙期間是有活性的，在淀粉顆粒的糊化期間及之后水解淀粉，所述糊化在大約55。C的溫度時(shí)幵始。非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶越耐熱，其具有活性的時(shí)間越長，因此其將提供更強(qiáng)的保鮮效應(yīng)。然而，在高于大約85"C的溫度下烘焙時(shí)，可能發(fā)生酶的失活。如果發(fā)生了酶的失活，非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶可以被逐漸失活，以致于在烘焙過程之后在最終的面包中基本上沒有活性。因此，優(yōu)選地，適于如描述地應(yīng)用的非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶的最適溫度是高于5450。C和低于98。C。通過確定總淀粉酶活性比總內(nèi)切淀粉酶活性的比值，可以有效地測(cè)定外切特異性。該比值在本文中被稱為"外切特異性指數(shù)"。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，如果酶的外切特異性指數(shù)是20或更多，gp，其總淀粉酶活性(包括外切淀粉酶活性)是其內(nèi)切淀粉酶活性的20倍或更多，則認(rèn)為該酶是外切淀粉酶。在高度優(yōu)選的實(shí)施方案中，外切淀粉酶的外切特異性指數(shù)是30或更多、40或更多、50或更多、60或更多、70或更多、80或更多、90或更多、或100或更多。在高度優(yōu)選的實(shí)施方案中，外切特異性指數(shù)是150或更多、200或更多、300或更多、或400或更多?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域中己知的任何方法測(cè)定總淀粉酶活性和內(nèi)切淀粉酶活性。例如，可以通過分析從淀粉底物釋放的還原末端的總數(shù)，測(cè)定總淀粉酶活性。替代地，在實(shí)施例中進(jìn)一步詳述了Betamyl分析的應(yīng)用，為了方便，在表格和圖中，以術(shù)語"Betamyl單位"描述如實(shí)施例中分析的淀粉酶活性?？梢杂肞hadebas試劑盒(PharmaciaandUpjohn)分析內(nèi)切淀粉酶活性。這利用的是藍(lán)色標(biāo)記的交聯(lián)淀粉(用偶氮染料標(biāo)記)；僅淀粉分子中的內(nèi)部切割釋放標(biāo)記，而外部切割不釋放這樣的標(biāo)記。染料的釋放可以用分光光度法測(cè)定。因此，Phadebas試劑盒測(cè)定內(nèi)切淀粉酶活性，為了方便，這樣的分析的結(jié)果(描述于實(shí)施例中)在本文中稱為"Phadebas單位"。因此，在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，外切特異性指數(shù)被表示為術(shù)語Betamyl單位/Phadebas單位(BetamylUnits/PhadebasUnits)。也可以根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)中描述的方法分析外切淀粉酶活性，例如，在公布號(hào)WO99/50399中描述的方法。這是通過內(nèi)切淀粉酶活性比外切淀粉酶活性之比的方式測(cè)定外切特異性。因此，在一個(gè)優(yōu)選的方面，本文描述的PS4變異體將是，每單位外切淀粉酶活性對(duì)應(yīng)有少于0.5個(gè)內(nèi)切淀粉酶單位(EAU)。優(yōu)選地，適于本發(fā)明的應(yīng)用的非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶，每單位外切淀粉酶活性對(duì)應(yīng)有少于0.05EAU，更優(yōu)選地，每單位外切淀粉酶活性對(duì)應(yīng)有少于0.01EAU。PS4變異多肽、核酸、宿主細(xì)胞、表達(dá)載體等，可以被用于應(yīng)用淀粉酶的任何用途。具體地，它們可以被用于替代任何非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶。它們可以被用于補(bǔ)充淀粉酶或非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶活性，不論是單獨(dú)應(yīng)用或是和其它已知淀粉酶或非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶聯(lián)合應(yīng)用。本文描述的PS4變異序列可以被用于食品工業(yè)中的各種用途一如在烘焙產(chǎn)品和飲料產(chǎn)品中，它們也可以被用于其它用途如藥物組合物,或甚至在化學(xué)工業(yè)中。具體地，PS4變異多肽和核酸用于各種工業(yè)用途，包括烘焙(如WO99/50399中所公開)和面粉標(biāo)準(zhǔn)化(體積增加或改進(jìn))。它們可以被用于從淀粉和其它底物產(chǎn)生麥芽四糖。PS4變異多肽可以被用于增加烘焙產(chǎn)品如面包的體積。因此，包括PS4變異多肽或用PS4變異多肽處理的食品產(chǎn)品和未經(jīng)如此處理的產(chǎn)品或用親代多肽處理的產(chǎn)品相比，體積膨脹。換言之，對(duì)于食品產(chǎn)品，每單位食品產(chǎn)品體積中含有更大的空氣體積。替代地，或附加地，用PS4變異多肽處理的食品產(chǎn)品具有更低的密度，或更低的單位體積重量(或質(zhì)量)。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，PS4變異多肽被用于增加面包的體積。體積增加或膨脹是有益的，原因是它降低了食品的黏性或漿糊狀(starchiness)。輕的食品是消費(fèi)者優(yōu)選的，消費(fèi)者的感受會(huì)更好。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，應(yīng)用PS4變異多肽增加了體積10y。、20%、30°/。、40%、50%或更多。本文描述的PS4變異多肽和核酸可以被用作食品一或用在食品的制備中。具體地，它們可以被加入食品，即，作為食品添加劑。在一個(gè)優(yōu)選的方面，食品用于人類消費(fèi)。食品可以是溶液或固體的形式一這取決于用途和/或應(yīng)用的方式和/或給予的方式。PS4變異多肽和核酸可以被用作食物成分。本文公開的PS4變異多肽和核酸可以是食品增補(bǔ)劑一或被加入到食品增補(bǔ)劑。本文公開的PS4變異多肽和核酸可以是功能食品一或被加入到功能食品。PS4變異多肽也可以被用于生產(chǎn)食品或食品原料。典型的食品包括乳制品、肉類產(chǎn)品、家禽產(chǎn)品、魚類產(chǎn)品和面團(tuán)產(chǎn)品。面團(tuán)產(chǎn)品可以是任何處理過的面團(tuán)產(chǎn)品，包括煎的、油炸的、烤的、烘焙的、蒸的和煮的面團(tuán)，如蒸的面包和年糕。在高度優(yōu)選的實(shí)施方案中，食物產(chǎn)品是烘fe廣品。優(yōu)選地，食品是面包產(chǎn)品。典型的面包(烘焙的)產(chǎn)品包括面包一如長方面包、小圓面包、泡夫奶油面包、比薩餅(pizzabases)等，酥皮糕點(diǎn)、椒鹽巻餅、玉米粉圓餅、糕餅、曲奇餅、餅干、脆餅干等等。PS4變異多肽能夠延遲淀粉介質(zhì)如淀粉凝膠的不新鮮化。PS4變異多肽特別能夠延遲淀粉的有害退化。因此，應(yīng)用本文描述的PS4變異多肽，可以延遲或阻止或減慢退化，所述應(yīng)用是在其加工成食品產(chǎn)品的任何時(shí)期加入到淀粉時(shí)發(fā)生的，例如，在烘焙為面包之前、之間或之后。這樣的應(yīng)用在下面被更詳細(xì)地描述。為了評(píng)價(jià)本文描述的具有非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶活性的PS4變異多肽的保鮮效應(yīng)，在烘焙后l、3和7天可以測(cè)定面包屑堅(jiān)硬性，這是用Instron4301UniversalFoodTextureAnalyzer或本領(lǐng)域中的相似設(shè)備進(jìn)行的。在本領(lǐng)域中傳統(tǒng)應(yīng)用的用于評(píng)價(jià)具有非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶活性的PS4變異多肽在淀粉退化中的效應(yīng)的另一方法是以DSC(差示掃描量熱法)為基礎(chǔ)的。在此，在用酶或不帶有酶(對(duì)照)進(jìn)行烘焙的情況下，測(cè)定面包屑中或來自模型體系面團(tuán)(modelsystemdough)的面包屑的退化支鏈淀粉的熔化焓。用于所描述的實(shí)施例中的DSC設(shè)備是Mettler-ToledoDSC820，運(yùn)行的溫度梯度是從20至95°C，每分鐘l(TC。為制備樣品，稱量10-20mg的面包屑，并將其轉(zhuǎn)移至Mettler-Toledo鋁盤(aluminiumpans)，隨后與外界隔絕地密封Mettler-Toledo鋁盤。用于描述的實(shí)施例中的模型體系面團(tuán)含有標(biāo)準(zhǔn)小麥粉和最佳量的水或緩沖液，帶有或不帶有非產(chǎn)麥芽的PS4變異外切淀粉酶。分別將它們?cè)?0或50g布拉班德淀粉測(cè)定記錄儀(BrabenderFarinogmph)中混合6或7分鐘。將面團(tuán)樣品放置在帶蓋的玻璃檢測(cè)管(15M.8cm)中。使這些檢測(cè)管在水浴中遭受烘焙過程，開始時(shí)在33'C溫育30分鐘，接著從33至95'C，梯度是每分鐘l.rC，最后在95。C溫育5分鐘。隨后，在DSC分析之前，在恒溫器中保存所述管于2(TC。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本文描述的PS4變異體相對(duì)于對(duì)照組具有降低的熔化焓。在高度優(yōu)選的實(shí)施方案中，PS4變異體具有10%或更低的熔化焓。優(yōu)選地，與對(duì)照組相比，它們具有20%或更大程度、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更降低的熔化焓。<table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table>表2上面的表2顯示了，用不同劑量PSac-D34制備的模型面團(tuán)體系在存儲(chǔ)7天之后的DSC值。檢測(cè)了面粉的每百萬份中的0.5、1和2份(或微克/克)。PS4變異多肽可以被用來制備食物產(chǎn)品，特別是淀粉產(chǎn)品。方法包括通過向淀粉介質(zhì)中加入非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶如PS4變異多肽，形成淀粉產(chǎn)品。如果淀粉介質(zhì)是面團(tuán)，則面團(tuán)是通過將面粉、水、非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶和任選的其它可能的成分和添加劑混合在一起而制備的，非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶是PS4變異多肽。優(yōu)選的面粉是小麥粉或黑麥粉或小麥粉和黑麥粉的混合物。然而，也可以預(yù)期包含來自其它類型谷物的面粉的面團(tuán)，所述谷物如，例如來自稻、玉米、大麥和高粱。優(yōu)選地，淀粉產(chǎn)品是烘焙產(chǎn)品。更優(yōu)選地，淀粉產(chǎn)品是面包產(chǎn)品。甚至更優(yōu)選地，淀粉產(chǎn)品是烘焙的含淀粉面包產(chǎn)品。因此，如果淀粉產(chǎn)品是烘焙的含淀粉面包產(chǎn)品，則方法包括，在面團(tuán)形成條件下，以任何合適的順序混合面粉、水和發(fā)酵劑，并進(jìn)一步加入PS4變異多肽，優(yōu)選地以預(yù)混合料的形式。發(fā)酵劑可以是化學(xué)發(fā)酵劑如碳酸氫鈉或釀酒酵母(面包酵母)的任何菌株?？梢詫S4變異非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶和包括水在內(nèi)的任何面團(tuán)組分或面團(tuán)組分混合物或者任何添加劑或添加劑混合物一起加入。可以通過在烘焙工業(yè)中或在制造基于面粉面團(tuán)的產(chǎn)品的任何其它工業(yè)中普遍應(yīng)用的任何常規(guī)的面團(tuán)制備方法來制備面團(tuán)。優(yōu)選的實(shí)施方案是這樣的制備面包產(chǎn)品的過程，包括(a)提供淀粉介質(zhì)；(b)向淀粉介質(zhì)加入本文中描述的PS4變異多肽；和(c)在步驟(b)期間或之后向淀粉介質(zhì)施加熱，以產(chǎn)生面包產(chǎn)品。另一優(yōu)選的實(shí)施方案是這樣的制造面包產(chǎn)品的過程，包括向淀粉介質(zhì)加入本文中描述的PS4變異多肽。非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶PS4變異多肽可以以液體制劑或干燥的粉狀組合物的形式加入，其中包含的酶或是作為唯一的活性成分，或是與一種或多種額外的面團(tuán)組分或面團(tuán)添加劑相混合。另一優(yōu)選的實(shí)施方案是這種面包和面團(tuán)改良組合物在烘焙中的應(yīng)用。進(jìn)一步的實(shí)施方案提供了由所述面包改良組合物或面團(tuán)改良組合物得到的烘焙產(chǎn)品或面團(tuán)。另一實(shí)施方案提供了由應(yīng)用面包改良組合物或面團(tuán)改良組合物得到的烘焙產(chǎn)品或面團(tuán)。可以通過混合面粉、水、面團(tuán)改良組合物和任選的其它成分和添加劑來制備面團(tuán)，所述面團(tuán)改良組合物包含PS4變異多肽(如上述)?？梢詫⒚鎴F(tuán)改良組合物和包括面粉、水和任選的其它成分或添加劑的任何面團(tuán)組分一同加入?？梢栽诿娣刍蛩蛉芜x的其它成分和添加劑之前加入面團(tuán)改良組合物。可以在面粉或水或任選的其它成分和添加劑之后加入面團(tuán)改良組合物?？梢酝ㄟ^在烘焙工業(yè)中或在制造基于面粉面團(tuán)的產(chǎn)品的任何其它工業(yè)中普遍應(yīng)用的任何常規(guī)的面團(tuán)制備方法來制備面團(tuán)。面團(tuán)改良組合物可以以液體制備物或干粉組合物的形式加入，其或是包括作為單一活性成分的組合物，或和一種或多種其它面團(tuán)組分或添加劑混合。加入的PS4變異多肽非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶的量通常是，導(dǎo)致在最終面團(tuán)中存在的量是每kg面粉50至100,000單位的量，優(yōu)選地，每kg面粉100至50,000單位。優(yōu)選地，量是在每kg面粉200至20,000單位的范圍內(nèi)。在本文中，1單位的非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶被定義為在5(TC，在試管中和4ml10mg/ml蠟質(zhì)玉米淀粉溫育時(shí)，釋放相當(dāng)于每分鐘1Umol還原糖的水解產(chǎn)物的酶量，所述蠟質(zhì)玉米淀粉溶于如下所述的pH6.0的50mMMES，2mM氯化爭丐中。本文所描述的面團(tuán)通常包括小麥粗粉或小麥面粉和/或其它類型的粗粉、面粉或淀粉如玉蜀黍粉(cornflour)、玉米淀粉、玉米粉(maizeflour)、稻粉、黑麥粗粉、黑麥粉、燕麥粗粉、燕麥粉、高粱粗粉、高粱粉、馬鈴薯粗粉、馬鈴薯粉或馬鈴薯淀粉。面團(tuán)可以是新制的、冷凍的或部分烘焙的。面團(tuán)可以是發(fā)酵了的面團(tuán)或欲被發(fā)酵的面團(tuán)?？梢杂酶鞣N方法發(fā)酵面團(tuán)，如通過加入化學(xué)發(fā)酵劑，例如，碳酸氫鈉或加入酵母(發(fā)酵面團(tuán))，但是優(yōu)選地通過加入合適的酵母培養(yǎng)物發(fā)酵面團(tuán)，如釀酒酵母(baker'syeast)的培養(yǎng)物，釀酒酵母例如，釀酒酵母的商業(yè)上可獲得的菌株。面團(tuán)可以包含脂肪如顆粒狀脂肪或起酥油脂(sh()rtening)。面團(tuán)可以進(jìn)一歩包括另外的乳化劑如甘油一酯或甘油二酯、脂肪酸的糖酯、脂肪酸的多甘油酯、甘油一酯乳酸酯、甘油一酯乙酸酯、聚氧乙烯硬脂酸酯、或溶血卵磷脂。另一實(shí)施方案是預(yù)混合料，其包含面粉，同時(shí)帶有本文描述的組合。預(yù)混合料可以含有其它面團(tuán)改良和/或面包改良添加劑，例如，任何的包括本文提及的酶的添加劑。為了進(jìn)一步改進(jìn)烘焙產(chǎn)品的性質(zhì)和賦予烘焙產(chǎn)品不同的品質(zhì)，可以在面團(tuán)中加入其它的面團(tuán)成分和/或面團(tuán)添加劑。典型地，這類其它的添加的成分可以包括面團(tuán)成分如鹽、谷物、脂肪和油、糖或增甜劑、膳食纖維，蛋白源如奶粉、面筋豆(glutensoy)或蛋，和面團(tuán)添加劑如乳化劑、其它酶、水狀膠體、增味劑、氧化劑、礦物質(zhì)和維生素。乳化劑可用作面團(tuán)增強(qiáng)劑(doughstrengtheners)和面包屑軟化劑。作為面團(tuán)增強(qiáng)劑，乳化劑可以提供對(duì)休眠期(restingtime)的耐受(tolerance)和對(duì)發(fā)泡(proofing)期間振動(dòng)的耐受。而且，面團(tuán)增強(qiáng)劑將改善給定的面團(tuán)對(duì)發(fā)酵時(shí)間變化的耐受。大多數(shù)面團(tuán)增強(qiáng)劑也改善烘焙彈性，這意味著從發(fā)酵產(chǎn)品至烘焙產(chǎn)品的體積增加。最后，面團(tuán)增強(qiáng)劑將乳化存在于配方混合物中的任何脂肪。合適的乳化劑包括卵磷脂、聚氧乙烯硬脂酸酯、可食用脂肪酸的甘油一酯和甘油二酯、可食用脂肪酸甘油一酯和甘油二酯的醋酸酯、可食用脂肪酸甘油一酯和甘油二酯的乳酸酯、可食用脂肪酸甘油一酯和甘油二酯的檸檬酸酯、可食用脂肪酸甘油一酯和甘油二酯的二乙酰酒石酸酯、可食用脂肪酸的蔗糖酯、硬脂酰-2-乳酸鈣、和硬脂酰-2-乳酸鈉?？梢詫⒘硗獾拿鎴F(tuán)添加劑或組分和任何其它的面團(tuán)組分一起加入，所述面團(tuán)組分包括面粉、水或任選的其它組分或添加劑，或面團(tuán)改良組合物。另外的面團(tuán)添加劑或組分可以在面粉、水、任選的其它組分和添加劑或面團(tuán)改良組合物之前加入。另外的面團(tuán)添加劑或組分可以在面粉、水、任選的其它組分和添加劑或面團(tuán)改良組合物之后加入。另外的面團(tuán)添加劑或組分可以方便地是液體制備物。然而，另外的面團(tuán)添加劑或成分也可以方便地是干燥組合物的形式。優(yōu)選地，另外的面團(tuán)添加劑或組分是面團(tuán)面粉成分重量的至少1%。更優(yōu)選地，另外的面團(tuán)添加劑或組分占至少2%、優(yōu)選地至少3%、優(yōu)選地至少4%、優(yōu)選地至少5%、優(yōu)選地至少6%。如果添加劑是脂肪，則典型地，脂肪存在的量可以是從l至5%，典型地是從1至3%，更典型地是大約2%。其它用途可以在律師案巻編號(hào)674510-2007和GC806P找至!j，其在此并入，作為參考，包括任何圖表、參考文獻(xiàn)或附圖。實(shí)施例實(shí)施例l:PS4的克隆讓嗜糖假單胞菌在LB培養(yǎng)基中生長過夜，用標(biāo)準(zhǔn)方法(SambrookJ,1989)分離染色體DNA。用引物P1和P2(參見表3)，經(jīng)PCR從嗜糖假單胞菌染色體DNA擴(kuò)增出2109bp的片段，所述片段含有PS4開放閱讀框架(Zhouetal.，1989)。將得到的片段用作巢式PCR的模板，弓l物是P3和P4，擴(kuò)增不帶有信號(hào)序列的PS4開放閱讀框并在基因的5'末端導(dǎo)入NcoI位點(diǎn)，在基因的3，末端導(dǎo)入BamHI位點(diǎn)。N-末端甲硫氨酸的密碼子和Ncol位點(diǎn)共同導(dǎo)入，使得PS4可以在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。將1605bp的片段克隆入pCRBLUNTTOPO(Invitrogen)，通過測(cè)序分析構(gòu)建物的完整性。修飾大腸桿菌穿梭載體pDP66K(Penningaeta1.,1996)，以使得PS4可以在P32啟動(dòng)子和信號(hào)序列的調(diào)控下表達(dá)。將得到的質(zhì)粒pCSmta轉(zhuǎn)化入枯草芽孢桿菌。構(gòu)造第二個(gè)表達(dá)構(gòu)建體，其中去除了PS4的淀粉結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在用引物P3和P6對(duì)pCSmta進(jìn)行的PCR中，產(chǎn)生了截短形式的mta基因。pCSmta中的全長mta基因被截短形式所替換，從而形成質(zhì)粒pCSmta-SBD。實(shí)施例2:PS4的定點(diǎn)誘變突變是通過2種方法導(dǎo)入mta基因的。或是通過基于2步PCR的方法，或是通過QuickExchange方法(QE)。為了方便，將mta基因分為3部分；Pvul-Fspl片段、FspI-PstI片段和PstI-AspI片段，分別進(jìn)一步稱為片段l、2和3。在基于2步PCR的方法中，突變是用PfuDNA聚合酶(Stratagene)導(dǎo)入的。第一輪PCR是針對(duì)編碼鏈的誘變引物(表4)加上另一鏈(lowerstrand)下游的引物(或是2R或是3R，表3)來進(jìn)行的。反應(yīng)產(chǎn)物和編碼鏈上游的引物共同被用作第二輪PCR的引物。將終末反應(yīng)的產(chǎn)物克隆入pCRBLUNTtopo(Invitrogen)，測(cè)序之后，片段與pCSmta中的相應(yīng)片段替換。用QuickExchange方法(Stratagene)，用兩個(gè)互補(bǔ)引物，在含有mta基因或部分mta基因的質(zhì)粒中經(jīng)PCR導(dǎo)入突變。對(duì)于此用途，構(gòu)建出方便的一組質(zhì)粒，包括3個(gè)SDM質(zhì)粒和3個(gè)pCSA質(zhì)粒。每一SDM質(zhì)粒帶有如上提及的mta基因的一個(gè)片段，其中所需突變是經(jīng)QE導(dǎo)入的。經(jīng)測(cè)序確認(rèn)后，將片段克隆入相應(yīng)的受體pCSA質(zhì)粒。pCSA質(zhì)粒是pCSmta的失活衍生物?；钚允峭ㄟ^克隆來自SDM質(zhì)粒的相應(yīng)片段而恢復(fù)的，這使得能夠容易地篩選。表3:用于克隆mta基因的引物，以及用于在2步PCR方法中構(gòu)建定點(diǎn)突變體的標(biāo)準(zhǔn)引物。<table>tableseeoriginaldocumentpage62</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage63</column></row><table>表4:用于在mta中導(dǎo)入定點(diǎn)誘變的引物<table>tableseeoriginaldocumentpage63</column></row><table>表5SDM和pCSA質(zhì)粒的特征<table>tableseeoriginaldocumentpage63</column></row><table>實(shí)施例3:MultiSDMPS4變異體是根據(jù)使用說明書，用QuickChangeMultiSiteDirectedMutagenesisKit(Stratagene)生成的，帶有如所述的一些改變。步驟l:突變鏈合成反應(yīng)(PCR)-在10ml的Falcon管中接禾中3mlLB(22g/1LennoxLBrothBase,Sigma)+抗生素(0.05|ug/ml卡那霉素，Sigma)-37。C溫育過夜(o/n)，約200rpm-離心沉降細(xì)胞(5000rpm/5分鐘)-倒去培養(yǎng)基-用QIAGENPlasmidMiniPurificationProtocol制備雙鏈DNA模板1.用于熱循環(huán)的突變鏈合成反應(yīng)物按如下所述來制備:PCR混合物2.5]ul10XQuickChange⑧Multi反應(yīng)緩沖液QuickSolution0.75|il聚合酶)引物「引物長度28-35bp—lOpmor引物長度24-27bp—7pmol引物長度20-23bp—5pmol.dNTP混合物雙鏈DNA模板(200ng)QuickChange⑧Multi酶混合物(2,5U/pl)(P>rwrZ>o@DNAdH20(加至終體積25jli1)抽吸并短暫沉降反應(yīng)混合物，以混合所有成分2.用下列參數(shù)來循環(huán)反應(yīng)35個(gè)循環(huán)變性(96t71分鐘)引物退火(62,8"/1分鐘)延伸(65"/15分鐘)然后維持在4°C在將PCR管放入PCR儀之前(eppendorf熱循環(huán)儀)之前，預(yù)加熱PCR儀的蓋至105r并預(yù)加熱板至95°C。步驟2:D，/消化1.向每一擴(kuò)增反應(yīng)體系中加入2plZ)p"/限制性內(nèi)切酶(10U1)，抽吸并短暫沉降混合物而混合。2.37。C溫育3小時(shí)。步驟3:轉(zhuǎn)化XL10-Gold⑧超感受態(tài)細(xì)胞(UltracompetentCells)641.在冰上解凍XL10-Gold細(xì)胞。將每個(gè)突變反應(yīng)所需的45pl細(xì)胞分裝至預(yù)冷的Falcon管中。2.打開水浴(42"C)并將帶有NZY+肉湯的試管放在水浴中預(yù)熱。3.向每一管加入2jLilP-巰基乙醇混合物。旋轉(zhuǎn)并輕彈并在冰上溫育10分鐘，每2分鐘旋轉(zhuǎn)一次。4.向每等份細(xì)胞加入1.5^1D/"/處理的DNA，旋轉(zhuǎn)混合并在冰上溫育30分鐘。5.在42匸水浴中熱激(heat-pulse)試管30秒，在冰上放置2分鐘。6.向每一管加入0.5ml預(yù)熱的NZY+肉湯，在37。C溫育1小時(shí)，同時(shí)以225-250rpm振蕩。7.將200W的每一轉(zhuǎn)化反應(yīng)物鋪板在LB平板上(33.6g/1LennoxLAgar,Sigma),LB平板含有1%淀粉和0.05嗎/ml卡那霉素。8.37"C溫育轉(zhuǎn)化平板過夜。表6:用于pPD77dl4的引物表:<table>tableseeoriginaldocumentpage65</column></row><table>表7:用于pPD77d20的引物表:<table>tableseeoriginaldocumentpage66</column></row><table>表8:用于pPD77d34的引物表:<table>tableseeoriginaldocumentpage66</column></row><table>基于pPD77的載體系統(tǒng)用于pPD77的載體系統(tǒng)是基于pCRbluntTOPOII(invi加gen)。Zeodti抗性序列盒通過使用pmll去除，去除了393bp的片段。然后，將來自pCC載體的表達(dá)序列盒(P32-ssCGTase-PS4-tt)插入載體。將PS4變異體連接入pCCMini用限制性內(nèi)切酶NcoI和HindIII(Biolabs)切割含有相關(guān)突變(經(jīng)MSDM建立)的質(zhì)粒3昭質(zhì)粒DNA，Xpl10x緩沖液2，10單位Nco1，20單位HindIII，37。C溫育2小時(shí)在1%瓊脂糖凝膠上分析消化產(chǎn)物。從凝膠中切取出長度為1293bp的片段(PS4基因)，并用Qiagengelpurificationkit純化。然后，用限制性內(nèi)切酶Nco1和HindHI切割載體pCCMini,然后，在1%瓊脂糖凝膠上分離消化產(chǎn)物。從凝膠中切取出長度為3569bp的片段并用Qiagengelpurificationkit純化。連接用RapidDNAligationkit(Roche)用雙倍量于載體的插入片段例如，2pl插入片段(PS4基因)ljil載體5filT4連接緩沖液2xconeljaldH20ljulT4DNA連接酶連接5分鐘/室溫根據(jù)產(chǎn)品說明書(Invitrogen)，將連接物轉(zhuǎn)化入OneShotTOPO感受態(tài)細(xì)胞。每次轉(zhuǎn)化用5pl連接物。將50pl轉(zhuǎn)化混合物鋪板在LB平板上(33.6g/1LennoxLAgar,Sigma)，LB平板包括1%淀粉和0.05pg/ml卡那霉素。可以通過淀粉平板上的暈圈形成來識(shí)別含有插入片段(PS4變異體)的載體。實(shí)施例4:轉(zhuǎn)化入枯草芽孢桿菌(原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化)根據(jù)下列方案，用突變的pCS-質(zhì)粒轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌(菌株DB104A;Smithetal.1988;Gene70,351-361)。A.用于原生質(zhì)化(protoplasting)和轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)基2xSMM每升342g蔗糖(lM);4.72g馬來酸鈉(0.04M);8.12gMgCl2.6H2O(0.04M);用濃NaOH調(diào)節(jié)pH為6.5。分為50ml份并高壓滅菌10分鐘。4xYT(1/2NaCl)每100ml2g酵母提取物+3.2g胰蛋白胨+0.5gNaClSMMP混合等體積的2xSMM禾PI4xYT。PEG10g聚乙二醇6000(BDH)或8000(Sigma)，在25ml1xSMM中(高壓滅菌10分鐘)。B.用于鋪板/再生的培養(yǎng)基瓊脂4%Difco最簡化瓊脂。高壓滅菌15分鐘。琥珀酸鈉270g/1(1M)，用HC1調(diào)節(jié)pH7.3。高壓滅菌15分鐘。磷酸緩沖液每100ml3.5gK2HP04+1.5gKH2P04。高壓滅菌15分鐘。MgCl2每100ml20.3gMgCl2.6H20(lM)。酪蛋白氨基酸5%(w/v)溶液。高壓滅菌15分鐘。酵母提取物每100ml10g，高壓滅菌15分鐘。葡萄糖20。/。(w/v)溶液。高壓滅菌10分鐘。DM3再生培養(yǎng)基6(TC下混合(水?。?00-ml容器)250ml琥珀酸鈉50ml酪蛋白氨基酸25ml酵母提取物50ml磷酸緩沖液15ml葡萄糖10mlMgCl2100ml熔化的瓊脂加入合適的抗生素氯霉素和四環(huán)素，5ug/ml;紅霉素，lug/ml。在DM3培養(yǎng)基上基于卡那霉素進(jìn)行選擇是有問題的需要250ug/ml的濃度。C.制備原生質(zhì)體1.始終應(yīng)用無清潔劑的塑料或玻璃器具。2.將單個(gè)克隆接種到含有10ml2xYT培養(yǎng)基的100ml燒瓶中。使培養(yǎng)物在振蕩器中(200rev/min)25-30C生長過夜。3.稀釋過夜的培養(yǎng)物20倍，放入100ml新鮮的2xYT培養(yǎng)基(250-ml燒瓶)，在振蕩器中(200-250rev/min)37C生長，直至OD6()()=0.4-0.5(大約2小時(shí))。4.離心收集細(xì)胞(9000g，20min,4C)。5.用移液管移去上清液，在5mlSMMP+5mg溶菌酶中重懸浮細(xì)胞，無菌過濾。6.在水浴振蕩器中37C溫育(100rev/min)。30分鐘后以及其后每隔15分鐘，用顯微鏡檢測(cè)25ul樣品。繼續(xù)溫育，直至細(xì)胞的99%被原生質(zhì)化(球形外觀)。離心收集原生質(zhì)體(卯00g,20分鐘，室溫)并移去上清。在l-2mlSMMP中輕柔地重懸浮沉淀。現(xiàn)在，原生質(zhì)體已準(zhǔn)備好，可以被應(yīng)用?？梢栽?80C冷凍幾份(例如，0.15ml)，用于將來應(yīng)用(不需要加入甘油)。盡管這可能導(dǎo)致轉(zhuǎn)化能力的一定程度降低，但用冷凍的原生質(zhì)體可以得到每ugDNA106個(gè)轉(zhuǎn)化子。D.轉(zhuǎn)化1.向微量管中轉(zhuǎn)移450ulPEG。2.混合1-10ulDNA(0.2ug)和150ul原生質(zhì)體，并將混合物加入帶有PEG的微量管。立即但輕柔地混合。3.室溫放置2分鐘，然后加入1.5mlSMMP并混合。4.離心收集原生質(zhì)體(IO分鐘，13.000rev/min(10-12.000g))，并倒去上清液。用棉紙移除殘余小滴。加入300ulSMMP(不漩渦)并在水浴振蕩器中37C溫育60-90分鐘(100rev/min)，以使得抗生素抗性標(biāo)記被表達(dá)。(通過水浴的振蕩行為，原生質(zhì)體有效地重懸浮)。制備溶于1xSSM中的合適稀釋液，在DM3平板上鋪O.lml。實(shí)施例5:PS4變異體在搖瓶中發(fā)酵搖瓶底物被制備如下:成分%(w/v)水-酵母提取物2大豆粉2NaCl0.5磷酸氫鉀0.5抗泡沫劑0.05在高壓滅菌之前，用4N硫酸或氫氧化鈉將底物調(diào)節(jié)為pH6.8。將100ml的底物放在帶有遮護(hù)物的500ml的瓶中，高壓滅菌30分鐘。隨后，加入6ml無菌右旋糖漿。右旋糖漿是通過混合1個(gè)體積的50%w/v的右旋糖和1個(gè)體積的水，隨后高壓滅菌20分鐘而制備的。用變異體接種搖瓶，在溫育箱內(nèi)35'C/180rpm溫育24小時(shí)。溫育后，經(jīng)離心從肉湯分離出細(xì)胞(10.000xg，IO分鐘)，最終，經(jīng)0.2pm微過濾，上清液被制備為不含細(xì)胞。將無細(xì)胞上清液用于分析和用途測(cè)試。實(shí)施例6:淀粉酶分析Betamyl分析一個(gè)Betamyl單位被定義為這樣的活性，每分鐘降解0.0351mmolePNP-偶聯(lián)麥芽戊糖，以致于在分析混合物中由過量的a-葡糖苷酶可以釋放出每分鐘0.0351mmolePNP。分析混合物含有50ul50mM的檸檬酸鈉，5mMCaC12，pH6.5，帶有25ul酶樣品和25ulBetamyl底物(Glc5-PNP和a-葡糖苷酶)，來自Megazyme,Ireland(1小瓶，溶解于10ml水)。40C溫育分析混合物30分鐘，然后通過加入150ul4%Tris終止反應(yīng)。用ELISA-讀數(shù)器測(cè)定420nm處的吸光度，并根據(jù)活性=入420*(1計(jì)算Betamyl活性，單位是Betamyl單位/ml被分析的酶樣品。內(nèi)切淀粉酶分析內(nèi)切淀粉酶分析和根據(jù)制造商(Pharmacia&UpjohnDiagnosticsAB)實(shí)施的Phadebas分析相同。外切特異性外切淀粉酶活性相對(duì)Phadebas活性的比率被用于評(píng)價(jià)外切特異性。比活性對(duì)于PSac-D14、PSac-D20和PSac-D34變異體，根據(jù)Bradford(1976;Anal.Biochem.72,248)測(cè)定結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)平均比活性是每微克純化的蛋白為10個(gè)Betamyl單位。將此比活性用于用途試驗(yàn)中所采用的劑量的基于活性的計(jì)算。實(shí)施例7:半衰期測(cè)定tl/2被定義為這樣的時(shí)間(以分鐘表示)，在所述時(shí)間內(nèi)，在限定的加熱條件下，酶活性失去一半。為了確定酶的半衰期，將樣品在6(TC至9(TC的固定溫度下加熱1-10分鐘。根據(jù)殘余的Betamyl分析計(jì)算半衰期。方法在Eppendorf管中，預(yù)熱1000ul緩沖液至少10分鐘，溫度是6(TC或更高。在熱溫育器(Eppendorf的Termomixercomfort)中持續(xù)混合(800rpm)Eppendorf管的條件下，向預(yù)熱的緩沖液中加入100ul樣品，開始熱處理樣品。溫育0、2、4、6、8和9分鐘之后，通過將45ul樣品轉(zhuǎn)移至已在2(TC平衡的1000ul緩沖液，并在1500rpm及2(TC下溫育1分鐘，終止該處理。用Betamyl分析測(cè)定殘余活性。計(jì)算根據(jù)殘余Betamyl活性的loglO(底數(shù)10的運(yùn)算方法)比溫育時(shí)間所得的斜率計(jì)算tl/2。tl/2被計(jì)算為斜率/0.301二t1/2。實(shí)施例8:結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage72</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage73</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage74</column></row><table>表14<table>tableseeoriginaldocumentpage75</column></row><table>表15<table>tableseeoriginaldocumentpage75</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage76</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage77</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage78</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage79</column></row><table>實(shí)施例9:模擬體系烘焙試驗(yàn)(ModelSystemBakingTests)在30.(TC，在淀粉測(cè)定記錄儀(Farinograph)中制備面團(tuán)。稱出lO.OOg改良面粉(reformedflour)并加入到淀粉測(cè)定記錄儀；混合1分鐘之后，用無菌移液器通過搓揉桶(kneadingvat)的孔加入?yún)⒄瘴?樣品(參照物二緩沖液或水，樣品二酶+緩沖液或水)。30秒之后，從邊緣刮去面粉一一也是通過搓揉桶的孔。將樣品搓揉7分鐘。在最終的參照物被運(yùn)行之前，在淀粉測(cè)定記錄儀上用緩沖液或水進(jìn)行測(cè)試。參照物的FU應(yīng)該是400，如果不是，應(yīng)該用例如液體的量來校正。用刮鏟移出參照物/樣品并放置在手中(戴有一次性手套)，再將參照物/樣品裝入小玻璃管(長度大約是4.5cm)，小玻璃管被放入NMR管并塞住。每個(gè)面團(tuán)制備7管。當(dāng)制備了所有樣品后，將管放在(可程序控制的)水浴中25分鐘，溫度是33i:(不帶有塞子)，此后，使水浴在33'C維持5分鐘，然后在56分鐘內(nèi)加熱至98T:(每分鐘1.1。C)并最終在96X:維持5分鐘。于20.(TC將管存儲(chǔ)在熱櫥(thermocupboard)中。在1、3和7天時(shí)，用BrukerNMS120MinispecNMR分析儀通過質(zhì)子NMR測(cè)定面包屑的固體含量，如圖2中所示，對(duì)用0、0.5、1和2ppmPSacD34制備的面包屑樣品進(jìn)行測(cè)定。固體含量隨時(shí)間推移的增加變慢，代表支鏈淀粉退化(amylopectinretrogradation)的減少。于20.0。C在熱櫥中存儲(chǔ)7天之后，稱出10-20mg面包屑樣品并放置在40ul鋁標(biāo)準(zhǔn)DSC艙(capsule)中，在20。C保存。在MettlerToledoDSC820設(shè)備上，對(duì)所述艙進(jìn)行差示掃描量熱分析。應(yīng)用下列參數(shù)熱循環(huán)20-95i:，每分鐘加熱1(TC，氣體/流量:化/每分鐘80ml。分析結(jié)果，以J/g計(jì)算退化支鏈淀粉的熔化焓。實(shí)施例10:保鮮效應(yīng)根據(jù)實(shí)施例8制備和測(cè)定模型面包屑。如表2中所示，差示掃描量熱法測(cè)定結(jié)果顯示，相對(duì)于對(duì)照，PS4變異體在烘焙后，支鏈淀粉退化顯著降低。PS4變異體顯示了明顯的劑量效應(yīng)。實(shí)施例ll:烘焙試驗(yàn)中的堅(jiān)硬性影響烘焙試驗(yàn)是用標(biāo)準(zhǔn)白面包發(fā)面團(tuán)和用于美國吐司面包的面團(tuán)配方進(jìn)行的。發(fā)面團(tuán)是由1600g來自SiscoMills,USA的"AllPurposeClassic"面粉、950g水、40g大豆油和32g干酵母制備的。在Hobart螺旋式混合器上，以低速度混合發(fā)面團(tuán)1分鐘，隨后以速度2混合3分鐘。隨后在35"C，85XRH發(fā)酵發(fā)面團(tuán)2.5小時(shí)，隨后在5"C發(fā)酵0.5小時(shí)。此后，向發(fā)面團(tuán)加入400g面粉、4g干酵母、40g鹽、2.4g丙酸鈣、240g高果糖玉米糖漿(Isosweet)、5g乳化劑PANODAN205、5g酶活性的大豆粉、30g非活性的大豆粉、220g水和30g抗壞血酸溶液(由溶于500g水的4g抗壞血酸制備)。在Hobart螺旋式混合器上，將得到的面團(tuán)以低速度混合1分鐘，隨后以速度2混合6分鐘。此后，室溫?cái)R置面團(tuán)5分鐘，然后稱量500g面團(tuán)塊，擱置5分鐘，隨后在Glimek軋面機(jī)上鋪開，設(shè)置為各側(cè)為1:4、2:4、3:15、4:12和10，并將其轉(zhuǎn)變?yōu)楹姹盒问健Ｔ?3。C，90XRH下，發(fā)酵面團(tuán)60分鐘之后，在218。C供焙面團(tuán)29分鐘。用TA-XT2質(zhì)地分析儀(textureanalyser)測(cè)定堅(jiān)硬性和彈性。用來自StableMicroSystems,UK的質(zhì)地分析儀(TextureAnalyser),通過質(zhì)地狀況分析儀(TextureProfileAnalysis)分析面包片，測(cè)定柔軟度、粘性和彈性。應(yīng)用下列設(shè)置預(yù)測(cè)試速度(PreTestSpeed):2mm/s測(cè)試速度(TestSpeed):2mm/s測(cè)試后速度(PostTestSpeed):10mm/s破裂測(cè)試距離(RuptureTestDistance):1%距離(Distance):40%力(Force):0.098N時(shí)間(Time):5.00sec計(jì)數(shù)(Count):5測(cè)壓元件(LoadCell):5kg觸發(fā)類型(TriggerType):Auto-0.01N結(jié)果顯示于圖3和圖4。實(shí)施例12:控制丹麥面包巻(DanishRolls)的體積丹麥面包巻是基于2000g丹麥改良面粉(來自Cerealia)、120g壓縮的酵母、32g鹽和32g蔗糖，由面團(tuán)制備的。根據(jù)前面的水最優(yōu)化(wateroptimisation),向面團(tuán)力卩入水。在Diosna攪拌器上混合面團(tuán)(低速2分鐘，高速5分鐘)。將混合后的面團(tuán)溫度保持在26'C。稱量1350g面團(tuán)，在3(TC在加熱箱中擱置10分鐘。在Fortima成型機(jī)(molder)上模塑面包巻，并在34。C和85%的相對(duì)濕度下發(fā)酵45分鐘。隨后，在Bago2烤箱中烘焙面包巻18分鐘，溫度是25(TC，在開始的13秒中施加蒸氣。烘焙后，在稱量和測(cè)定體積之前，冷卻面包25分鐘。就面包皮的外觀、面包屑的均一性、面包皮的表層、ausbund和比體積(用油菜籽置換方法(rapeseeddisplacementmethod)測(cè)定體積)，對(duì)面包巻作出評(píng)價(jià)。根據(jù)這些標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)現(xiàn)PS4變異體增加了比體積(specificvolume)并改進(jìn)了丹麥面包的質(zhì)量參數(shù)。因此，PS4變異體能夠控制烘焙產(chǎn)品的體積。本文中提及的每一申請(qǐng)和專利，以及上述申請(qǐng)和專利中引用和提及的每一文獻(xiàn)，包括在每一申請(qǐng)和專利("申請(qǐng)引用的文獻(xiàn)")進(jìn)行期間和在每一申請(qǐng)和專利以及任何申請(qǐng)引用文獻(xiàn)中引用或提及的任何產(chǎn)品的使用說明書或目錄，均在此并入，作為參考。而且，本文中引用的所有文獻(xiàn)，和本文中引用的文獻(xiàn)中引用或提及的所有文獻(xiàn)，以及本文中引用或提及的任何產(chǎn)品的使用說明書或目錄，均在此并入，作為參本發(fā)明所描述的方法和體系的各種修改和變化，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員將是顯而易見的，不背離本發(fā)明的精神和范圍。盡管參考具體的優(yōu)選實(shí)施方案描述了本發(fā)明，但應(yīng)該理解，所要求保護(hù)的發(fā)明不應(yīng)當(dāng)過度地被限制在這些具體實(shí)施方案中。實(shí)際上，對(duì)所描述的實(shí)施本發(fā)明的方式的各種修改，都意圖于包含在權(quán)利要求范圍內(nèi)，這對(duì)分子生物學(xué)或相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員是顯而易見的。權(quán)利要求1.具有外切特異性的非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶，其包含的氨基酸序列與SEQIDNos1、5、7或11有至少75％是相同的，并且包含至少一個(gè)取代，所述取代選自位點(diǎn)4、33、34、70、71、87、99、108、113、121、134、141、157、158、171、178、179、188、198、199、223、290、307、315、334、343、399和405。2.權(quán)利要求1所述的外切淀粉酶，其中所述氨基酸序列和SEQIDNo:1有至少75%相同的。3.權(quán)利要求1所述的外切淀粉酶，其中所述氨基酸序列和SEQIDNo:5是至少75%相同的。4.權(quán)利要求1所述的外切淀粉酶，其中所述氨基酸序列和SEQIDNo:7是至少75%相同的。5.權(quán)利要求1所述的外切淀粉酶，其中所述氨基酸序列和SEQIDNo:11是至少75%相同的。6.權(quán)利要求1所述的外切淀粉酶，其中所述氨基酸序列包括與SEQIDNos:2-4b或8-10是至少75%相同的氨基酸序列。7.權(quán)利要求1所述的外切淀粉酶，其中所述至少一個(gè)取代是選自G4D、N33Y、D34N、G70D、K71R、G87S、A99V、K108R、V113I、G121D、G134R、A141P、1157L、G158D、Y171S、L178F、A179T、G188A、Y198F、Y198F、Y淺L、A199V、G223A、V2類、H307L、1315V、S334P、D343E、S399P、A405F和A405E。8.權(quán)利要求1所述的外切淀粉酶，其中所述至少一個(gè)位點(diǎn)選自33、34、71、87、121、134、141、157、178、179、223、207、334和343。9.權(quán)利要求8所述的外切淀粉酶，其中所述至少一個(gè)取代選自N33Y、D34N、K71R、G87S、G121D、G134R、A141P、1157L、L178F、A179T、G223A、H307L、S334P和D343E。10.權(quán)利要求8所述的外切淀粉酶，其進(jìn)一步包括至少一個(gè)另外的取代，取代的位點(diǎn)選自108、158、171和188。11.權(quán)利要求IO所述的外切淀粉酶，其中所述至少一個(gè)另外的取代選自K108R、G158D、Y171S和G188A。12.權(quán)利要求1所述的外切淀粉酶，其中所述至少一個(gè)取代包括組合，其選自下列G134R，A141PI157LG223AH307LS334PD343EG121D;G134RA141PI157LG223AH307LS334PD343EN33YG121D;G134RA141PI157LG223AH307LS334PD343EN33Y;G134R,A141PI157LG223AH307LS334PD343EN33YD34NK71RU78FA179TG87SG121DS214NT375A;G134R，A141PI157LG223AH307LS334PD343EN33YD34NK71RU78FA179TG121DY171SG188AN138D;G134R,A141PI157LG223AH307LS334PD343EN33YD34NK71RL178FA179TG121D;G87SG121DG134R，A141PI157LG223AH307LS334PD343EN33YD34NK71RL178FA179T;G87SG121DG134R,A141PI157LG223AH307LS334PD343EN33YD34NK71RL178FA179TG188A;G134R,A141PI157LG223AH307LS334PK71RL178FA179T;G134R,A141PI157LG223AH307LS334PU78FA179T;G134R,A141PI157LG223AH307LS334PN33YD34NL178FA179T;G134R,A141PI157LG223A訓(xùn)7LS334PL178FA179TG87SG121D;G134R,A141PI157LG223AH307LS334PL178FA179TG121D;G134R,A141PI157LG223AH307LS334PD343EN33YD34NK71RL178FA179TG121DE343D;G87SG121DG134R,A141PI157LG223AH307LS334PD343EN33YD34NK71RL178FA179T;G87SG121DG134R,A141PI157LG223AH307LS334PD343EN33YD34NK71RL178FA179TY33NN34DE343D;G134R，A141PI157LG223AH307LS334PD343EN33YD34NK71RL178FA179TG121D;G134R，A141PI157LG223AH307LS334PK71RL178FA179TG121D;G87S,VI131，G134R,A141P,1157L，Y198F，G223A，V2頻，H307L，S334P,D343E;113F,A141P，I157L,Y198F,G223A，V2卯I，H307L,S334P,D343E;A99V,VI131，A141P,I157L,Y198F，G223A，V290I,H307L,S334P，D343E;V113I,I157L,Y198F,G223A，V290I,H307L，S334P，D343EVI131,G134R，A141P,1157L,Y198F，G223A，V290I,H307L，S334P,D343E;A141P，1157L，Y198F,G223A，V2頻，H307L，S334P,D343E;A199V,D343E，V113I,A141P，1157L，Y198F,G223A,V2類，H307L,S334P;V113I,A141P,I157L,Y198F，G223A，V290I,S334P,D343E;V113I,G121D，G134R,A141P,I157L,Y198F,G223A，V2卯I，H307L，S334P,D343E;V113I,G121D,G134R,A141P，I157L,Y198F，G223A,V2卯I，H307L,S334P,D343E;VI131，A141P，I157L,Y198F，G223A，V290I,H307L，S334P，D343E;V113I,A141P,Y198F，G223A,V290I,H307L;V113I,A141P，Y198F，G223A,V2卯I，S334P，D343E;V113I,A141P，Y198F，G223A，A268P，V290I,S399PV113I,A141P,Y198F,G223A,V290I,S399P;V113I,A141P，Y198W，G223A，V290I;VI131,A141P,Y198F,G223A,V290I;Y198F,G223A，V2卯I;Y198W,G223A，V2卯I;VU3I,A141P,I157L,Y198F,G223A，V2卯I;VU3M;V113A;VI131，G134R，A141P，I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P，D343E;VI131，G134R，A141P,I157L,Y198F，G223A，V290I,H307L,1315V，S334P,D343E;D34N，VI131,G134R，A141P,1157L，Y198F,G223A，V290I,H307L，S334P，D343E;VIm,G134R，A141P,I157L,G188S，Y198F，G223A，V2卯I，H307L,S334P,D343E;K71R,V113I,G134R，A141P，1157L，L178L,Y198F，G223A,V290I,固7L,G313G，S334P,D343E;D34N，VI131,G134R,A141P，1157L，Yi98F,G223A，V290I,H307L，G313G，S334P，D343E;VI131，G134R，A141P,I157L,A179V,Y198F,G223A，V290I,H307L，S334P，D343E;VI131,G134R，A141P,1157L，I而，Y198F,G223A，V2卯I，H307L,G313G，S334P，D343EVI131，G134R,A141P,I157L,A179V,Y198F,G223A,V290I,H307L,G313G，S334P，D343E;G87S，VI131，G134R,A141P，U57L，Y198F，G223A,V290I,H307L,S334P,D343E;VI131,G134R,A141P,1157L，Y198F，G223A,V290I,H307L，S334P,D343E，A405E;VI131,G134R，A141P，I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L，S334P,D343E,A楊V;A141P,1157L，Y198F,G223A,V290I,H307L，S334P，D343E;VI131,G134R,A141P,1157L，Y198L，G223A，V290I,H307L,S334P，D343E;VI131,G134R,A141P,I157L,Y198F，G223A,V290I,H307L，S334P,D343E;K71R，VI131,G134R,A141P,I157L,Y198F，G223A，V290I,H307L,S334P，D343E;K108R,VI131,G134R，A141P，I157L,Y198F,G223A,V2雨，H307L，S334P，D343E;D34G,VI131,G134R，A141P，1157L，Y198F,G223A,V290I,H307L，S334P,D343E;G4D,V113I,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P，D343E;和A141P,G134R,G223A,H307L，I157L，VI131,V290I,Y198F,G188A。13.權(quán)利要求3所述的外切淀粉酶，其中所述至少一個(gè)取代包括組合，其選自下列G134R,A141P，1157L，G223A,H307L和S334P;G121D，G134R，A141P,1157L，G223A，H307L和S334;G87S,G121D，G134R，A141P，1157L，G223A，H307L和S334P;G134R，A141P,U57L，L178F,A179T,G223A,H307L和S334P;G87S，G121D，G134R,A141P,1157L，L178F，A179T,G223A,H307L和S334P;G121D,G134R，A141P,1157L，L178F，A179T,G223A，H307L和S334P;N33Y，D34N，G134R,A141P，I157L,L178F,A179T,G223A,H307L和S334P;N33Y,D34N,G121D,G134R,A141P，1157L，L178F,A179T,G223A,H307L禾口S334P;禾口N33Y,D34N,G87S,G121D，G134R，A141P,1157L，L178F,A179T，G223A,H307L和S334P。14.權(quán)利要求3所述的外切淀粉酶，其中所述至少一個(gè)取代包括組合，其選自下列N33Y，D34N，G134R，A141P，I157L,L178F,A179T,G223A,H307L和S334P;N33Y，D34N，G87S,G121D,G134R，A141P，I157L,L178F，A179T,G223A，H307L和S334P;禾口N33Y,D34N，G87S,G121D，G134R,A141P，I157L,L178F,A179T,G223A,H307L和S334P。15.權(quán)利要求1所述的外切淀粉酶，其中所述淀粉酶包括選自SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:4a、SEQIDNO:4b、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9和SEQIDNO:10的氨基酸序列。16.權(quán)利要求1所述的外切淀粉酶，其中所述外切淀粉酶來源于假單胞菌。17.權(quán)利要求16所述的外切淀粉酶，其中所述假單胞菌選自嗜糖假單胞菌和施氏假單胞菌。18.核酸序列，其和編碼權(quán)利要求1所述外切淀粉酶的核酸序列至少是75%相同的。19.載體，其包含權(quán)利要求17所述的核酸序列。20.宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求18的核酸序列。全文摘要本發(fā)明涉及淀粉酶多肽和編碼所述多肽的核酸及其用途。本發(fā)明的淀粉酶被設(shè)計(jì)為具有更多的有益性質(zhì)。具體來說，本發(fā)明的淀粉酶顯示了改變的外切特異性。文檔編號(hào)C11D3/386GK101296935SQ200480023286公開日2008年10月29日申請(qǐng)日期2004年7月7日優(yōu)先權(quán)日2003年7月7日發(fā)明者A·肖,C·R·索達(dá)爾,C·T·貝爾格,C·費(fèi)奧雷西,G·赫里茲,K·M·克拉,K·博伊森,P·M·F·德克斯,W·劉申請(qǐng)人:金克克國際有限公司;丹尼斯科公司