本發(fā)明涉及一種成人t細(xì)胞白血病的特異性靶向多肽及其應(yīng)用，屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

成人t細(xì)胞白血?。╝tl，adultt-cellleukemia）是一種惡性的淋巴系統(tǒng)增殖性疾病。

近三十年的研究表明，atl與人類t淋巴細(xì)胞白血病1型病毒（htlv-1，humant-cellleukemiavirustype1）的感染密切相關(guān)，具體來說，htlv-1編碼的病毒蛋白在促進(jìn)病毒感染復(fù)制，進(jìn)而誘發(fā)成人t細(xì)胞白血病的過程中扮演極為重要的作用。

由于迄今為止，尚無有效的預(yù)防及治療atl的手段，科學(xué)家們開始探索直接以htlv-1病毒蛋白作為靶點(diǎn)的新型治療方法。

htlv-1病毒基因組，除了正向編碼結(jié)構(gòu)基因gag、pol、env，以及調(diào)控蛋白tax、rex、p12、p13和p30以外，htlv-1的反義鏈編碼hbz蛋白。hbz蛋白包含3個功能結(jié)構(gòu)域：n末端激活結(jié)構(gòu)域（addomain），c末端堿性亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域（bzipdomain），以及位于中間的中央結(jié)構(gòu)域（cddomain）。

研究證明，hbz的致癌功能通過其c末端堿性亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域參與調(diào)節(jié)多條細(xì)胞信號傳導(dǎo)途徑得以實現(xiàn)。因此，是否可以通過封閉hbz蛋白的bzip功能結(jié)構(gòu)域來靶向治療，這是本領(lǐng)域科學(xué)家們首先希望能夠解決的問題，其次，如果可以通過封閉hbz蛋白的bzip功能結(jié)構(gòu)域來靶向治療，那么什么樣的靶向藥物可以封閉hbz蛋白的bzip功能結(jié)構(gòu)域，可以有效地治療atl，這些都是本領(lǐng)域科學(xué)家們亟待研究的問題，這些問題的研究成果將為我們研發(fā)治療atl的抗病毒藥物提供一個全新的思路與策略。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

鑒于相關(guān)技術(shù)的上述問題和/或其他問題，本發(fā)明一方面提供了一種成人t細(xì)胞白血病的特異性靶向多肽，其中，所述特異性靶向多肽的序列的通式為：x-y-z-acp-r8；在所述通式中，y所代表的是如seqidno.1所示序列，acp所代表的是如seqidno.2所示序列，r8所代表的是seqidno.3所示序列；在所述通式中，x所代表的序列為如seqidno.4所示序列，z所代表的序列為seqidno.5所示序列；或者，x所代表的序列為如seqidno.4所示序列，z所代表的序列為空；或者，x與z所代表的序列同時為空。

本發(fā)明另一方面提供了一種編碼如權(quán)利要求1所述的特異性靶向多肽的基因。

本發(fā)明再一方面提供了上述的特異性靶向多肽在制備治療成人t細(xì)胞白血病的靶向藥物方面的用途。

本發(fā)明還一方面提供了一種治療成人t細(xì)胞白血病的靶向藥物，其中，所述靶向藥物包含如權(quán)利要求1所述的特異性靶向多肽。

本發(fā)明首次以htlv-1關(guān)鍵病毒蛋白hbz作為靶點(diǎn)篩選出來治療成人t細(xì)胞白血病的特異性靶向多肽，其可以用于制備治療成人t細(xì)胞白血病的靶向藥物。以本發(fā)明的特異性靶向多肽為基礎(chǔ)的靶向藥物和靶向治療手段，與傳統(tǒng)的抗腫瘤藥物的治療手段相比，細(xì)胞毒副作用較小，為今后研究抗htlv-1和atl藥物提供了一個全新的思路和策略。

附圖說明

圖1為驗證實施例1-3的特異性靶向多肽抑制hbz蛋白對ap-1信號通路的調(diào)控作用的熒光素酶報告基因檢測結(jié)果；

圖2為驗證實施例1-3的特異性靶向多肽抑制白血病細(xì)胞的惡性增殖的mtt細(xì)胞活力檢測結(jié)果；

圖3為驗證實施例1的特異性靶向多肽促進(jìn)白血病細(xì)胞凋亡的流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果。

具體實施方式

以下通過實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但本發(fā)明并不限于這些具體實施方式。

下面實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

關(guān)于本發(fā)明的成人t細(xì)胞白血病的特異性靶向多肽的序列設(shè)計理念以及技術(shù)難題簡述如下：

首先，鑒于htlv-1編碼的病毒蛋白hbz，其n端具有與c-fos相似的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域，其致癌功能也正是通過其n端所具有的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域與c-jun等亮氨酸拉鏈相關(guān)蛋白的相互結(jié)合和相互作用得以實現(xiàn)，因此，發(fā)明人希望能夠設(shè)計一種可以人工合成的、且能夠阻遏hbz蛋白與c-jun相關(guān)蛋白結(jié)合（有效封閉hbz蛋白的bzip功能結(jié)構(gòu)域）的靶向多肽，為治療atl提供新的有效的技術(shù)和手段。

其次，c-jun與c-fos形成了復(fù)合物對于細(xì)胞生命活動具有非常重要的作用，因此，待設(shè)計的靶向多肽在阻遏hbz蛋白與c-jun相關(guān)蛋白結(jié)合的同時，不能干擾fos-jun蛋白復(fù)合物的形成。待設(shè)計的靶向多肽，一方面要能夠與c-jun等相關(guān)蛋白競爭，有效封閉hbz蛋白的bzip功能結(jié)構(gòu)域，另一方面，其結(jié)構(gòu)不能與c-jun蛋白過于相似，導(dǎo)致干擾fos-jun蛋白復(fù)合物的形成。因此，由于hbz與fos的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域具有較高的相似性，這給設(shè)計靶向多肽帶來了很大的技術(shù)困難。

發(fā)明人綜合考察了hbz蛋白、c-fos蛋白以及c-jun蛋白的bzip功能結(jié)構(gòu)域中的靜電分布，以及hbz蛋白與c-jun蛋白之間、c-fos蛋白與c-jun蛋白之間的靜電互作關(guān)系，同時對fos-jun蛋白復(fù)合物進(jìn)行了x射線單晶衍射分析和對卷曲螺旋肽的測算分析，設(shè)計了大量的符合設(shè)計原則的多肽序列（以下簡稱hbap（hbzbzipassociatepeptide）序列）。進(jìn)一步地，在這些復(fù)合設(shè)計原則的hbap序列基礎(chǔ)之上，發(fā)明人有考慮到靶向多肽的靶向性和藥物輸送性能，在每個多肽序列的n端添加了8個精氨酸（簡稱r8）的細(xì)胞穿膜肽，以增加靶向多肽的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)活性，并可以作為有潛力的藥物輸送載體。更進(jìn)一步地，為了避免多肽之間發(fā)生相互作用，維持蛋白的構(gòu)象及其生物學(xué)活性，在hbap序列和r8序列之間添加了一個可彎曲的間隔序列acp。

發(fā)明人再通過試驗來驗證所設(shè)計的hbap-acp-r8序列是否能夠有效地與hbz蛋白結(jié)合，阻遏hbz蛋白與c-jun蛋白的相互作用，同時不會影響fos-jun蛋白復(fù)合物的形成。

經(jīng)過大量的設(shè)計和驗證試驗，發(fā)明人獲得了本發(fā)明的成人t細(xì)胞白血病的特異性靶向多肽，一方面其對hbz蛋白的bzip功能結(jié)構(gòu)域的親和性明顯高于c-jun蛋白與hbz蛋白之間的親和性，能夠有效封閉hbz蛋白的bzip功能結(jié)構(gòu)域，阻遏hbz蛋白與c-jun相關(guān)蛋白結(jié)合，另一方面，其對hbz蛋白的bzip功能結(jié)構(gòu)域的親和性明顯高于其對c-fos蛋白的bzip功能結(jié)構(gòu)域的結(jié)合能力，或者說其對c-fos蛋白的bzip功能結(jié)構(gòu)域的結(jié)合能力弱于c-jun蛋白對c-fos蛋白的bzip功能結(jié)構(gòu)域的結(jié)合能力，因此不會影響fos-jun蛋白復(fù)合物的形成。

本發(fā)明的成人t細(xì)胞白血病的特異性靶向多肽，其序列的通式為：x-y-z-acp-r8；在該通式中，y所代表的是如seqidno.1所示序列（leriarleekvktlkaqnselastan），acp所代表的是如seqidno.2所示序列（vqaaidying），r8所代表的是seqidno.3所示序列（rrrrrrrr）；在該通式中，x所代表的序列為如seqidno.4所示序列（rkrk），z所代表的序列為seqidno.5所示序列（mlreqvaqlk）；或者，x所代表的序列為如seqidno.4所示序列（rkrk），z所代表的序列為空；或者，x與z所代表的序列同時為空。

在上述的通式x-y-z-acp-r8中，左側(cè)一端為c末端，右側(cè)一端為n末端。

實施例1

實施例1的特異性靶向多肽的序列通式中，x代表的是seqidno.4所示序列，y代表的是seqidno.1所示序列，z代表的是seqidno.5所示序列，acp所代表的是如seqidno.2所示序列，r8所代表的是seqidno.3所示序列；即，實施例1的特異性靶向多肽的序列如下：

rkrkleriarleekvktlkaqnselastanmlreqvaqlkvqaaidyingrrrrrrrr（如seqidno.6所示序列）。

實施例2

實施例2的特異性靶向多肽的序列通式中，x代表的是seqidno.4所示序列，y代表的是seqidno.1所示序列，z代表的是空，acp所代表的是如seqidno.2所示序列，r8所代表的是seqidno.3所示序列；即，該特異性靶向多肽的序列如下：

rkrkleriarleekvktlkaqnselastanvqaaidyingrrrrrrrr（如seqidno.7所示序列）。

實施例3

實施例3的特異性靶向多肽的序列通式中，x代表的是空，y代表的是seqidno.1所示序列，z代表的是空，acp所代表的是如seqidno.2所示序列，r8所代表的是seqidno.3所示序列；即，該特異性靶向多肽的序列如下：

leriarleekvktlkaqnselastanvqaaidyingrrrrrrrr（如seqidno.8所示序列）。

上述實施例1、2和3的特異性靶向多肽均可以采用人工合成的方式來制備（例如，發(fā)明人委托百奇生物科技（蘇州）有限公司合成上述實施例1、2和3的特異性靶向多肽）。

在本發(fā)明的一個具體實施方案中，提供了編碼上述特異性靶向多肽的基因。本領(lǐng)域技術(shù)人員在獲知上述特異性靶向多肽的氨基酸序列之后，可以根據(jù)經(jīng)驗獲得對應(yīng)的編碼基因的核苷酸序列。

特異性靶向多肽抑制hbz蛋白與c-jun蛋白之間的相互作用

將表達(dá)hbz蛋白的載體pcdna3-mychis-hbz和表達(dá)c-jun蛋白的載體pcmv-ha-c-jun共轉(zhuǎn)染至293ft細(xì)胞，6小時后分別加入上述實施例1-3的特異性靶向多肽，處理48小時后，裂解細(xì)胞并提取細(xì)胞的總蛋白，再采用免疫共沉淀技術(shù)（co-ip）來分析蛋白的結(jié)合情況。

co-ip的處理過程簡述如下：20μlproteing預(yù)處理1mg總蛋白樣品30min后，收集上清蛋白，加入flag抗體，4℃旋轉(zhuǎn)混勻1h，再加入20μlproteing，4℃旋轉(zhuǎn)混勻1h。結(jié)合有抗體及目的蛋白的proteing經(jīng)過緩沖液洗滌5次后，煮沸變性，westernblot檢測目的蛋白的表達(dá)水平。

檢測結(jié)果表明：hbz蛋白能與c-jun蛋白結(jié)合，然而經(jīng)過實施例1-3的特異性靶向多肽處理后，顯著抑制了hbz與c-jun蛋白復(fù)合物的形成。

特異性靶向多肽抑制hbz蛋白對ap-1信號通路的調(diào)控作用

為了進(jìn)一步研究本發(fā)明的特異性靶向多肽對hbz蛋白所調(diào)控的ap-1信號通路的作用，我們采用了雙熒光素酶報告基因技術(shù)。我們將hbz蛋白和c-jun蛋白的表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染到對應(yīng)組別的jurkat細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染6h后分別加入實施例1-3的特異性靶向多肽進(jìn)行處理。48h后收集細(xì)胞，運(yùn)用報告基因檢測儀檢測熒光值。

結(jié)果如圖1所示，hbz蛋白可顯著抑制由c-jun激活的ap-1信號通路。然而，加入了實施例1-3的特異性靶向多肽后，hbz蛋白對ap-1信號通路的抑制作用明顯被抵消，該結(jié)果進(jìn)一步證明，實施例1-3的特異性靶向多肽能通過與hbz蛋白結(jié)合，從而干擾hbz與其他亮氨酸拉鏈蛋白的結(jié)合，進(jìn)而影響下游信號通路。

特異性靶向多肽抑制白血病細(xì)胞惡性增殖

[33]我們運(yùn)用mtt技術(shù)分析實施例1和實施例3的特異性靶向多肽通過對hbz蛋白功能的抑制是否能影響白血病細(xì)胞的惡性增殖。

參見圖2，mtt檢測細(xì)胞活力的實驗結(jié)果。從圖2的結(jié)果可以看出，感染有htlv-1病毒的atl-t和tl-om1細(xì)胞在監(jiān)測的96h內(nèi)細(xì)胞生長旺盛，但實施例1和3的特異性靶向多肽的加入可以顯著的抑制白血病細(xì)胞atl-t和atl-2的惡性增值，且該抑制作用呈現(xiàn)出劑量依賴效應(yīng)。該結(jié)果證明實施例1和3的特異性靶向多肽可以通過與hbz蛋白的互作影響hbz蛋白下游的調(diào)控信號通路，最終抑制白血病細(xì)胞的生長。

特異性靶向多肽促進(jìn)白血病細(xì)胞凋亡

為了進(jìn)一步檢測本發(fā)明的特異性靶向多肽是否影響腫瘤細(xì)胞凋亡，我們對經(jīng)實施例1的特異性靶向多肽處理后的細(xì)胞進(jìn)行annexinv/7-aad（磷脂結(jié)合蛋白v/7-氨基放線菌素d）染色，并用流式細(xì)胞術(shù)檢測。檢測結(jié)果參見圖3，實施例1的特異性靶向多肽可誘導(dǎo)25.83%的atl-t細(xì)胞發(fā)生凋亡。實施例1的特異性靶向多肽作用atl-2細(xì)胞24h后，腫瘤細(xì)胞atl-2的細(xì)胞凋亡率增加（死細(xì)胞變多）。

從圖3的結(jié)果可以看出，本發(fā)明的特異性靶向多肽可以通過抑制其蛋白結(jié)合能力，顯著抑制白血病細(xì)胞惡性增值，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

綜上所述，上述多方面的效果驗證試驗證明了本發(fā)明的特異性靶向多肽能夠有效封閉hbz蛋白的bzip功能結(jié)構(gòu)域，阻遏hbz蛋白與c-jun等亮氨酸拉鏈蛋白的結(jié)合，進(jìn)而影響hbz蛋白下游的調(diào)控信號通路，最終抑制白血病細(xì)胞的惡性增值，并促進(jìn)白血病細(xì)胞凋亡。

因此，本發(fā)明的特異性靶向多肽可以用于制備治療成人t細(xì)胞白血病的靶向藥物。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在獲知上述特異性靶向多肽之后，以本發(fā)明的特異性靶向多肽為藥物活性成分或者藥物活性成分之一，或者再結(jié)合其他常規(guī)輔料，從而獲得治療成人t細(xì)胞白血病的靶向藥物。

本發(fā)明的發(fā)明人首次以htlv-1關(guān)鍵病毒蛋白hbz作為靶點(diǎn)篩選出來治療成人t細(xì)胞白血病的特異性靶向多肽，其可以用于制備治療成人t細(xì)胞白血病的靶向藥物。以本發(fā)明的特異性靶向多肽為基礎(chǔ)的靶向藥物和靶向治療手段，與傳統(tǒng)的抗腫瘤藥物的治療手段相比，細(xì)胞毒副作用較小，為今后研究抗htlv-1和atl藥物提供了一個全新的思路和策略。

應(yīng)當(dāng)理解，雖然本說明書按照實施方式加以描述，但并非每個實施方式僅包含一個獨(dú)立的技術(shù)方案，說明書的這種敘述方式僅僅是為清楚起見，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)將說明書作為一個整體，各實施方式中的技術(shù)方案也可以經(jīng)適當(dāng)組合，形成本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的其他實施方式。

上文所列出的一系列的詳細(xì)說明僅僅是針對本發(fā)明的可行性實施方式的具體說明，它們并非用以限制本發(fā)明的保護(hù)范圍，凡未脫離本發(fā)明技藝精神所作的等效實施方式或變更均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

sequencelisting

<110>浙江師范大學(xué)

<120>一種成人t細(xì)胞白血病的特異性靶向多肽及其應(yīng)用

<130>2017-zjnu-1

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