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具有高抗原呈遞的DC細(xì)胞和抗原特異性T細(xì)胞及其制備方法和應(yīng)用與流程

文檔序號:11193006閱讀:1980來源:國知局
具有高抗原呈遞的DC細(xì)胞和抗原特異性T細(xì)胞及其制備方法和應(yīng)用與流程

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域,特別是涉及一種具有高抗原呈遞的dc細(xì)胞和抗原特異性t細(xì)胞及其制備方法和應(yīng)用。



背景技術(shù):

近年來,自體免疫細(xì)胞治療腫瘤成為繼手術(shù)、放療、化療后最有前景的腫瘤治療方法。dc細(xì)胞(dendriticcell,樹突狀細(xì)胞)是人體已知的最重要的抗原呈遞細(xì)胞,在介導(dǎo)腫瘤抗原特異性細(xì)胞免疫及腫瘤免疫應(yīng)答方面所起的作用成為人們研究之熱點。dc細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤特異性抗原呈遞及t細(xì)胞免疫應(yīng)答,既是腫瘤發(fā)病早期機體對抗腫瘤的有效手段,也是腫瘤發(fā)生免疫逃逸的重要機制。

在體內(nèi)dc細(xì)胞與t細(xì)胞(thymus-dependentlymphocyte,胸腺依賴性淋巴細(xì)胞)進(jìn)行抗原傳遞的過程中有一個關(guān)鍵的步驟:形成免疫突觸(immunologicsynapse,is)結(jié)構(gòu)。免疫突觸的結(jié)構(gòu)請參閱圖1,具體形成過程如下:大量t細(xì)胞游走于淋巴結(jié)等淋巴器官,當(dāng)t細(xì)胞遇到dc細(xì)胞時其運動速度減低并被dc細(xì)胞捕獲,接受外源信號后t細(xì)胞發(fā)生極化反應(yīng),t細(xì)胞產(chǎn)生偽足,并形成適合分子信號傳遞的三維空間結(jié)構(gòu)。細(xì)胞質(zhì)內(nèi)以微管組織中心(microtubuleorganizationcenter,mtoc)移動到靠近dc細(xì)胞的一側(cè)邊緣為基本特征的一系列細(xì)胞器重組變化發(fā)生,其表面粘附分子通過受體-配體相互作用得以緊密接觸dc細(xì)胞,形成了一個臨時性結(jié)構(gòu),該結(jié)構(gòu)以tcr-mhc-抗原肽三元結(jié)構(gòu)為簇狀中心,周圍環(huán)形分布著粘附分子,該結(jié)構(gòu)即為免疫突觸(immunologicsynapse,is)結(jié)構(gòu)。

然而,目前體外培養(yǎng)的dc細(xì)胞-t細(xì)胞之間存在抗原呈遞效率不高,t細(xì)胞特異性免疫應(yīng)答效果不理想等缺陷。



技術(shù)實現(xiàn)要素:

基于此,有必要提供一種能夠制備抗原呈遞效率高的具有高抗原呈遞的dc細(xì)胞的制備方法以及一種能夠提高t細(xì)胞特異性免疫應(yīng)答效果的抗原特異性t細(xì)胞的制備方法。

一種具有高抗原呈遞的dc細(xì)胞的制備方法,包括以下步驟:

提供dc細(xì)胞;

在所述dc細(xì)胞上負(fù)載抗原;以及

向所述dc細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入基因表達(dá)沉默劑,所述基因表達(dá)沉默劑用于沉默tao-1蛋白磷酸激酶基因的表達(dá),得到所述具有高抗原呈遞的dc細(xì)胞。

在一個實施方式中,所述基因表達(dá)沉默劑為所述tao-1蛋白磷酸激酶的shrna。

在一個實施方式中,所述tao-1蛋白磷酸激酶的shrna的正義鏈的堿基序列如seqidno.1所示,所述tao-1蛋白磷酸激酶的shrna的反義鏈的堿基序列如seqidno.2所示。

一種具有高抗原呈遞的dc細(xì)胞,所述具有高抗原呈遞的dc細(xì)胞通過上述具有高抗原呈遞的dc細(xì)胞的制備方法制備得到。

一種抗原特異性t細(xì)胞的制備方法,包括以下步驟:

提供dc細(xì)胞;

在所述dc細(xì)胞上負(fù)載抗原;

向所述dc細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入基因表達(dá)沉默劑,所述基因表達(dá)沉默劑用于沉默tao-1蛋白磷酸激酶基因的表達(dá),得到具有高抗原呈遞的dc細(xì)胞;

將t細(xì)胞與所述具有高抗原呈遞的dc細(xì)胞混合,并置于含有四環(huán)素的培養(yǎng)基中共同培養(yǎng);以及

收集共同培養(yǎng)后的所述t細(xì)胞,得到所述抗原特異性t細(xì)胞。

在一個實施方式中,所述含有四環(huán)素的培養(yǎng)基中,所述四環(huán)素的終濃度為0.5mg/ml~5mg/ml。

在一個實施方式中,所述含有四環(huán)素的培養(yǎng)基中還含有終濃度為10ng/ml~1000ng/ml的gm-csf、終濃度為0.1ng/ml~100ng/ml的il-4和體積分?jǐn)?shù)為0.1%~20%的血漿。

在一個實施方式中,所述將t細(xì)胞與所述具有高抗原呈遞的dc細(xì)胞混合,并置于含有四環(huán)素的培養(yǎng)基中共同培養(yǎng)的操作中,所述t細(xì)胞與所述具有高抗原呈遞的dc細(xì)胞的個數(shù)比為1~20:1,所述共同培養(yǎng)的時間為1天~15天。

一種抗原特異性t細(xì)胞,所述抗原特異性t細(xì)胞通過上述抗原特異性t細(xì)胞的制備方法制備得到。

上述高抗原呈遞的dc細(xì)胞的制備方法制備得到的具有高抗原呈遞的dc細(xì)胞或上述的抗原特異性t細(xì)胞的制備方法制備得到的抗原特異性t細(xì)胞在制備抗腫瘤的藥物中的應(yīng)用。

上述具有高抗原呈遞的dc細(xì)胞的制備方法,通過在dc細(xì)胞上負(fù)載抗原,并向dc細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入基因表達(dá)沉默劑得到具有高抗原呈遞的dc細(xì)胞。該具有高抗原呈遞的dc細(xì)胞與t細(xì)胞在四環(huán)素的條件下,四環(huán)素能夠調(diào)控dc細(xì)胞內(nèi)的基因表達(dá)沉默劑的開關(guān),使得dc細(xì)胞和t細(xì)胞相互接觸并形成免疫突觸結(jié)構(gòu)的過程中抑制dc細(xì)胞內(nèi)具有負(fù)調(diào)控作用的tao-1蛋白磷酸激酶的基因表達(dá),增加免疫突觸形成的時間和強度,提高形成的免疫突觸的穩(wěn)定性。而一旦dc細(xì)胞與t細(xì)胞抗原呈遞結(jié)束,即可去掉四環(huán)素,恢復(fù)dc細(xì)胞內(nèi)tao-1蛋白磷酸激酶的表達(dá),保證了dc細(xì)胞在非抗原呈遞階段的正常生理功能不受影響。結(jié)果表明,上述具有高抗原呈遞的dc細(xì)胞能夠在四環(huán)素的作用下刺激t細(xì)胞,使t細(xì)胞分化程度高,形成的抗原特異性t細(xì)胞cd3和hla-dr雙陽性的t細(xì)胞比例高,dc細(xì)胞-t細(xì)胞之間的抗原呈遞效率高。

附圖說明

圖1為一實施方式dc細(xì)胞與t細(xì)胞進(jìn)行抗原傳遞形成免疫突觸的示意圖;

圖2為一實施方式的制備具有高抗原呈遞的dc細(xì)胞的流程圖;

圖3為一實施方式的制備抗原特異性t細(xì)胞的流程圖;

圖4為實施例1中構(gòu)建的plko-tet-on/tao-1-shrna慢病毒表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)過xhoi單酶切后得到的產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖;

圖5為實施例2制備的四組t細(xì)胞cd3+及hla-dr+的流式檢測對比圖;

圖6為實施例2制備的四組t細(xì)胞對正常細(xì)胞系mcf-10a以及乳腺癌mcf-7細(xì)胞的殺傷效率的流式檢測對比圖。

具體實施方式

為使本發(fā)明的上述目的、特征和優(yōu)點能夠更加明顯易懂,下面結(jié)合具體實施例及附圖對本發(fā)明的具體實施方式做詳細(xì)的說明。在下面的描述中闡述了很多具體細(xì)節(jié)以便于充分理解本發(fā)明。但是本發(fā)明能夠以很多不同于在此描述的其它方式來實施,本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在不違背本發(fā)明內(nèi)涵的情況下做類似改進(jìn),因此本發(fā)明不受下面公開的具體實施的限制。

請參閱圖2,一實施方式的具有高抗原呈遞的dc細(xì)胞的制備方法,包括以下步驟s110~s130。

s110、提供dc細(xì)胞。

具體地,dc細(xì)胞為生物內(nèi)正常的dc細(xì)胞,可以通過提取外周血中的細(xì)胞獲得,也可以是傳代培養(yǎng)dc細(xì)胞株獲得。

本實施方式中,dc細(xì)胞為人源dc細(xì)胞。

具體地,dc細(xì)胞通過以下制備方法獲得:抽取健康志愿者的外周血,肝素抗凝,用淋巴細(xì)胞分離液分離外周血的單個核細(xì)胞。然后重懸單個核細(xì)胞,培養(yǎng)1h~4h后,洗滌并收集貼壁的細(xì)胞,得到dc細(xì)胞。

具體地,收集的dc細(xì)胞置于含有g(shù)m-csf(granulocyte-macrophagecolonystimulatingfactor,粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子)、il-4(白細(xì)胞介素4)和血漿的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。具體地,培養(yǎng)基中g(shù)m-csf的終濃度為10ng/ml~1000ng/ml,培養(yǎng)基中il-4的終濃度為0.1ng/ml~100ng/ml,培養(yǎng)基中血漿的體積分?jǐn)?shù)為0.1%~20%,促進(jìn)dc細(xì)胞的生長。

s120、在s110中的dc細(xì)胞上負(fù)載抗原。

具體地,可以根據(jù)需要,在dc細(xì)胞上負(fù)載不同的抗原。當(dāng)負(fù)載有抗原的dc細(xì)胞與t細(xì)胞相互接觸時,抗原能夠刺激t細(xì)胞形成免疫突觸結(jié)構(gòu)。

本實施方式中,dc細(xì)胞上負(fù)載的抗原為乳腺癌抗原。

具體地,向培養(yǎng)的dc細(xì)胞中加入一定量的抗原,置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1~2天,使得dc細(xì)胞上負(fù)載抗原。

具體地,負(fù)載抗原時,dc細(xì)胞與抗原的比例約為106個細(xì)胞:1ml抗原。

s130、向s120中得到的dc細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入基因表達(dá)沉默劑,該基因表達(dá)沉默劑用于沉默tao-1蛋白磷酸激酶基因的表達(dá),得到具有高抗原呈遞的dc細(xì)胞。

發(fā)明人發(fā)現(xiàn),在免疫突觸(is)形成過程中細(xì)胞骨架的動態(tài)變化及調(diào)控是實現(xiàn)其生理功能的重要基礎(chǔ)。它不僅為is的形成提供三維空間構(gòu)型的基礎(chǔ),還將眾多信號分子帶到這一區(qū)域內(nèi),同時為抗原呈遞及細(xì)胞信號傳遞提供保障。is形成需要較長時間,體外實驗觀察t細(xì)胞需要與dc細(xì)胞緊密結(jié)合數(shù)小時以上才能夠形成免疫突觸結(jié)構(gòu)。免疫突觸形成的這一特點需要維持支持其3d結(jié)構(gòu)的細(xì)胞骨架維持較長的時間不發(fā)生解聚。這是保障后續(xù)抗原交換、細(xì)胞激活信號傳遞、t細(xì)胞激活等一系列細(xì)胞生物學(xué)行為發(fā)生的重要前提和基礎(chǔ)。因此,免疫細(xì)胞調(diào)控is部位細(xì)胞骨架的信號分子及其調(diào)控機制就成為理解整個is生理功能的關(guān)鍵。

而tao-1蛋白磷酸激酶(thousand-and-oneaminoacids)是sterile-20家族的成員之一,在所有真核細(xì)胞中高保留表達(dá)。它們的共同特征是都擁有一個絲氨酸/蘇氨酸激酶結(jié)構(gòu)域。tao家族蛋白的一個重要功能是激活mapk(mitogen-activatedproteinkinase)細(xì)胞信號傳到通路,以蛋白磷酸化和去磷酸化的方式調(diào)控細(xì)胞生長因子,從而調(diào)控細(xì)胞的增殖和分裂。此外,tao-1蛋白磷酸激酶還可以在微管延長端到達(dá)細(xì)胞邊緣過渡增長時誘發(fā)微管的去穩(wěn)定性,同時可以通過調(diào)控rhogtpase(rhogtp酶)在細(xì)胞表面的位置從而動態(tài)的調(diào)控細(xì)胞極化過程。發(fā)明人猜測tao-1在細(xì)胞骨架相互作用的動態(tài)調(diào)控中扮演著重要角色,tao-1在dc細(xì)胞和t細(xì)胞相互接觸,形成免疫突觸結(jié)構(gòu)的過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的負(fù)調(diào)控作用。因此通過向dc細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入基因表達(dá)沉默劑,在dc細(xì)胞和t細(xì)胞相互接觸形成免疫突觸結(jié)構(gòu)的過程沉默t細(xì)胞內(nèi)的tao-1蛋白磷酸激酶的基因表達(dá),控制細(xì)胞接觸部位微管和細(xì)胞骨架的穩(wěn)定性,從而控制免疫突觸形成的時間和強度,提高形成的免疫突觸的穩(wěn)定性。

在一個實施方式中,基因表達(dá)沉默劑為tao-1蛋白磷酸激酶的shrna。將tao-1蛋白磷酸激酶的shrna導(dǎo)入進(jìn)入dc細(xì)胞中,shrna與tao-1蛋白磷酸激酶的mrna互補結(jié)合序列特異性地實現(xiàn)靶mrna降解。通過基因敲除的方法對dc細(xì)胞中的tao-1蛋白磷酸激酶表達(dá)基因進(jìn)行沉默,從而提高dc細(xì)胞和t細(xì)胞相互接觸形成免疫突觸的穩(wěn)定性。

具體地,tao-1蛋白磷酸激酶的shrna的正義鏈的堿基序列如seqidno.1所示,tao-1蛋白磷酸激酶的shrna的反義鏈的堿基序列如seqidno.2所示。上述堿基序列的tao-1蛋白磷酸激酶的shrna特異性好,對目的基因沉默效果穩(wěn)定。

在一個實施方式中,基因表達(dá)沉默劑負(fù)載在慢病毒中,通過慢病毒轉(zhuǎn)染進(jìn)入t細(xì)胞內(nèi),并在轉(zhuǎn)染過程中加入聚凝胺(polybrane),促進(jìn)慢病毒的轉(zhuǎn)染。具體地,加入的聚凝胺的終濃度為1μg/ml~100μg/ml。

具體地,將tao-1蛋白磷酸激酶的shrna連接到經(jīng)agei和ecor1雙酶切后慢病毒載體plko-tet-on中,得到重組plko-tet-o載體。經(jīng)酶切鑒定正確后,將其與慢病毒包裝質(zhì)粒plp1、plp2、plp/vsvg共轉(zhuǎn)染293t細(xì)胞,制備出plko-tet-on/tao-1-shrna慢病毒,然后將plko-tet-on/tao-1-shrna慢病毒轉(zhuǎn)染進(jìn)入dc細(xì)胞內(nèi)。

具體地,plko-tet-on/tao-1-shrna慢病毒轉(zhuǎn)染dc細(xì)胞時,病毒滴度moi=10~100。

通過將基因表達(dá)沉默劑負(fù)載在慢病毒中并轉(zhuǎn)染到dc細(xì)胞內(nèi),轉(zhuǎn)染效率高,轉(zhuǎn)染效果好。

上述方法制備的具有高抗原呈遞的dc細(xì)胞內(nèi)具有沉默tao-1蛋白磷酸激酶基因表達(dá)的基因表達(dá)沉默劑。該具有高抗原呈遞的dc細(xì)胞在四環(huán)素的條件下與t細(xì)胞接觸時,能夠抑制dc細(xì)胞內(nèi)具有負(fù)調(diào)控作用的tao-1蛋白磷酸激酶的基因表達(dá),提高dc細(xì)胞與t細(xì)胞形成的免疫突觸的穩(wěn)定性,增加免疫突觸形成的時間和強度,提高抗原呈遞效率,刺激t細(xì)胞分化的更成熟、更具抗原特異性。

實驗結(jié)果表明,經(jīng)上述具有高抗原呈遞的dc細(xì)胞刺激的t細(xì)胞分化更加成熟,t細(xì)胞中cd3和hla-dr雙陽性的t細(xì)胞數(shù)量占總t細(xì)胞數(shù)量的60%以上。dc細(xì)胞與t細(xì)胞表面形成的表面突觸更加穩(wěn)定,dc細(xì)胞-t細(xì)胞之間的抗原呈遞的效率高,t細(xì)胞的免疫應(yīng)答效果好。

此外,本文還提供一實施方式的具有高抗原呈遞的dc細(xì)胞及其在制備抗腫瘤的藥物中的應(yīng)用。

具體地,上述具有高抗原呈遞的dc細(xì)胞可以是應(yīng)用于預(yù)防腫瘤的疫苗,也可以是應(yīng)用于治療已經(jīng)確診為腫瘤甚至癌癥的藥物。

進(jìn)一步地,上述具有高抗原呈遞的dc細(xì)胞為用于制備抗乳腺癌的藥物。

實驗結(jié)果表明,上述具有高抗原呈遞的dc細(xì)胞能夠刺激t細(xì)胞分化更加成熟,增強t細(xì)胞對乳腺癌特異性的高效殺傷作用,而對正常的乳腺細(xì)胞的殺傷作用很小。因此,該具有高抗原呈遞的dc細(xì)胞有望應(yīng)用在抗腫瘤的藥物中,為腫瘤治療提供一種思路。

請參閱圖3,一實施方式的抗原特異性t細(xì)胞的制備方法,包括步驟s110~s150。

其中,步驟s110~s130請參見上文制備具有高抗原呈遞的dc細(xì)胞的描述,在此不作贅述。

s140、將t細(xì)胞與s130中得到的具有高抗原呈遞的dc細(xì)胞混合,并置于含有四環(huán)素的培養(yǎng)基中共同培養(yǎng)。

四環(huán)素能夠調(diào)控dc細(xì)胞內(nèi)的基因表達(dá)沉默劑的開關(guān),實驗結(jié)果表明,只有在四環(huán)素存在的情況下,tao-1蛋白磷酸激酶基因表達(dá)沉默。而一旦dc細(xì)胞與t細(xì)胞抗原呈遞結(jié)束,即可去掉四環(huán)素,恢復(fù)dc細(xì)胞內(nèi)tao-1蛋白磷酸激酶的表達(dá),保證了dc細(xì)胞在非抗原呈遞階段的正常生理功能不受影響。

在一個實施方式中,含四環(huán)素的培養(yǎng)基中,四環(huán)素的終濃度為0.5mg/ml~5mg/ml。例如0.8mg/ml、1mg/ml、2mg/ml或4mg/ml等等。四環(huán)素的濃度適宜,調(diào)控dc細(xì)胞內(nèi)的基因表達(dá)沉默劑,在dc細(xì)胞和t細(xì)胞相互接觸并形成免疫突觸結(jié)構(gòu)的過程中,抑制tao-1蛋白磷酸激酶的基因表達(dá)。

在一個實施方式中,含有四環(huán)素的培養(yǎng)基的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為無血清培養(yǎng)基,例如alys-505培養(yǎng)基。培養(yǎng)基中還含有g(shù)m-csf、il-4和血漿,gm-csf的終濃度為10ng/ml~1000ng/ml,il-4的終濃度為0.1ng/ml~100ng/ml,血漿的體積分?jǐn)?shù)為0.1%~20%。

本實施方式中,含有四環(huán)素的培養(yǎng)基的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為alys-505培養(yǎng)基,培養(yǎng)基中含有四環(huán)素、有g(shù)m-csf、il-4和血漿,四環(huán)素的終濃度為1mg/ml,gm-csf的終濃度為100ng/ml,il-4的終濃度為10ng/ml,血漿的體積分?jǐn)?shù)為10%。

具體地,血漿與提取dc細(xì)胞的外周血為同源的。培養(yǎng)基中加入gm-csf、il-4和血漿能夠促進(jìn)dc細(xì)胞的生長、增強dc細(xì)胞的抗原呈遞能力。

在一個實施方式中,將具有高抗原呈遞的dc與t細(xì)胞與混合,并置于含有四環(huán)素的培養(yǎng)基中共同培養(yǎng)的操作中,t細(xì)胞與具有高抗原呈遞的dc的個數(shù)比為1~20:1,共同培養(yǎng)的時間為1天~15天。在四環(huán)素存在的條件下,具有高抗原呈遞的dc內(nèi)tao-1蛋白磷酸激酶基因表達(dá)受到抑制,將t細(xì)胞與dc細(xì)胞共同培養(yǎng)1天以上,形成穩(wěn)定的免疫突觸結(jié)構(gòu),提高dc細(xì)胞抗原呈遞能力以及t細(xì)胞分化成熟度。

具體地,將具有高抗原呈遞的dc與t細(xì)胞混合,置于含有四環(huán)素的培養(yǎng)基中共同培養(yǎng)共同培養(yǎng)1天~7天,例如2天、3天或4天等。

具體地,混合時,具有高抗原呈遞的dc為1×105個/孔,t細(xì)胞約為1×106個/孔。將具有高抗原呈遞的dc與t細(xì)胞共同培養(yǎng),培養(yǎng)時隔天補加四環(huán)素。

s150、收集s140中共同培養(yǎng)后的t細(xì)胞,得到抗原特異性t細(xì)胞。

實驗結(jié)果表明,在四環(huán)素存在的條件下,導(dǎo)入了基因表達(dá)沉默劑的dc細(xì)胞更能高效地將抗原呈遞給t細(xì)胞,提高t細(xì)胞的成熟度和抗原特異性。該具有高抗原呈遞的dc細(xì)胞與t細(xì)胞在四環(huán)素的條件下,四環(huán)素能夠調(diào)控dc細(xì)胞內(nèi)的基因表達(dá)沉默劑的開關(guān),使得dc細(xì)胞和t細(xì)胞相互接觸并形成免疫突觸結(jié)構(gòu)的過程中抑制dc細(xì)胞內(nèi)具有負(fù)調(diào)控作用的tao-1蛋白磷酸激酶的基因表達(dá),增加免疫突觸形成的時間和強度,提高形成的免疫突觸的穩(wěn)定性。

而一旦dc細(xì)胞與t細(xì)胞抗原呈遞結(jié)束,即可去掉四環(huán)素,恢復(fù)dc細(xì)胞內(nèi)tao-1蛋白磷酸激酶的表達(dá),保證了dc細(xì)胞在非抗原呈遞階段的正常生理功能不受影響。

需要說明的是,制備具有高抗原呈遞的dc細(xì)胞和高抗原特異性的t細(xì)胞不局限于上述s110~s150的順序,本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)需要調(diào)整先后順序,例如s120與s130可以調(diào)換。

在一個實施方式中,制備得到的抗原特異性t細(xì)胞中cd3和hla-dr雙陽性的t細(xì)胞數(shù)量占總t細(xì)胞數(shù)量的60%以上。

上述制備抗原特異性t細(xì)胞,在制備時,向dc細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入基因表達(dá)沉默劑,并將負(fù)載有抗原的dc細(xì)胞與t細(xì)胞混合,置于含有四環(huán)素的培養(yǎng)基中共同培養(yǎng)。四環(huán)素能夠調(diào)控dc細(xì)胞內(nèi)的基因表達(dá)沉默劑的開關(guān),在dc細(xì)胞和t細(xì)胞相互接觸并形成免疫突觸結(jié)構(gòu)的過程中抑制具有負(fù)調(diào)控作用的tao-1蛋白磷酸激酶的基因表達(dá),提高形成的免疫突觸的穩(wěn)定性,增加免疫突觸形成的時間和強度。而一旦dc細(xì)胞與t細(xì)胞抗原呈遞結(jié)束,即可在去掉四環(huán)素,恢復(fù)dc細(xì)胞內(nèi)tao-1蛋白磷酸激酶的表達(dá),保證了dc細(xì)胞在非抗原呈遞階段的正常生理功能不受影響。

實驗結(jié)果表明,在四環(huán)素存在的條件下,導(dǎo)入了基因表達(dá)沉默劑的dc細(xì)胞與t細(xì)胞共同培養(yǎng)時,dc內(nèi)tao-1蛋白磷酸激酶基因表達(dá)受到抑制,dc細(xì)胞與t細(xì)胞表面形成的表面突觸更加穩(wěn)定,能夠刺激t細(xì)胞分化更加成熟,制備的抗原特異性t細(xì)胞中cd3和hla-dr雙陽性的t細(xì)胞數(shù)量能夠占總t細(xì)胞數(shù)量的60%以上,增強t細(xì)胞的免疫活性,得到的抗原特異性t細(xì)胞的免疫應(yīng)答效果好。

此外,本文還提供一實施方式的抗原特異性t細(xì)胞及其在制備抗腫瘤的藥物中的應(yīng)用。

具體地,上述抗原特異性t細(xì)胞可以是應(yīng)用于預(yù)防腫瘤的疫苗,也可以是應(yīng)用于治療已經(jīng)確診為腫瘤甚至癌癥的藥物。

進(jìn)一步地,上述抗原特異性t細(xì)胞為用于制備抗乳腺癌的藥物。

實驗結(jié)果表明,上述抗原特異性t細(xì)胞對乳腺癌有特異性的高效殺傷作用,而對正常的乳腺細(xì)胞的殺傷作用很小。因此,該抗原特異性t細(xì)胞有望應(yīng)用在抗腫瘤的藥物中,為腫瘤治療提供一種思路。

下面為具體實施例部分。

以下實施例中,如無特別說明,未注明具體條件的實驗方法,通常按照常規(guī)條件,例如參見薩姆布魯克、ef弗里奇、t曼尼阿蒂斯等(金冬雁,黎孟楓等譯)所著的分子克隆實驗指南[m](北京:科學(xué)出版社,1992)中所述的條件或者試劑盒生產(chǎn)廠家推薦的方法實現(xiàn)。實施例中所使用的試劑均為市售。

未特別說明,nc-dc-t表示dc細(xì)胞與t細(xì)胞共同培養(yǎng)后,收集的第一陰性對照t細(xì)胞。elv-dc-t表示plko-tet-on空載體慢病毒感染dc細(xì)胞與t細(xì)胞共同培養(yǎng)后,收集的第二陰性對照t細(xì)胞。tlv-dc-t表示plko-tet-on/tao-1-shrna慢病毒感染dc細(xì)胞與t細(xì)胞共同培養(yǎng)后,收集的第三陰性對照t細(xì)胞。tet-tlv-dc-t(抗原特異性t細(xì)胞)表示plko-tet-on/tao-1-shrna慢病毒感染dc細(xì)胞與t細(xì)胞在四環(huán)素的條件下共同培養(yǎng)后,收集的抗原特異性t細(xì)胞。

實施例1

制備基因表達(dá)沉默劑

(1)設(shè)計tao-1蛋白磷酸激酶的shrna

利用thermo網(wǎng)站的shrna序列在線設(shè)計程序(http://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/setoption.do?designoption=shrna&pid=-2900031043253144145),設(shè)計出tao-1shrnaoligos序列,如下所示:

正義鏈:

5’-ccggggaagtcaagtttctacaaagctcgagctttgtagaaacttgacttccttttt-3’(seqidno.1)。

反義鏈:

5’-aattggaagtcaagtttctacaaagctcgagctttgtagaaacttgacttcc-3’(seqidno.2)。

(2)制備plko-tet-on/tao-1-shrna慢病毒

將上述設(shè)計的tao-1蛋白磷酸激酶的shrna送交基因公司合成,利用agei和ecor1雙酶切慢病毒載體plko-tet-on,將退火后的tao-1-shrna寡核苷酸鏈連接到plko-tet-on載體中,dna連接反應(yīng)體系如下:

室溫反應(yīng)3h后,對連接產(chǎn)物plko-tet-on/tao-1-shrna慢病毒表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定。構(gòu)建的plko-tet-on/tao-1-shrna慢病毒表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)過xhoi單酶切后得到的產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測,結(jié)果如圖4,分別在大約150bp、200bp和8kb處有三條清晰條帶,與預(yù)期片段數(shù)和片段大小一致(8kb條帶因為慢病毒載體plko-tet-on中也有一個xhoi酶切位點)。證明tao-1-shrna寡核苷酸成功插入到plko-tet-on載體中。經(jīng)酶切鑒定正確后,將其與三個慢病毒包裝質(zhì)粒plp1、plp2、plp/vsvg共轉(zhuǎn)染293t細(xì)胞,制備出plko-tet-on/tao-1-shrna慢病毒。

實施例2

dc細(xì)胞和t細(xì)胞共同培養(yǎng)制備具有高抗原呈遞的dc細(xì)胞以及抗原特異性t細(xì)胞

1、dc細(xì)胞和t細(xì)胞的培養(yǎng)

(1)抽取健康志愿者外周血50ml,肝素抗凝,用淋巴細(xì)胞分離液分離出外周血單個核細(xì)胞(pbmc)。

(2)用含10%自體血漿的alys-505培養(yǎng)液重懸pbmc細(xì)胞,分裝入六孔板中,5×106個/ml,2ml/孔,置于飽和濕度、37℃、5.0%co2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2h。

(3)洗滌并收集(2)中未貼壁的細(xì)胞,該未貼壁細(xì)胞為t細(xì)胞。將未貼壁的細(xì)胞用含50ng/mlcd3單抗、1000u/ml的il-2和0.5%自體血漿的alys-505培養(yǎng)液進(jìn)行刺激培養(yǎng),調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/ml,轉(zhuǎn)入六孔板中,2ml/孔,同時每孔添加1000u/ml的ifn-γ,置于飽和濕度、37℃、5.0%co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每3天調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/ml,添加含1000u/ml的il-2和0.5%自體血漿的alys-505培養(yǎng)液。

(4)保留(2)中貼壁細(xì)胞于六孔板中,貼壁細(xì)胞為dc細(xì)胞,向六孔板加入含100ng/mlgm-csf、10ng/ml的il-4及10%自體血漿的alys-505培養(yǎng)液,置于飽和濕度、37℃、5.0%co2培養(yǎng)箱中誘導(dǎo)培養(yǎng)dc細(xì)胞。培養(yǎng)3天后半量換液并補充新鮮的細(xì)胞因子,另外加入一支腫瘤抗原(本專利使用乳腺癌細(xì)胞系mcf-7的凍融抗原,1ml)對dc細(xì)胞進(jìn)行抗原負(fù)載,置于飽和濕度、37℃、5.0%co2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48h。

(5)收集(4中)培養(yǎng)的dc細(xì)胞,計數(shù),離心后以含100ng/mlgm-csf、10ng/mlil-4及10%自體血漿的alys-505培養(yǎng)液重懸細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度,接種于6孔板中,1×105個細(xì)胞/孔,共接種8個孔。實驗平均分成四組,每組2個平行對照。4組細(xì)胞分別為陰性對照dc細(xì)胞組(nc-dc-t)、plko-tet-on空載體慢病毒感染dc細(xì)胞組(elv-dc-t)、plko-tet-on/tao-1-shrna慢病毒感染dc細(xì)胞組(tlv-dc-t)、四環(huán)素誘導(dǎo)的plko-tet-on/tao-1-shrna慢病毒感染t細(xì)胞組(tet-tlv-dc-t)。

(6)按照moi=30的比值,elv-dc-t組加入plko-tet-on空載體慢病毒,tlv-dc-t細(xì)胞組和tet-tlv-dc-t細(xì)胞組分別加入plko-tet-on/tao-1-shrna慢病毒,同時加入8μg/ml的polybrane促進(jìn)慢病毒感染,病毒轉(zhuǎn)染后,培養(yǎng)24h。

(7)將(6)中培養(yǎng)的各組dc細(xì)胞更換新鮮的含100ng/mlgm-csf、10ng/ml的il-4及10%自體血漿的alys-505培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)24h。

(8)在(7)中培養(yǎng)的各組dc細(xì)胞每孔加入106個(3)中培養(yǎng)的t細(xì)胞,與dc細(xì)胞共培養(yǎng)。其中,tet-tlv-dc-t細(xì)胞組額外加入1mg/ml四環(huán)素,共同培養(yǎng)48h。

(9)補加新鮮的t細(xì)胞完全培養(yǎng)基(含1000u/mlil-2和0.5%自體血漿的alys-505培養(yǎng)液),tet-tlv-dc-t細(xì)胞組額外加入1mg/ml四環(huán)素,繼續(xù)共同培養(yǎng)48h。

(10)補加新鮮的t細(xì)胞完全培養(yǎng)基,tet-tlv-dc-t細(xì)胞組不再添加四環(huán)素,繼續(xù)共同培養(yǎng)48h。

(11)收獲四組dc細(xì)胞刺激的t細(xì)胞(nc-dc-t、elv-dc-t、tlv-dc-t、tet-tlv-dc-t),其中t細(xì)胞增殖較快,而dc細(xì)胞基本不增值。共同培養(yǎng)后,貼壁生長的為具有高抗原呈遞的dc細(xì)胞,懸浮生長為t細(xì)胞。然后檢測各組t細(xì)胞表面hla-dr的表達(dá),以及t細(xì)胞對乳腺癌細(xì)胞系mcf-7的特異性殺傷作用。

t細(xì)胞成熟度的流式檢測

將實施例2中收取的第一陰性對照組、第二陰性對照組、第三陰性對照組以及實驗組的四組t細(xì)胞(nc-dc-t、elv-dc-t、tlv-dc-t、tet-tlv-dc-t)分別取1×106個細(xì)胞,pbs洗滌一次后,利用cd3-fitc抗體、hla-dr-percp抗體進(jìn)行染色,流式上樣檢測t細(xì)胞中cd3+以及hla-dr+的t細(xì)胞的比例,以鑒定四組t細(xì)胞在成熟度上的差異。

四組t細(xì)胞cd3+且hla-dr+比例的流式檢測結(jié)果如圖5所示。流式檢測圖中左上角內(nèi)的散點表示cd3-而hla-dr+的t細(xì)胞,左下角內(nèi)的散點表示cd3-且hla-dr-的t細(xì)胞,右上角內(nèi)的散點表示cd3+且hla-dr+雙陽性的t細(xì)胞,右下角內(nèi)的散點表示cd3+而hla-dr-的t細(xì)胞。一般cd3+表示的淋巴細(xì)胞為t細(xì)胞,且hla-dr+表示分化后活性好的t細(xì)胞。右上角內(nèi)百分?jǐn)?shù)表示cd3+且hla-dr+的t細(xì)胞的比例。其中nc-dc-t組比例最低,為28.30%。elv-dc-t組和tlv-dc-t組的cd3+且hla-dr+比例接近,分別為43.28%和46.03%。說明在沒有四環(huán)素誘導(dǎo)時,tlv-dc細(xì)胞對t細(xì)胞的刺激作用與空病毒載體感染elv-dc細(xì)胞相比,沒有顯著差異。而tet-tlv-dc-t細(xì)胞組的cd3+hla-dr+比例最高,達(dá)到63.58%,與其它組相比有顯著差異,說明在四環(huán)素誘導(dǎo)下,轉(zhuǎn)染了plko-tet-on/tao-1-shrna慢病毒的dc細(xì)胞可以刺激獲得更成熟、更活化的t細(xì)胞。

t細(xì)胞對靶細(xì)胞殺傷的流式檢測結(jié)果

(1)以實施例2中收取的第一陰性對照組、第二陰性對照組、第三陰性對照組以及實驗組的四組t細(xì)胞nc-dc-t、elv-dc-t、tlv-dc-t、tet-tlv-dc-t分別作為效應(yīng)細(xì)胞,分別以cfse標(biāo)記的乳腺癌mcf-7細(xì)胞、cfse標(biāo)記的乳腺正常細(xì)胞系mcf-10a作為靶細(xì)胞,按照20:1的效靶比混合效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞,輕輕混勻,置于5%co2,37℃培養(yǎng)箱中孵育。

(2)24h后,加入1μg/mlpi染液,混勻,室溫避光孵育15min后,利用流式細(xì)胞儀檢測cfse+pi+細(xì)胞(死亡的靶細(xì)胞)的百分率。

實驗結(jié)果如圖6所示:各組t細(xì)胞對正常細(xì)胞系mcf-10a的殺傷效率差異不大,殺傷效率大致相同,在13%~16%之間。而各組t細(xì)胞對乳腺癌mcf-7細(xì)胞的殺傷效率則有較大的區(qū)別:nc-dc-t細(xì)胞的殺傷效率最低,僅有18.23%的靶細(xì)胞被殺傷。在dc與t細(xì)胞共培養(yǎng)過程中沒有添加四環(huán)素時,tlv-dc-t細(xì)胞對mcf-7的殺傷比例為32.78%。而dc與t細(xì)胞共培養(yǎng)時添加1mg/ml四環(huán)素獲得的tet-tlv-dc-t細(xì)胞對mcf-7細(xì)胞的殺傷比例提高到了68.92%。

這一結(jié)果說明,在四環(huán)素誘導(dǎo)下,plko-tet-on/tao-1-shrna慢病毒感染dc細(xì)胞所刺激的t細(xì)胞(tet-tlv-dc-t)對乳腺癌細(xì)胞mcf-7有特異性的高效殺傷作用,而對正常的乳腺細(xì)胞mcf-10a的殺傷作用很小。

綜上,與對照組相比,在四環(huán)素的條件下,經(jīng)plko-tet-on/tao-1-shrna慢病毒感染dc細(xì)胞與t細(xì)胞共同培養(yǎng)能夠得到具有高抗原呈遞的dc細(xì)胞。dc細(xì)胞刺激收集的抗原特異性t細(xì)胞的cd3和hla-dr雙陽性的t細(xì)胞比例高,t細(xì)胞分化更加成熟,dc細(xì)胞-t細(xì)胞之間的抗原呈遞的效率高,t細(xì)胞的免疫應(yīng)答效果好??乖禺愋詔細(xì)胞對乳腺癌有特異性的高效殺傷作用,而對正常的乳腺細(xì)胞的殺傷作用很小,有望應(yīng)用在抗腫瘤的藥物中,為腫瘤治療提供一種思路。

以上所述實施例僅表達(dá)了本發(fā)明的一種或幾種實施方式,其描述較為具體和詳細(xì),但并不能因此而理解為對本發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是,對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說,在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下,還可以做出若干變形和改進(jìn),這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此,本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。

sequencelisting

<110>劉韜

<120>具有高抗原呈遞的dc細(xì)胞和抗原特異性t細(xì)胞及其制備方法和應(yīng)用

<160>2

<170>patentinversion3.3

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<213>人工序列

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<212>dna

<213>人工序列

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