專利名稱：擔(dān)子菌的天冬酰胺酶的制作方法
擔(dān)子菌的天冬酰胺酶發(fā)明領(lǐng)域
本發(fā)明的領(lǐng)域涉及可自真菌擔(dān)子菌獲得的天冬酰胺酶，所述擔(dān)子菌特別是擔(dān)子菌絨狀火燕(Flammulina velutipes)。還公開了用于水解L-天冬酰胺和L-谷氨酰胺的方法。還公開了用于降低包含L-天冬酰胺的物質(zhì)中的丙烯酰胺形成的方法。發(fā)明背景
天冬酰胺酶在食品技術(shù)中的應(yīng)用源于發(fā)現(xiàn)在存在還原糖類的條件下，對(duì)食品的熱處理將天冬酰胺部分轉(zhuǎn)化為丙烯酰胺。由于糖類在食品中與氨基酸一樣普遍，因此在食品熱處理的過程中，存在持續(xù)的風(fēng)險(xiǎn)產(chǎn)生致癌和遺傳毒性的丙烯酰胺。熱處理是例如對(duì)食物的烘焙、烤、炙烤或熱油炸。在食品熱處理過程中，在120°C以上的溫度下觀察到出現(xiàn)丙烯酰胺形成。考慮到丙烯酰胺的遺傳毒性和致癌性，糧農(nóng)組織/世界衛(wèi)生組織食品添加劑專家委員會(huì)(JECFA)提出膳食暴露于丙烯酰胺可暗示人的健康問題(參見www.1nchem.org/ documents/jecfa/jeceval/jec_41. htm,見于 2010 年 7 月 I 日)。
食品工業(yè)對(duì)多種本身需要熱處理的品種予以特殊關(guān)注，例如面包、曲奇、小食、餅干、谷物、烘干的種子(例如可可、咖啡)、擠壓和切割的土豆產(chǎn)品。
食品的熱處理對(duì)于食品質(zhì)量而言是不可或缺的。例如食品的褐化(邁拉德反應(yīng)) 反應(yīng)形成了食品的典型風(fēng)味、顏色和抗氧化劑。此外，由于熱處理食品，可以實(shí)現(xiàn)食品的微生物安全性和延長的保存期。
能夠在熱處理食品前選擇性的去除L-天冬酰胺是理想的。
已報(bào)道，使用反義天冬酰胺合酶基因和塊莖特異性啟動(dòng)子對(duì)土豆進(jìn)行遺傳改造， 降低但不能從土豆塊莖中消除天冬酰胺(Rommens 2007);完全消除天冬酰胺對(duì)于植物可能是致死的。
酶是理想的選擇性工具，用于在不影響其他食物組分的條件下修飾食物組分。酶對(duì)食品的催化作用隨高的底物和反應(yīng)特異性以及酶反應(yīng)的溫和物理?xiàng)l件而不同。酶對(duì)食品的作用是更加環(huán)境友好的，因?yàn)椴簧婕坝袡C(jī)溶劑或重金屬(“綠色化學(xué)”;“白色生物技術(shù)”)。 用于修飾食物組分的酶能夠改變單個(gè)食物組分，同時(shí)避免任何可能最終導(dǎo)致在食品中形成毒性化合物的副反應(yīng)。
然而，目前尚無任何酶技術(shù)可設(shè)想用于從食物蛋白質(zhì)中選擇性水解蛋白質(zhì)結(jié)合的氨基酸，例如天冬酰胺，而對(duì)于同時(shí)保持相應(yīng)食物材料的典型結(jié)構(gòu)和味覺特性來說則所述技術(shù)則更少。
理想的是水解例如食物中的游離的和可移動(dòng)的天冬酰胺為天冬氨酸。則天冬酰胺之后不能作為食品熱處理時(shí)形成丙烯酰胺的前體分子。
技術(shù)現(xiàn)狀
天冬酰胺酶(EC 3. 5.1.1 ;L_天冬酰胺酰胺水解酶)是催化L-天冬酰胺水解為天冬氨酸，并釋放氨的酶。根據(jù)定義，天冬酰胺酶作用于線性酰胺中的氮-碳鍵，而不作用于 L-天冬酰胺的肽鍵。
L-天冬酰胺是第一個(gè)被檢測(cè)到的氨基酸(1806年，在石刁柏(Asparagusofficinalis)的汁中)，L-天冬酰胺普遍存在于所有的活細(xì)胞中。因此,從原核微生物至脊椎動(dòng)物，自然界存在豐富的天冬酰胺酶；參見Halpern, Y. S.和Grossowicz,N. ,Hydrolysis of amides by extracts frommycobacteria, Biochem. J. 65 :716-720 (1957) ；Ho, P.P.K., Frank, B. H. ^PBurck, P. J. , Crystalline L-asparaginase from Escherichia coli B., Sciencel65 :510-512(1969) ；Suld, Η. M.和 Herbut, P. A. , Guinea pig serum andliver L-asparaginases—Comparison of serum and papain-digested IiverL-asparaginase. J. Biol. Chem. 245 :2797-2801 (1970)。具有326個(gè)氨基酸的大腸桿菌的四聚體天冬酰胺酶 (Jackson,R. Ch.和Handschumacher,R. Ε· ,Escherichia coli L-asparaginase. Catalytic activity and subunit nature, Biochemistry, 1970,9 (18),第 3585-3590 頁)是首個(gè)被詳細(xì)檢測(cè)的。
直到近期為止，L-天冬酰胺酶才在癌癥治療中被用作cytostaticum,抵抗白血病細(xì)胞和肥大細(xì)胞腫瘤(Herbert F. Oettgen, L-asparaginase Einneues Prinzip in der Chemotherapie maligner Neoplasien, Annals ofHematology,1969,19(6), 351-356)。
最近，報(bào)道了源自細(xì)菌(幽門螺桿菌(Helicobacter pylori), Scotti等人， 2010 ；Pyrococcus furiosus, Greiner-Stoeffele and Struhalla, 2008)和霉菌(黑曲霉 (Aspergillus niger), Van der Laan 等人，2008 ;米曲霉(Aspergillus oryzae), Matsui 等人，2008)的天冬酰胺酶。據(jù)稱加入二價(jià)和三價(jià)陽離子和多種氨基酸和游離巰基(Elder 等人，2007)，或加入α淀粉酶(de Boer，2006)，或加入氯化鈣與磷酸或檸檬酸(Elder等人，2005) —定程度的支持了天冬酰胺酶的活性。
谷氨酰胺酶與天冬酰胺酶相關(guān)。谷氨酰胺酶典型的源自乳酸菌，例如存在于雞腸道微生物叢中的(Thongsanit等人,2008 ;鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus), Weingand-Ziade 等人,2003),或源自酵母(魯氏接合酵母(Zygosaccharomyces rouxii), Iyer和Singhal 2010),或源自海洋真菌(球抱白僵菌(Beauveria bassiana), Sabu等人, 2002)，或仍源自曲霉屬霉菌(Prasanth等人， 2009)。
天冬酰胺酶在食品技術(shù)中的相關(guān)用途很新。在2007年，PreventAse (DSM)酶被引入歐洲市場(chǎng)。PreventAse (DSM)酶是通過重組霉菌-黑曲霉生產(chǎn)的。使用浸泡式補(bǔ)料_分批發(fā)酵攜帶編碼米曲霉天冬酰胺酶的基因的遺傳修飾的菌株，從相關(guān)的霉菌物種——米曲霉(Aspergillus oryzea)獲得了被稱為Acrylaway (Novozymes)的競(jìng)爭(zhēng)性天冬酰胺酶。兩種曲霉(黑曲霉和米曲霉)都具有較長的安全工業(yè)應(yīng)用的歷史，在自然界中廣泛分布，且常用于生產(chǎn)食品級(jí)酶。
在烘焙應(yīng)用中，通常在熱處理食品(例如，烘焙)前，將天冬酰胺酶與生面團(tuán)混合， 以消除丙烯酰胺形成。對(duì)于油炸馬鈴薯，可以使用將土豆片浸入天冬酰胺酶的溶液或用天冬酰胺酶的溶液對(duì)其進(jìn)行噴霧。此類處理可以非常有效。在薯片生產(chǎn)中，Corrigan(2008) 報(bào)道了相比未處理過的薯片，終產(chǎn)品中的丙烯酰胺水平從1688μ g/kg減少至60μ g/kg。將丙烯酰胺形成降低> 99. 9%被認(rèn)為是可行的(Elder等人，2004)。
向食品應(yīng)用的天冬酰胺酶不造成產(chǎn)品安全性問題，因?yàn)樵诎b前步驟中的食品熱處理可以熱失活天冬酰胺酶。因此，天冬酰胺酶不可能以其活性形式與消費(fèi)者接觸。
擔(dān)子菌的酶
約1000種可食用真菌中的大部分都屬于擔(dān)子菌綱(Basidiomycota)。擔(dān)子菌通常被稱為高等真菌。擔(dān)子菌的繁殖是通過形成攜帶4個(gè)減數(shù)孢子的柱狀細(xì)胞(pillar-like cell) ο擔(dān)子菌的解剖學(xué)賦予其命名(拉丁文的Basidium = pillar)。由于其豐富的風(fēng)味、 高蛋白質(zhì)、高纖維含量和低熱量，擔(dān)子菌被世界范圍的認(rèn)可。亞洲文化還認(rèn)為許多擔(dān)子菌類真菌具有顯著的健康保護(hù)和治療活性。
腐生擔(dān)子菌通常棲居在森林碎屑、森林土壤、落葉層和倒下的樹木上。營養(yǎng)細(xì)胞在地下球狀體中延展形成長纖維狀細(xì)胞(菌絲)。為了在土壤中最難對(duì)付的有機(jī)材料—— 三維的木質(zhì)素網(wǎng)絡(luò)——生存，腐生擔(dān)子菌具有極強(qiáng)力的氧化還原酶類。所述氧化還原酶包括木質(zhì)素過氧化物酶、錳過氧化物酶、多功能過氧化物酶、產(chǎn)生H2O2的氧化酶如葡萄糖氧化酶，以及漆酶類型的酚氧化酶。還可見糖苷酶，例如纖維素酶，幫助降解木材的纖維素部分。
由于落葉樹和針葉樹不含大量的蛋白質(zhì)和氨基酸，預(yù)期生長在這類特定天然棲息地中的真菌不存在天冬酰胺酶活性。
擔(dān)子菌中的絨狀火菇栽培種也被稱為金菇(Enokitake)、金針菇或冬菇(velvet foot)。絨狀火菇形成瘦長的白色子實(shí)體，在亞洲烹飪中被用作多用途的蘑菇。該蘑菇在傳統(tǒng)上被新鮮的或罐裝的用于湯、沙拉和其他菜肴。該蘑菇可以冷藏約I周。
發(fā)明的目標(biāo)
本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)是提供具有高活性和高操作穩(wěn)定性的天冬酰胺酶。
本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)是通過使用天冬酰胺酶，降低食品中的丙烯酰胺形成。
發(fā)明概述
在本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明涉及可自擔(dān)子菌獲得的天冬酰胺酶。所述擔(dān)子菌特別是擔(dān)子菌絨狀火菇。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及水解至少一種L-天冬酰胺或L-谷氨酰胺的方法。方法包括用可自擔(dān)子菌獲得的天冬酰胺酶處理包含至少一種L-天冬酰胺或L-谷氨酰胺的物質(zhì)。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及用于降低包含L-天冬酰胺的物質(zhì)中的丙烯酰胺形成的方法。方法包括向包含L-天冬酰胺的物質(zhì)應(yīng)用可自擔(dān)子菌獲得的天冬酰胺酶。方法之后包括加熱包含L-天冬酰胺的物質(zhì)。
包含至少一種L-天冬酰胺或L-谷氨酰胺的物質(zhì)可以是食品。
本發(fā)明還涉及通過本發(fā)明的方法獲得的產(chǎn)物。
附圖
下文中，參考如下圖所示的一些實(shí)施方案來描述本發(fā)明，其中


圖1顯示了在浸沒培養(yǎng)中生長的絨狀火菇胞內(nèi)形成天冬酰胺酶的時(shí)間過程。
圖2顯示了在浸沒培養(yǎng)中生長的絨狀火菇胞外形成天冬酰胺酶的時(shí)間過程。
圖3顯示了絨狀火菇的天冬酰胺酶的(A)基因組核苷酸序列、(B)編碼核苷酸序列和(C)氨基酸序列。前19個(gè)氨基酸標(biāo)注為信號(hào)序列。
圖4顯示了絨狀火菇的天冬酰胺酶的鹽耐受，所述酶是在作為異源宿主的大腸桿菌中表達(dá)的，并作為粗酶被使用。
圖5顯示了絨狀火菇的天冬酰胺酶的pH穩(wěn)定性，所述酶是在作為異源宿主的大腸桿菌中表達(dá)的，并作為粗酶被使用。
圖6顯示了絨狀火菇的天冬酰胺酶的最佳pH。
圖7顯示了絨狀火菇的天冬酰胺酶的溫度穩(wěn)定性，所述酶是在作為異源宿主的大腸桿菌中表達(dá)的，并作為粗酶被使用。
圖8顯示了絨狀火菇的天冬酰胺酶的a)活性染色的天然聚丙烯酰胺凝膠電泳 (PAGE)和b)變性PAGE分離。
圖9顯示了絨狀火菇的天冬酰胺酶的最佳溫度。
發(fā)明詳述
為了完全理解本發(fā)明及其優(yōu)點(diǎn)，參考本發(fā)明的詳細(xì)描述和附圖。
應(yīng)該理解，本發(fā)明的各個(gè)方面僅是制備和使用本發(fā)明的具體方式的示例，其在考慮權(quán)利要求和下列詳細(xì)說明時(shí)，不作為對(duì)本發(fā)明范圍的限制。
在本發(fā)明中，術(shù)語天冬酰胺酶用于指能夠同時(shí)水解L-天冬酰胺和L-谷氨酰胺的酶。
本發(fā)明的目的是通過用天冬酰胺酶預(yù)定地酶水解丙烯酰胺前體——L-天冬酰胺， 顯著降低熱處理的食品中的致癌性丙烯酰胺的形成。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，公開了用于生產(chǎn)天冬酰胺酶的方法。天冬酰胺酶具有操作穩(wěn)定性，獲得自擔(dān)子菌絨狀火菇的菌絲體。
絨狀火菇的菌株是可通過培養(yǎng)物收藏中心商購的，例如DSMZ (Deutsche Sammlung fiir Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Germany)或 CBS (Centraalbureau voor Schimmelcultures, Utrecht, The Netherlands)。
使用擔(dān)子菌絨狀火菇的菌絲體為生產(chǎn)和培養(yǎng)的便利提供了極大優(yōu)勢(shì)，因?yàn)椴恍枰獜囊巴馐占訉?shí)體。該擔(dān)子菌絨狀火菇物種作為食材廣泛使用，因此沒有明顯的健康風(fēng)險(xiǎn)或安全性問題。
擔(dān)子菌絨狀火菇真菌可以在浸沒培養(yǎng)中方便的生長，對(duì)培養(yǎng)基添加物僅有最低要求。必需存在有機(jī)碳源、氮源 和磷源；這些來源通常由天然混合物提供，例如酵母提取物或葡萄糖加無機(jī)氨和磷酸鹽。推薦在微生物的所有營養(yǎng)培養(yǎng)基中加入微量和痕量兀素的混合物。優(yōu)選在浸沒培養(yǎng)中進(jìn)行3至20天擔(dān)子菌絨狀火菇的培養(yǎng)，優(yōu)選6至15天。在擔(dān)子菌絨狀火菇真菌培養(yǎng)過程中的溫度通常是從10至35°C，優(yōu)選從20至30°C的范圍。約4_8的 PH是典型的，約5-7的pH是優(yōu)選的。此外，低光照條件對(duì)于方法而言是典型的。
生物量和天冬酰胺酶的生產(chǎn)方法在溫和條件下操作，與現(xiàn)有技術(shù)的方法相比是環(huán)境友好的。
如圖1所示，天冬酰胺酶活性首先積累在胞內(nèi)，然后分泌到營養(yǎng)培養(yǎng)基中，如圖2 所示。
營養(yǎng)培養(yǎng)基有利于方法的操作，和使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)分離和富集天冬酰胺酶。技術(shù)可以是超濾、沉淀或吸附。因此可以獲得天冬酰胺酶的無細(xì)胞的、濃縮的培養(yǎng)上清液，并將其進(jìn)一步用于技術(shù)性水解。雖然可以通過本領(lǐng)域已知的技術(shù)分離天冬酰胺酶，但并非必須分離，本方法中也可以進(jìn)一步使用所獲得的天冬酰胺酶的粗制混合物。
在絨狀火菇的浸沒培養(yǎng)過程中，約I周后發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)天冬酰胺酶活性的峰。在12天后開始向胞外空間分泌，約14天后到達(dá)最高峰。
如圖8所示，天然聚丙烯酰胺凝膠上的活性染色驗(yàn)證了催化特異性，并在13和 74kDa表現(xiàn)出純化酶的活性條帶，表示存在單體外的寡聚體形式。
如果需要最大的天冬酰胺酶純度,可以使用枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis) 的重組產(chǎn)物。為了開發(fā)重組菌株，需要知道天冬酰胺酶的全長氨基酸序列。圖3顯示了天冬酰胺酶的全長氨基酸序列，顯示具有共計(jì)123個(gè)氨基酸部分的全長序列，從結(jié)構(gòu)基因的全長372個(gè)堿基對(duì)序列推斷而來。在編碼區(qū)前有18個(gè)堿基對(duì)的信號(hào)序列。
向底物添加天冬酰胺酶。通過向底物添加天冬酰胺酶，希望天冬酰胺酶與底物接觸。這可以包括例如用天冬酰胺酶噴霧、浸泡或包被底物。底物優(yōu)選的是包含任意一種 L-天冬酰胺或L-谷氨酰胺的食物材料。天冬酰胺酶通常向底物應(yīng)用的濃度是I至200毫摩爾的總水平，優(yōu)選10至20毫摩爾，取決于比活。天冬酰胺酶可以作為純蛋白質(zhì)添加。可選的，可以根據(jù)預(yù)期的用途定制天冬酰胺酶，這通過向天冬酰胺酶添加成分，例如乳糖、甘油或白蛋白，以利于配料(dosage)。生產(chǎn)的天冬酰胺酶或定制的天冬酰胺酶可以是酶片劑、 顆粒、穩(wěn)定的液體或糊狀制品的形式。
實(shí)施底物水解，獲得相比處理前的底物，具有顯著較低的天冬酰胺或谷氨酰胺水平的底物?？捎糜谒獾臈l件是標(biāo)準(zhǔn)的，可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員方便的確定。
由于天冬酰胺酶活性不受它所存在的化學(xué)環(huán)境的影響，待處理的底物可以是例如
飲料
可可豆
乳酪
咖啡豆
糖果(confectionery)
甜點(diǎn)·
生面團(tuán)
調(diào)料(dressings)
油炸馬鈴薯(Frenchfries)
果汁飲料
肉制品
藥膳(Medicaldiets)
營養(yǎng)添加物
寵物食品
薯片
調(diào)味料
小食
湯。
特別的是，底物是可被人或動(dòng)物消耗的任何物品。
可以通過測(cè)量天冬酰胺減少、天冬氨酸或氨增加，或者在加工食品后，通過測(cè)量任何殘留的丙烯酰胺的水平，來評(píng)估底物中的天冬酰胺的水解程度。
本發(fā)明提供的優(yōu)點(diǎn)是所獲得的新型天冬酰胺酶具有對(duì)L-天冬酰胺水解而言顯著的親和力和改善的效力。
更令人驚訝的是，天冬酰胺酶對(duì)于操作穩(wěn)定性的優(yōu)秀技術(shù)特性使其能夠用于具有升高的溫度和離子強(qiáng)度以及不同的PH條件的工藝中(圖4-7)。除水外，其他添加劑或其他協(xié)同底物(co-substrate)都不是必需的。
新型天冬酰胺酶具有良好的pH穩(wěn)定性和處于pH 5. 5至9之間的廣泛最佳pH，參見圖5和6。大部分食品的pH都位于該范圍內(nèi)。
即使在高達(dá)55°C的溫度下，天冬酰胺酶的操作穩(wěn)定性也不會(huì)減少，參見圖7。
如等電聚焦凝膠電泳所確定的，天冬酰胺酶單體和寡聚體的等電點(diǎn)接近5. 2。根據(jù)全長序列推出，天冬酰胺酶單體和寡聚體的分子量是12. 8，根據(jù)天然聚丙烯酰胺凝膠電泳 (PAGE)推出，聚集形式的分子量為約74，參見圖8。
通過ES1-MS分析確定圖3所示的天冬酰胺酶的唯一序列。最初發(fā)現(xiàn)的肽的最佳同源性被發(fā)現(xiàn)是對(duì)羧化酶/金屬肽酶(E值> 30)、脂肪酶/酯酶/脫乙酰酶(E值> 100)， 和對(duì)胃蛋白酶樣天冬氨酸/糖苷水解酶出值> 14)。一般非均相的結(jié)果和差的E值表示該天冬酰胺酶沒有先例，確實(shí)是新的。這可用唯一的來源——擔(dān)子菌物種解釋。
通過下列非限制性實(shí)施例中的示例，本文進(jìn)一步描述了本發(fā)明。
實(shí)施例
在下列實(shí)施例中，列出了使用的材料和方法。
材料和方法
培養(yǎng)絨狀火菇
在使用前高壓滅菌所有的培養(yǎng)基和設(shè)備，在整個(gè)過程中使用標(biāo)準(zhǔn)的無菌技術(shù)。 絨狀火菇保持在標(biāo)準(zhǔn)瓊脂平板(30. Og L—1葡萄糖單水合物；4. SgL-1天冬酰胺單水合物；1.5g L^1KH2PO4 ；0. 5g L^1MgSO4 ；3. Og L—1 酵母提取物；15. Og L—1 瓊脂；1. OmL L—1 痕量金屬溶液，其含有 O. 005g L-1CuSO4 · 5H20,0, 08g L-1FeCl3 · 6Η20、0· 09g L^1ZnSO4 · 7Η20,0. 03g L-1MnSO4 · H2O,以及O. 4g T1EDTA (乙二胺四乙酸))上。在滅菌前，用IM NaOH調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH至ρΗ6 ο
在IOOmL無菌的標(biāo)準(zhǔn)營養(yǎng)溶液中，使用 Ultra Turrax (Miccra D_9, Art,Miillheim, Germany)均化IOxlOmm瓊脂塞子(agar plug)和絨狀火燕的菌絲體,制備預(yù)培養(yǎng)物。將浸沒的培養(yǎng)物保持在24°C和150rpm。培養(yǎng)5天后，將50ml預(yù)培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到分別由基本培養(yǎng)基(1. 5g L-1KH2PO4 ；0. 5g L-1MgSO4 ；1. Oml L-1 痕量金屬溶液)和 40g L-1 谷蛋白或 IOmM 谷氨酰胺組成的250ml主培養(yǎng)基中。
絨狀火菇的天冬酰胺酶制品
培養(yǎng)18天后，過濾培養(yǎng)物，將含有胞外天冬酰胺酶的上清液(200mL)逆向發(fā)泡 (reverse-foamed) [I]。使用 10, OOOkDa 的 MWCO (Mi I lipore, Bedford, MA)超濾濃縮存留物，用200mM Tris/HCl pH 7. 5在Superose 6上通過尺寸排阻層析對(duì)其進(jìn)行分離。
活性測(cè)試
在37°C分別預(yù)熱在O.1M磷酸鉀pH 7. O中的IOmM L-谷氨酰胺或IOmM L-天冬酰胺。在150 μ L總反應(yīng)體積中加入50 μ L天然的或10 μ L重組的酶開始所獲得的測(cè)定，并在10-20min后，通過加入20μ L3% TCA或在95°C加熱IOmin終止。進(jìn)行沒有氨基酸的對(duì)照實(shí)驗(yàn)。用HPLC跟蹤產(chǎn)物形成。一單位的酶活性計(jì)算為在37°C下，每分鐘分別產(chǎn)生I μΜ 谷氨酸或天冬氨酸所需的酶量。
實(shí)施HPLC,其中使用 C18Nucleodur Pyramid, 5 μ m, 4mm ID 柱，甲醇作為洗脫劑 A,O.1M醋酸鈉加O. 044%三乙胺(用HCl調(diào)節(jié)pH至6. 5)作為洗脫劑B，鄰苯二醛作為衍生化試劑，以及熒光檢測(cè)儀。
游離蛋白質(zhì)
根據(jù)Lowry方法，使用牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)，估算水解上清液中的蛋白質(zhì)濃度。
最佳溫度和pH
用培養(yǎng)過程中收獲的酶溶液，或在可獲得可溶形式的重組蛋白質(zhì)之后，實(shí)施對(duì)天冬酰胺酶的最佳溫度和PH的確定。37°C下，在pH 4至9的范圍內(nèi)檢驗(yàn)最佳pH (O.1M醋酸鈉pH 4、5 ；0.1M磷酸鉀pH 6、7、8 ；0.1M碳酸鈉pH 9)。在最佳pH下，從20至70°C的范圍內(nèi)確定最佳溫度。
溫度和pH穩(wěn)定性
為了確定pH穩(wěn)定性，在40 μ L的上述各緩沖液中，在37°C孵育10 μ L重組酶16h。 加入在O.1M磷酸鉀(pH 7)中的IOOyL IOmM谷氨酰胺，在37°C孵育反應(yīng)20min。進(jìn)行沒有底物的對(duì)照實(shí)驗(yàn)。在95°C下IOmin終止反應(yīng)。在如上所述的HPLC分析后，計(jì)算所產(chǎn)生的谷氨酸。
為了分析溫度穩(wěn)定性，在40 μ L的O.1M磷酸鉀緩沖液(pH 7)中，在各個(gè)。C下孵育 10 μ L重組酶Ih。之后，加入在O.1M磷酸鉀(pH 7)中的IOOyL IOmM谷氨酰胺，在37°C孵育測(cè)定混合物20min。進(jìn)行沒有底物的對(duì)照實(shí)驗(yàn)。在95°C下IOmin終止反應(yīng)。在如上所述的HPLC分析后，計(jì)算所產(chǎn)生的谷氨酸。
ES1-串聯(lián)MS分析胰蛋白酶消化肽段
從SDS聚丙烯酰胺凝膠上切出肽酶條帶，干燥，和用胰蛋白酶消化。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程提取和純化所獲得的肽。使用 裝備了納米噴霧離子源和金包被毛細(xì)管的QtofII質(zhì)譜 (Micromass,U. K)進(jìn)行肽的電噴射離子化(ESI)MS。對(duì)于碰撞誘導(dǎo)解離實(shí)驗(yàn)，將多電荷的母離子從四極質(zhì)譜儀選擇性的轉(zhuǎn)移到碰撞室中(25-30eV)。通過正交飛行時(shí)間質(zhì)譜儀分離獲得的子離子。從ES1-串聯(lián)MS分析獲得的肽質(zhì)量指紋分析用于在公共蛋白質(zhì)基本序列數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行跨物種的蛋白質(zhì)鑒別。
天然PAGE 和變性 SDS-PAGE
在12%聚丙烯酰胺分離凝膠上實(shí)施SDS-PAGE分析。通過混合20 μ L天冬酰胺酶溶液和 20 μ L 上樣緩沖液(O.1M Tris/HCl (pH 6· 8)，O. 2MDTT，4% SDS，20%甘油，O. 2%溴酚藍(lán))，并煮沸15min來制備樣品。按每塊膠20mA電泳后，用銀或考馬斯亮藍(lán)染色凝膠。對(duì)于分子確定，使用250至IOkDa(BioRad, Germany)的標(biāo)志物蛋白。
在非變性條件下實(shí)施天然PAGE。通過與上樣緩沖液(0.05MTris/HCL(pH 6.8)、 2%505、10(%甘油、0.1(%溴酚藍(lán))1 I (v/v)混合制備樣品。在8°C下每塊膠IOmA電泳后， 在2. 5% Triton X-100中洗滌凝膠2次。染色程序基于谷氨酰胺酶對(duì)L-谷氨酰胺脫酰胺作用產(chǎn)生L-谷氨酸。谷氨酸脫氫酶對(duì)L-谷氨酸的氧化與四唑.榻■染料對(duì)其顯色的不可溶性甲 的還原相偶聯(lián)。谷氨酰胺酶染色溶液含有15mM L-谷氨酰胺、O. SgmL—1牛肝谷氨酸脫氫酶、O.1M磷酸鉀pH 7、2mg mL_1NAD>0. 04mg ml/1吩嗪硫酸甲酯和2mg ml/1氮藍(lán)四唑.銷·。在37 °C下孵育后，酶活性顯示為紫色條帶。
等電聚焦
在Multiphor II 系統(tǒng)(Pharmacia LKB, Sweden)上，使用具有 3 至 10 的固定 pH 梯度的 Servalyt Precotes 預(yù)制凝膠(Serva, Germany),在 3500V h (2000V, 6mA, 12W)實(shí)施IEF聚丙烯酰胺凝膠電泳。使用pi 3. 5至10. 7 (Serva,Germany)的蛋白質(zhì)測(cè)試混合物， 估算天冬酰胺酶的等電點(diǎn)是5。如上所述，對(duì)凝膠考馬斯藍(lán)、銀染或活性染色。
RNA-制備
使用NltcleoSpin RNA 植物試劑盒(Macherey-Nagel, Diiren, Germany),從 500mg 儲(chǔ)藏在RNALiater (Invitrogen)中的菌絲體制備 RNA。
cDNA-合成
5μ g 總 RNA 與 25pmol 3’PCR(ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG 30 * T VN)混合， 用DEPC-處理的H2O填補(bǔ)至11 μ I?；旌衔镌?0°C孵育5min，然后在冰上冷卻2min。加入 4μ I 5χ 反應(yīng)緩沖液、2 μ I dNTP 混合物(IOmM ea. ),0. 5 μ I RiboLock 和 20pmol SMART II A (AAGCAGTGGTATCMCGCAGAGTACGCGGG)，混合并在 37°C孵育 5min。在加入 200U RevertAidTM H Minus M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶后，在42°C孵育混合物60min。在70°C加熱5min進(jìn)行終止。
通過混合2. 5 μ I IOx Long PCR 緩沖液、2 μ I dNTP 混合物(2. 5mMea.)、25pmol 5，PCR(AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT)、25pmol 3，PCR、lyl DMSOUU Long PCR酶混合物、3 μ I ss cDNA和ddH20至25 μ I，進(jìn)行第二鏈合成。
在94°C孵育反應(yīng)混合物5min，然后進(jìn)行30個(gè)循環(huán)的94°C下20s，68°C下6min，在 68°C實(shí)施最終的延伸2 0min。
從Fermentas, St. Leon-Rot, Germany 購買酶和試劑。由 EurofinsMWG Operon, Ebersberg, Germany合成寡核苷酸。
序列Fishing
從肽序列推斷變性的(Degenerated)引物。通過混合2· 5μ I lOxTrueStart Taq-緩沖液、2 μ I dNTP 混合物(2. 5mM ea.)、2μ I 25mMMgCl2、25pmol 正向引物、25pmol 反向引物、0，8μ1 DMS0.0, 625UTrueStart Taq DNA聚合酶、1μ I ds cDNA和 ddH20至 25 μ 1， 實(shí)施PCR。
通過在95°C孵育反應(yīng)混合物5min，然后進(jìn)行12個(gè)循環(huán)的95°C下30s，(72°C _1°C / 循環(huán))下60s和72°C下90s，來實(shí)施Touchdown PCR[2]。在60°C退火溫度下再進(jìn)行25個(gè)循環(huán)。在72°C實(shí)施最終的延伸20min。
通過瓊脂糖凝膠電泳(1%瓊脂糖(Serva, Heidelberg, Germany),在TAE-緩沖液 (40mM Tris、20mM醋酸、ImM EDTA pH 8))中顯影，分析PCR。為了檢測(cè)DNA，在冷卻至約50°C 后，向溶液中加入 O. 05%。SYBRSafe (Invitrogen)。
用NucleoSpin Extract II 試劑盒(Macherey-Nagel)從瓊脂糖凝膠進(jìn)行 DNA 提取。
通過混合I μ I載體、I μ I IOx T4DNA連接酶緩沖液、5U T4DNA連接酶、O. 5 μ I 5mM ATP和6. 5 μ I插入DNA，將DNA片段連接到pCR2.1 TA-載體(Invitrogen)中。反應(yīng)化合物在25°C孵育2小時(shí)。
為了轉(zhuǎn)化，將5μ I連接反應(yīng)物加入到50μ I化學(xué)感受態(tài)的大腸桿菌 TOPlO(Invitrogen)中，冰上孵育20min，42°C熱激45s，重新移至冰上。立即加入500 μ I的 SOC培養(yǎng)基(Invitrogen)。在200rpm和37°C振蕩細(xì)胞60min,然后放在含有50 μ g/ml氨芐青霉素和20 μ g/ml X-Gal (Roth)的LB瓊脂上。在37 °C孵育接種平板過夜。
通過集落PCR實(shí)施陽性克隆的選擇。反應(yīng)混合物組成如上所述，但使用引物 M13uni(-21) (TGTAAAACGAC GGC CAGT)和 M13rev(_29) (CAGGAAACAGCTAT GACC)。通過在反應(yīng)混合物中重懸白色集落材料來加入模板。
反應(yīng)混合物在95°C孵育5min，再進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的95°C下30s，55°C下Imin和72°C 下lmin/kb。在72 °C實(shí)施最終延伸20min。
用NucleoSpin Plasmid DNA試劑盒(Macherey-Nagel)分離質(zhì)粒DNA。由 Eurof ins MWG Operon (Ebersberg, Germany)實(shí)施測(cè)序。
為了使序列完整，具體引物源自已鑒別的天冬酰胺酶DNA片段，且分別與引物 5’ PCR或3’ PCR配對(duì)。使用55°C的退火溫度和72°C下Imin的延伸步驟，如上所述進(jìn)行 PCR。
用弓 I 物 FvNase_5’ (ATGAAATCTTTTGCCCTCTTCG)和 FvNase_3’ (TCAAGCAAAGTGATGAAGG)實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增全長天冬酰胺酶序列，使用55 °C的退火溫度和72°C下Imin的延伸步驟。
為了驗(yàn)證序列，使用基因組DNA純化試劑盒(Fermentas),從菌絲體制備基因組 DNA。擴(kuò)增并測(cè)序全長天冬酰胺酶序列。
分析DNA和氨基酸序列通過用Signal P 3. O [3]分析進(jìn)行N端信號(hào)序列的鑒別。使用BLAST，通過GenBank 數(shù)據(jù)庫探討序列同源性[4]。
在大腸桿菌中的異源表達(dá)
為了克隆天冬酰胺酶，使用
FvNase_EcoRI(ATAGAATTCATGAAATCTTTTGCCCTCTTC)和 FvNase_BamHI(ATAGGATCC TCAAGCAAAGTCGATGAA)，用側(cè)翼的限制性位點(diǎn)EcoRI和BamHI，通過PCR從質(zhì)粒DNA擴(kuò)增基因。消化基因盒，連接到X-Zyme的pCTP2表達(dá)載體中，產(chǎn)生表達(dá)構(gòu)建體pCTP2-Aspa。37°C 下，在LB-培養(yǎng)基中生長用pCTP2-Aspa轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌株DH5 α和JM105，至OD6tltol為 O. 7，用O. 5mM IPTG誘導(dǎo)，并進(jìn)一步培養(yǎng)過夜。將細(xì)胞重懸在Tris-緩沖液pH 7. 5中，超聲裂解，通過離心去除細(xì)胞碎片。用硫酸銨促進(jìn)天冬酰胺酶的純化。
枯草芽孢桿菌的重組天冬酰胺酶
細(xì)菌分泌蛋白質(zhì)是ATP依賴性的過程，涉及前蛋白質(zhì)的易位和前蛋白質(zhì)在膜外表面上的后續(xù)蛋白水解切割，成為成熟的酶。信號(hào)序列含有靶向蛋白質(zhì)至膜用于易位所必需的全部信息。
雖然對(duì)枯草芽孢桿菌中的分泌不如對(duì)大腸桿菌中的分泌了解清楚，但一般假設(shè)其具有相同的機(jī)制(Saier, M. H.，Jr.，Werner, P. K.和 Muller, Μ. 1989, Microbiol. Rev 53 333-366 ；Overhoff, B.，Klein, M.，Spies, M.和 Freudl, R.，1991, Mol. Gen. Genet. 228 417-423)。兩類分泌蛋白之間的一個(gè)差異是其信號(hào)肽的長度，在革蘭氏陽性菌中傾向于比相應(yīng)的革蘭氏陰性菌的對(duì)應(yīng)物的長多達(dá)20個(gè)氨基酸。因此，在革蘭氏陽性生物(例如枯草芽孢桿菌)中表達(dá)異源蛋白質(zhì)的一般對(duì)策涉及匹配靶蛋白與宿主的分泌裝置(Mountain， A. , 1989, Bacillus, C. Harwood 編著，Plenum Press, New York, 73-114)。使用上述技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程是本領(lǐng)域已知的，用于通過枯草芽孢桿菌過表達(dá)重組天冬酰胺酶。
實(shí)施例1-培養(yǎng)絨狀火燕
在使用前高壓滅菌所有的培養(yǎng)基和設(shè)備，在整個(gè)過程中使用標(biāo)準(zhǔn)的無菌技術(shù)。絨狀火菇種植在標(biāo)準(zhǔn)瓊脂平板(30. Og L—1葡萄糖單水合物；4. SgL—1天冬酰胺單水合物；1. 5g L-1 KH2PO4 ；0. 5g L-1 MgSO4 ；3. Og L—1 酵母提取物；15. Og L—1 瓊脂；1. OmL L—1 痕量金屬溶液，其含有 O. 005g L-1CuSO4 · 5H20、0, 08g L-1 FeCl3 · 6Η20、0· 09g L-1 ZnSO4 · 7Η20、0· 03g L-1MnSO4 · H2O,以及0. 4g Γ1 EDTA)上。在滅菌前，用IM NaOH調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH至pH6。
在IOOmL無菌的標(biāo)準(zhǔn)營養(yǎng)溶液中，使用 Ultra Turrax (Miccra D-9, Art, MillIheim, Germany)均化IOxlOmm瓊脂塞子(agar plug)和絨狀火燕的菌絲體,制備預(yù)培養(yǎng)物。將浸沒的培養(yǎng)物保持在24°C和150rpm。培養(yǎng)5天后，將50ml預(yù)培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到分別由基本培養(yǎng)基(1. 5g L-1KH2PO4 ；0. 5g L-1 MgSO4 ；1. Oml L-1 痕量金屬溶液)和 40g L-1 谷蛋白或 IOmM 谷氨酰胺組成的250ml主培養(yǎng)基中。
實(shí)施例2-從絨狀火菇制備酶
培養(yǎng)18天后，過濾培養(yǎng)物，將含有胞外酶的上清液(200mL)逆向發(fā)泡 (reverse-foamed),天冬酰胺酶和另一種蛋白質(zhì)是留在上清液中的僅有蛋白質(zhì)。使用超濾 (MWC0 10,000)濃縮剩余的液體,通過Superose6的尺寸排阻層析分離兩種蛋白質(zhì)。
回收了大部分最初存在的水解活性，表明該方法僅通過2步就產(chǎn)生了有效的酶濃縮液。
實(shí)施例3-使用天然酶水解L-天冬酰胺
在37°C 預(yù)熱 100 μ L 在 O.1M Κ2ΗΡ04/ΚΗ2Ρ04 緩沖液(pH 7. O)中的 IOmM 天冬酰胺 5min。加入50 μ L酶溶液開始反應(yīng)。在熱振蕩器(thermoshaker)中37°C和400rpm孵育 20min的時(shí)間后，通過加入20 μ LTCA終止測(cè)定。進(jìn)行沒有底物的對(duì)照實(shí)驗(yàn)。在OPA-衍生后，用HPLC定量測(cè)量天冬氨酸的含量，然后使用樣品和對(duì)照之間的差異計(jì)算酶活性。·
分析學(xué)證據(jù)指示了底物L(fēng)-天冬酰胺的快速酶促水解。
實(shí)施例4-使用天然酶水解L-谷氨酰胺
在37°C 預(yù)熱 100 μ L 在 O.1M Κ2ΗΡ04/ΚΗ2Ρ04 緩沖液(pH 7. O)中的 IOmM 谷氨酰胺 5min。加入50 μ L酶溶液開始反應(yīng)。在熱振蕩器中37°C和400rpm孵育20min的時(shí)間后，通過加入20 μ L TCA(三氯乙酸)終止測(cè)定。進(jìn)行沒有底物的對(duì)照實(shí)驗(yàn)。在OPA-衍生后，用 HPLC定量測(cè)量谷氨酸的含量，使用樣品和對(duì)照之間的差異計(jì)算酶活性。
這一分析學(xué)證據(jù)表示天冬酰胺酶對(duì)底物L(fēng)-谷氨酰胺的有用的副活性。
實(shí)施例5-使用重組酶水解L-天冬酰胺
在37°C 預(yù)熱 140 μ L 在 O.1M Κ2ΗΡ04/ΚΗ2Ρ04 緩沖液(pH 7. O)中的 IOmM 天冬酰胺 5min。加入10 μ L用水稀釋200倍的重組酶溶液開始反應(yīng)。在熱振蕩器中37°C和400rpm 孵育IOmin的時(shí)間后，通過在95°C加熱IOmin終止測(cè)定。進(jìn)行沒有底物的對(duì)照實(shí)驗(yàn)。在 OPA-衍生后，用HPLC定量測(cè)量天冬氨酸的含量，使用樣品和對(duì)照之間的差異計(jì)算酶活性。 重組天冬酰胺酶對(duì)天冬酰胺的活性計(jì)算為43. 3kU L'
實(shí)施例6-用重組酶水解L-谷氨酰胺
在37°C 預(yù)熱 140 μ L 在 O.1M Κ2ΗΡ04/ΚΗ2Ρ04 緩沖液(pH 7. O)中的 IOmM 谷氨酰胺 5min。加入用水稀釋200倍的10 μ L重組酶溶液開始反應(yīng)。在熱振蕩器中37°C和400rpm 孵育IOmin的時(shí)間后，通過在95°C加熱IOmin終止測(cè)定。制備沒有底物的空白。在OPA-衍生后，用HPLC定量測(cè)量谷氨酸的含量，使用樣品和對(duì)照之間的差異計(jì)算酶活性。重組天冬酰胺酶對(duì)谷氨酰胺的活性計(jì)算為4. 3kU L—1。
本發(fā)明詳述如上，應(yīng)理解詳細(xì)的說明并非意在限制其發(fā)明的范圍。下列權(quán)利要求中提出了希望專利許可保護(hù)的 內(nèi)容。
權(quán)利要求
1.可自擔(dān)子菌獲得的天冬酰胺酶。
2.權(quán)利要求1的天冬酰胺酶，其中擔(dān)子菌是擔(dān)子菌絨狀火燕(Flammulinavelutipes)。
3.具有下述氨基酸序列的天冬酰胺酶MKSFALFVPL IVAAVVNSAV VTFSTGLGCN SVSQTYRGNG NFCADPPGDffSSVGFSEIGG DNRVTVHNQN SCTPASQVGQ GFGPACffNQG ATKLRSAffVACPGQRLAENG TIVDDDGAFI DFA。
4.任一項(xiàng)上述權(quán)利要求的天冬酰胺酶，其處于固體、液體或介于固體和液體之間的中間體的形式。
5.任一項(xiàng)上述權(quán)利要求的天冬酰胺酶和賦形劑的組合，所述賦形劑選自乳糖、甘油或白蛋白之任一。
6.用于水解至少一種L-天冬酰胺或L-谷氨酰胺的方法，包括 -用權(quán)利要求1至5的任一項(xiàng)的天冬酰胺酶處理包含至少一種L-天冬酰胺或L-谷氨酰胺的物質(zhì)。
7.權(quán)利要求6的方法，其中包含至少一種L-天冬酰胺或L-谷氨酰胺的物質(zhì)是至少一種可被人消耗的產(chǎn)物或可被動(dòng)物消耗的產(chǎn)物。
8.權(quán)利要求6至7的任一項(xiàng)的方法，其中物質(zhì)選自飲料、可可豆、乳酪、咖啡豆、糖果、甜點(diǎn)、生面團(tuán)、調(diào)料、油炸馬鈴薯、酒、肉制品、藥物添加物、營養(yǎng)添加物、寵物食品、薯片、調(diào)味料、小食或湯的至少一種。
9.用于降低包含L-天冬酰胺的食品物質(zhì)中的丙烯酰胺形成的方法，包括 -向包含L-天冬酰胺的食品物質(zhì)應(yīng)用權(quán)利要求1至5的任一項(xiàng)的天冬酰胺酶；和 -加熱包含L-天冬酰胺的物質(zhì)。
10.權(quán)利要求9的方法，其中加熱至至少120°C。
11.權(quán)利要求9至10的任一項(xiàng)的方法，其中L-天冬酰胺的來源是至少一種可被人消耗的產(chǎn)物或可被動(dòng)物消耗的產(chǎn)物。
12.通過權(quán)利要求6至11的任一項(xiàng)的方法可獲得的產(chǎn)物。
全文摘要
源自真菌擔(dān)子菌的天冬酰胺酶，特別地?fù)?dān)子菌是絨狀火菇(Flammulinavelutipes)。用于水解至少一種L-天冬酰胺或L-谷氨酰胺的方法。還描述了用于降低包含L-天冬酰胺的物質(zhì)中的丙烯酰胺形成的方法。
文檔編號(hào)C07K14/00GK103003297SQ201180034717
公開日2013年3月27日 申請(qǐng)日期2011年4月6日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月14日
發(fā)明者P·貝倫茨, S·拉貝, R·G·伯格, D·林克, N·艾澤勒 申請(qǐng)人:雀巢產(chǎn)品技術(shù)援助有限公司