本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種具有高抗原呈遞的dc細(xì)胞和抗原特異性t細(xì)胞及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

近年來，自體免疫細(xì)胞治療腫瘤成為繼手術(shù)、放療、化療后最有前景的腫瘤治療方法。dc細(xì)胞(dendriticcell，樹突狀細(xì)胞)是人體已知的最重要的抗原呈遞細(xì)胞，在介導(dǎo)腫瘤抗原特異性細(xì)胞免疫及腫瘤免疫應(yīng)答方面所起的作用成為人們研究之熱點。dc細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤特異性抗原呈遞及t細(xì)胞免疫應(yīng)答，既是腫瘤發(fā)病早期機體對抗腫瘤的有效手段，也是腫瘤發(fā)生免疫逃逸的重要機制。

在體內(nèi)dc細(xì)胞與t細(xì)胞(thymus-dependentlymphocyte，胸腺依賴性淋巴細(xì)胞)進(jìn)行抗原傳遞的過程中有一個關(guān)鍵的步驟：形成免疫突觸(immunologicsynapse，is)結(jié)構(gòu)。免疫突觸的結(jié)構(gòu)請參閱圖1，具體形成過程如下：大量t細(xì)胞游走于淋巴結(jié)等淋巴器官，當(dāng)t細(xì)胞遇到dc細(xì)胞時其運動速度減低并被dc細(xì)胞捕獲，接受外源信號后t細(xì)胞發(fā)生極化反應(yīng)，t細(xì)胞產(chǎn)生偽足，并形成適合分子信號傳遞的三維空間結(jié)構(gòu)。細(xì)胞質(zhì)內(nèi)以微管組織中心(microtubuleorganizationcenter,mtoc)移動到靠近dc細(xì)胞的一側(cè)邊緣為基本特征的一系列細(xì)胞器重組變化發(fā)生，其表面粘附分子通過受體－配體相互作用得以緊密接觸dc細(xì)胞，形成了一個臨時性結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)以tcr-mhc-抗原肽三元結(jié)構(gòu)為簇狀中心，周圍環(huán)形分布著粘附分子，該結(jié)構(gòu)即為免疫突觸(immunologicsynapse，is)結(jié)構(gòu)。

然而，目前體外培養(yǎng)的dc細(xì)胞-t細(xì)胞之間存在抗原呈遞效率不高，t細(xì)胞特異性免疫應(yīng)答效果不理想等缺陷。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

基于此，有必要提供一種能夠制備抗原呈遞效率高的具有高抗原呈遞的dc細(xì)胞的制備方法以及一種能夠提高t細(xì)胞特異性免疫應(yīng)答效果的抗原特異性t細(xì)胞的制備方法。

一種具有高抗原呈遞的dc細(xì)胞的制備方法，包括以下步驟：

提供dc細(xì)胞；

在所述dc細(xì)胞上負(fù)載抗原；以及

向所述dc細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入基因表達(dá)沉默劑，所述基因表達(dá)沉默劑用于沉默tao-1蛋白磷酸激酶基因的表達(dá)，得到所述具有高抗原呈遞的dc細(xì)胞。

在一個實施方式中，所述基因表達(dá)沉默劑為所述tao-1蛋白磷酸激酶的shrna。

在一個實施方式中，所述tao-1蛋白磷酸激酶的shrna的正義鏈的堿基序列如seqidno.1所示，所述tao-1蛋白磷酸激酶的shrna的反義鏈的堿基序列如seqidno.2所示。

一種具有高抗原呈遞的dc細(xì)胞，所述具有高抗原呈遞的dc細(xì)胞通過上述具有高抗原呈遞的dc細(xì)胞的制備方法制備得到。

一種抗原特異性t細(xì)胞的制備方法，包括以下步驟：

提供dc細(xì)胞；

在所述dc細(xì)胞上負(fù)載抗原；

向所述dc細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入基因表達(dá)沉默劑，所述基因表達(dá)沉默劑用于沉默tao-1蛋白磷酸激酶基因的表達(dá)，得到具有高抗原呈遞的dc細(xì)胞；

將t細(xì)胞與所述具有高抗原呈遞的dc細(xì)胞混合，并置于含有四環(huán)素的培養(yǎng)基中共同培養(yǎng)；以及

收集共同培養(yǎng)后的所述t細(xì)胞，得到所述抗原特異性t細(xì)胞。

在一個實施方式中，所述含有四環(huán)素的培養(yǎng)基中，所述四環(huán)素的終濃度為0.5mg/ml～5mg/ml。

在一個實施方式中，所述含有四環(huán)素的培養(yǎng)基中還含有終濃度為10ng/ml～1000ng/ml的gm-csf、終濃度為0.1ng/ml～100ng/ml的il-4和體積分?jǐn)?shù)為0.1％～20％的血漿。

在一個實施方式中，所述將t細(xì)胞與所述具有高抗原呈遞的dc細(xì)胞混合，并置于含有四環(huán)素的培養(yǎng)基中共同培養(yǎng)的操作中，所述t細(xì)胞與所述具有高抗原呈遞的dc細(xì)胞的個數(shù)比為1～20：1，所述共同培養(yǎng)的時間為1天～15天。

一種抗原特異性t細(xì)胞，所述抗原特異性t細(xì)胞通過上述抗原特異性t細(xì)胞的制備方法制備得到。

上述高抗原呈遞的dc細(xì)胞的制備方法制備得到的具有高抗原呈遞的dc細(xì)胞或上述的抗原特異性t細(xì)胞的制備方法制備得到的抗原特異性t細(xì)胞在制備抗腫瘤的藥物中的應(yīng)用。

上述具有高抗原呈遞的dc細(xì)胞的制備方法，通過在dc細(xì)胞上負(fù)載抗原，并向dc細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入基因表達(dá)沉默劑得到具有高抗原呈遞的dc細(xì)胞。該具有高抗原呈遞的dc細(xì)胞與t細(xì)胞在四環(huán)素的條件下，四環(huán)素能夠調(diào)控dc細(xì)胞內(nèi)的基因表達(dá)沉默劑的開關(guān)，使得dc細(xì)胞和t細(xì)胞相互接觸并形成免疫突觸結(jié)構(gòu)的過程中抑制dc細(xì)胞內(nèi)具有負(fù)調(diào)控作用的tao-1蛋白磷酸激酶的基因表達(dá)，增加免疫突觸形成的時間和強度，提高形成的免疫突觸的穩(wěn)定性。而一旦dc細(xì)胞與t細(xì)胞抗原呈遞結(jié)束，即可去掉四環(huán)素，恢復(fù)dc細(xì)胞內(nèi)tao-1蛋白磷酸激酶的表達(dá)，保證了dc細(xì)胞在非抗原呈遞階段的正常生理功能不受影響。結(jié)果表明，上述具有高抗原呈遞的dc細(xì)胞能夠在四環(huán)素的作用下刺激t細(xì)胞，使t細(xì)胞分化程度高，形成的抗原特異性t細(xì)胞cd3和hla-dr雙陽性的t細(xì)胞比例高，dc細(xì)胞-t細(xì)胞之間的抗原呈遞效率高。

附圖說明

圖1為一實施方式dc細(xì)胞與t細(xì)胞進(jìn)行抗原傳遞形成免疫突觸的示意圖；

圖2為一實施方式的制備具有高抗原呈遞的dc細(xì)胞的流程圖；

圖3為一實施方式的制備抗原特異性t細(xì)胞的流程圖；

圖4為實施例1中構(gòu)建的plko-tet-on/tao-1-shrna慢病毒表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)過xhoi單酶切后得到的產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖；

圖5為實施例2制備的四組t細(xì)胞cd3⁺及hla-dr⁺的流式檢測對比圖；

圖6為實施例2制備的四組t細(xì)胞對正常細(xì)胞系mcf-10a以及乳腺癌mcf-7細(xì)胞的殺傷效率的流式檢測對比圖。

具體實施方式

為使本發(fā)明的上述目的、特征和優(yōu)點能夠更加明顯易懂，下面結(jié)合具體實施例及附圖對本發(fā)明的具體實施方式做詳細(xì)的說明。在下面的描述中闡述了很多具體細(xì)節(jié)以便于充分理解本發(fā)明。但是本發(fā)明能夠以很多不同于在此描述的其它方式來實施，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在不違背本發(fā)明內(nèi)涵的情況下做類似改進(jìn)，因此本發(fā)明不受下面公開的具體實施的限制。

請參閱圖2，一實施方式的具有高抗原呈遞的dc細(xì)胞的制備方法，包括以下步驟s110～s130。

s110、提供dc細(xì)胞。

具體地，dc細(xì)胞為生物內(nèi)正常的dc細(xì)胞，可以通過提取外周血中的細(xì)胞獲得，也可以是傳代培養(yǎng)dc細(xì)胞株獲得。

本實施方式中，dc細(xì)胞為人源dc細(xì)胞。

具體地，dc細(xì)胞通過以下制備方法獲得：抽取健康志愿者的外周血，肝素抗凝，用淋巴細(xì)胞分離液分離外周血的單個核細(xì)胞。然后重懸單個核細(xì)胞，培養(yǎng)1h～4h后，洗滌并收集貼壁的細(xì)胞，得到dc細(xì)胞。

具體地，收集的dc細(xì)胞置于含有g(shù)m-csf(granulocyte-macrophagecolonystimulatingfactor，粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子)、il-4(白細(xì)胞介素4)和血漿的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。具體地，培養(yǎng)基中g(shù)m-csf的終濃度為10ng/ml～1000ng/ml，培養(yǎng)基中il-4的終濃度為0.1ng/ml～100ng/ml，培養(yǎng)基中血漿的體積分?jǐn)?shù)為0.1％～20％，促進(jìn)dc細(xì)胞的生長。

s120、在s110中的dc細(xì)胞上負(fù)載抗原。

具體地，可以根據(jù)需要，在dc細(xì)胞上負(fù)載不同的抗原。當(dāng)負(fù)載有抗原的dc細(xì)胞與t細(xì)胞相互接觸時，抗原能夠刺激t細(xì)胞形成免疫突觸結(jié)構(gòu)。

本實施方式中，dc細(xì)胞上負(fù)載的抗原為乳腺癌抗原。

具體地，向培養(yǎng)的dc細(xì)胞中加入一定量的抗原，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～2天，使得dc細(xì)胞上負(fù)載抗原。

具體地，負(fù)載抗原時，dc細(xì)胞與抗原的比例約為10⁶個細(xì)胞：1ml抗原。

s130、向s120中得到的dc細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入基因表達(dá)沉默劑，該基因表達(dá)沉默劑用于沉默tao-1蛋白磷酸激酶基因的表達(dá)，得到具有高抗原呈遞的dc細(xì)胞。

發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在免疫突觸(is)形成過程中細(xì)胞骨架的動態(tài)變化及調(diào)控是實現(xiàn)其生理功能的重要基礎(chǔ)。它不僅為is的形成提供三維空間構(gòu)型的基礎(chǔ)，還將眾多信號分子帶到這一區(qū)域內(nèi)，同時為抗原呈遞及細(xì)胞信號傳遞提供保障。is形成需要較長時間，體外實驗觀察t細(xì)胞需要與dc細(xì)胞緊密結(jié)合數(shù)小時以上才能夠形成免疫突觸結(jié)構(gòu)。免疫突觸形成的這一特點需要維持支持其3d結(jié)構(gòu)的細(xì)胞骨架維持較長的時間不發(fā)生解聚。這是保障后續(xù)抗原交換、細(xì)胞激活信號傳遞、t細(xì)胞激活等一系列細(xì)胞生物學(xué)行為發(fā)生的重要前提和基礎(chǔ)。因此，免疫細(xì)胞調(diào)控is部位細(xì)胞骨架的信號分子及其調(diào)控機制就成為理解整個is生理功能的關(guān)鍵。

而tao-1蛋白磷酸激酶(thousand-and-oneaminoacids)是sterile-20家族的成員之一，在所有真核細(xì)胞中高保留表達(dá)。它們的共同特征是都擁有一個絲氨酸/蘇氨酸激酶結(jié)構(gòu)域。tao家族蛋白的一個重要功能是激活mapk(mitogen-activatedproteinkinase)細(xì)胞信號傳到通路，以蛋白磷酸化和去磷酸化的方式調(diào)控細(xì)胞生長因子，從而調(diào)控細(xì)胞的增殖和分裂。此外，tao-1蛋白磷酸激酶還可以在微管延長端到達(dá)細(xì)胞邊緣過渡增長時誘發(fā)微管的去穩(wěn)定性，同時可以通過調(diào)控rhogtpase(rhogtp酶)在細(xì)胞表面的位置從而動態(tài)的調(diào)控細(xì)胞極化過程。發(fā)明人猜測tao-1在細(xì)胞骨架相互作用的動態(tài)調(diào)控中扮演著重要角色，tao-1在dc細(xì)胞和t細(xì)胞相互接觸，形成免疫突觸結(jié)構(gòu)的過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的負(fù)調(diào)控作用。因此通過向dc細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入基因表達(dá)沉默劑，在dc細(xì)胞和t細(xì)胞相互接觸形成免疫突觸結(jié)構(gòu)的過程沉默t細(xì)胞內(nèi)的tao-1蛋白磷酸激酶的基因表達(dá)，控制細(xì)胞接觸部位微管和細(xì)胞骨架的穩(wěn)定性，從而控制免疫突觸形成的時間和強度，提高形成的免疫突觸的穩(wěn)定性。

在一個實施方式中，基因表達(dá)沉默劑為tao-1蛋白磷酸激酶的shrna。將tao-1蛋白磷酸激酶的shrna導(dǎo)入進(jìn)入dc細(xì)胞中，shrna與tao-1蛋白磷酸激酶的mrna互補結(jié)合序列特異性地實現(xiàn)靶mrna降解。通過基因敲除的方法對dc細(xì)胞中的tao-1蛋白磷酸激酶表達(dá)基因進(jìn)行沉默，從而提高dc細(xì)胞和t細(xì)胞相互接觸形成免疫突觸的穩(wěn)定性。

具體地，tao-1蛋白磷酸激酶的shrna的正義鏈的堿基序列如seqidno.1所示，tao-1蛋白磷酸激酶的shrna的反義鏈的堿基序列如seqidno.2所示。上述堿基序列的tao-1蛋白磷酸激酶的shrna特異性好，對目的基因沉默效果穩(wěn)定。

在一個實施方式中，基因表達(dá)沉默劑負(fù)載在慢病毒中，通過慢病毒轉(zhuǎn)染進(jìn)入t細(xì)胞內(nèi)，并在轉(zhuǎn)染過程中加入聚凝胺(polybrane)，促進(jìn)慢病毒的轉(zhuǎn)染。具體地，加入的聚凝胺的終濃度為1μg/ml～100μg/ml。

具體地，將tao-1蛋白磷酸激酶的shrna連接到經(jīng)agei和ecor1雙酶切后慢病毒載體plko-tet-on中，得到重組plko-tet-o載體。經(jīng)酶切鑒定正確后，將其與慢病毒包裝質(zhì)粒plp1、plp2、plp/vsvg共轉(zhuǎn)染293t細(xì)胞，制備出plko-tet-on/tao-1-shrna慢病毒，然后將plko-tet-on/tao-1-shrna慢病毒轉(zhuǎn)染進(jìn)入dc細(xì)胞內(nèi)。

具體地，plko-tet-on/tao-1-shrna慢病毒轉(zhuǎn)染dc細(xì)胞時，病毒滴度moi＝10～100。

通過將基因表達(dá)沉默劑負(fù)載在慢病毒中并轉(zhuǎn)染到dc細(xì)胞內(nèi)，轉(zhuǎn)染效率高，轉(zhuǎn)染效果好。

上述方法制備的具有高抗原呈遞的dc細(xì)胞內(nèi)具有沉默tao-1蛋白磷酸激酶基因表達(dá)的基因表達(dá)沉默劑。該具有高抗原呈遞的dc細(xì)胞在四環(huán)素的條件下與t細(xì)胞接觸時，能夠抑制dc細(xì)胞內(nèi)具有負(fù)調(diào)控作用的tao-1蛋白磷酸激酶的基因表達(dá)，提高dc細(xì)胞與t細(xì)胞形成的免疫突觸的穩(wěn)定性，增加免疫突觸形成的時間和強度，提高抗原呈遞效率，刺激t細(xì)胞分化的更成熟、更具抗原特異性。

實驗結(jié)果表明，經(jīng)上述具有高抗原呈遞的dc細(xì)胞刺激的t細(xì)胞分化更加成熟，t細(xì)胞中cd3和hla-dr雙陽性的t細(xì)胞數(shù)量占總t細(xì)胞數(shù)量的60％以上。dc細(xì)胞與t細(xì)胞表面形成的表面突觸更加穩(wěn)定，dc細(xì)胞-t細(xì)胞之間的抗原呈遞的效率高，t細(xì)胞的免疫應(yīng)答效果好。

此外，本文還提供一實施方式的具有高抗原呈遞的dc細(xì)胞及其在制備抗腫瘤的藥物中的應(yīng)用。

具體地，上述具有高抗原呈遞的dc細(xì)胞可以是應(yīng)用于預(yù)防腫瘤的疫苗，也可以是應(yīng)用于治療已經(jīng)確診為腫瘤甚至癌癥的藥物。

進(jìn)一步地，上述具有高抗原呈遞的dc細(xì)胞為用于制備抗乳腺癌的藥物。

實驗結(jié)果表明，上述具有高抗原呈遞的dc細(xì)胞能夠刺激t細(xì)胞分化更加成熟，增強t細(xì)胞對乳腺癌特異性的高效殺傷作用，而對正常的乳腺細(xì)胞的殺傷作用很小。因此，該具有高抗原呈遞的dc細(xì)胞有望應(yīng)用在抗腫瘤的藥物中，為腫瘤治療提供一種思路。

請參閱圖3，一實施方式的抗原特異性t細(xì)胞的制備方法，包括步驟s110～s150。

其中，步驟s110～s130請參見上文制備具有高抗原呈遞的dc細(xì)胞的描述，在此不作贅述。

s140、將t細(xì)胞與s130中得到的具有高抗原呈遞的dc細(xì)胞混合，并置于含有四環(huán)素的培養(yǎng)基中共同培養(yǎng)。

四環(huán)素能夠調(diào)控dc細(xì)胞內(nèi)的基因表達(dá)沉默劑的開關(guān)，實驗結(jié)果表明，只有在四環(huán)素存在的情況下，tao-1蛋白磷酸激酶基因表達(dá)沉默。而一旦dc細(xì)胞與t細(xì)胞抗原呈遞結(jié)束，即可去掉四環(huán)素，恢復(fù)dc細(xì)胞內(nèi)tao-1蛋白磷酸激酶的表達(dá)，保證了dc細(xì)胞在非抗原呈遞階段的正常生理功能不受影響。

在一個實施方式中，含四環(huán)素的培養(yǎng)基中，四環(huán)素的終濃度為0.5mg/ml～5mg/ml。例如0.8mg/ml、1mg/ml、2mg/ml或4mg/ml等等。四環(huán)素的濃度適宜，調(diào)控dc細(xì)胞內(nèi)的基因表達(dá)沉默劑，在dc細(xì)胞和t細(xì)胞相互接觸并形成免疫突觸結(jié)構(gòu)的過程中，抑制tao-1蛋白磷酸激酶的基因表達(dá)。

在一個實施方式中，含有四環(huán)素的培養(yǎng)基的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為無血清培養(yǎng)基，例如alys-505培養(yǎng)基。培養(yǎng)基中還含有g(shù)m-csf、il-4和血漿，gm-csf的終濃度為10ng/ml～1000ng/ml，il-4的終濃度為0.1ng/ml～100ng/ml，血漿的體積分?jǐn)?shù)為0.1％～20％。

本實施方式中，含有四環(huán)素的培養(yǎng)基的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為alys-505培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中含有四環(huán)素、有g(shù)m-csf、il-4和血漿，四環(huán)素的終濃度為1mg/ml，gm-csf的終濃度為100ng/ml，il-4的終濃度為10ng/ml，血漿的體積分?jǐn)?shù)為10％。

具體地，血漿與提取dc細(xì)胞的外周血為同源的。培養(yǎng)基中加入gm-csf、il-4和血漿能夠促進(jìn)dc細(xì)胞的生長、增強dc細(xì)胞的抗原呈遞能力。

在一個實施方式中，將具有高抗原呈遞的dc與t細(xì)胞與混合，并置于含有四環(huán)素的培養(yǎng)基中共同培養(yǎng)的操作中，t細(xì)胞與具有高抗原呈遞的dc的個數(shù)比為1～20：1，共同培養(yǎng)的時間為1天～15天。在四環(huán)素存在的條件下，具有高抗原呈遞的dc內(nèi)tao-1蛋白磷酸激酶基因表達(dá)受到抑制，將t細(xì)胞與dc細(xì)胞共同培養(yǎng)1天以上，形成穩(wěn)定的免疫突觸結(jié)構(gòu)，提高dc細(xì)胞抗原呈遞能力以及t細(xì)胞分化成熟度。

具體地，將具有高抗原呈遞的dc與t細(xì)胞混合，置于含有四環(huán)素的培養(yǎng)基中共同培養(yǎng)共同培養(yǎng)1天～7天，例如2天、3天或4天等。

具體地，混合時，具有高抗原呈遞的dc為1×10⁵個/孔，t細(xì)胞約為1×10⁶個/孔。將具有高抗原呈遞的dc與t細(xì)胞共同培養(yǎng)，培養(yǎng)時隔天補加四環(huán)素。

s150、收集s140中共同培養(yǎng)后的t細(xì)胞，得到抗原特異性t細(xì)胞。

實驗結(jié)果表明，在四環(huán)素存在的條件下，導(dǎo)入了基因表達(dá)沉默劑的dc細(xì)胞更能高效地將抗原呈遞給t細(xì)胞，提高t細(xì)胞的成熟度和抗原特異性。該具有高抗原呈遞的dc細(xì)胞與t細(xì)胞在四環(huán)素的條件下，四環(huán)素能夠調(diào)控dc細(xì)胞內(nèi)的基因表達(dá)沉默劑的開關(guān)，使得dc細(xì)胞和t細(xì)胞相互接觸并形成免疫突觸結(jié)構(gòu)的過程中抑制dc細(xì)胞內(nèi)具有負(fù)調(diào)控作用的tao-1蛋白磷酸激酶的基因表達(dá)，增加免疫突觸形成的時間和強度，提高形成的免疫突觸的穩(wěn)定性。

而一旦dc細(xì)胞與t細(xì)胞抗原呈遞結(jié)束，即可去掉四環(huán)素，恢復(fù)dc細(xì)胞內(nèi)tao-1蛋白磷酸激酶的表達(dá)，保證了dc細(xì)胞在非抗原呈遞階段的正常生理功能不受影響。

需要說明的是，制備具有高抗原呈遞的dc細(xì)胞和高抗原特異性的t細(xì)胞不局限于上述s110～s150的順序，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)需要調(diào)整先后順序，例如s120與s130可以調(diào)換。

在一個實施方式中，制備得到的抗原特異性t細(xì)胞中cd3和hla-dr雙陽性的t細(xì)胞數(shù)量占總t細(xì)胞數(shù)量的60％以上。

上述制備抗原特異性t細(xì)胞，在制備時，向dc細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入基因表達(dá)沉默劑，并將負(fù)載有抗原的dc細(xì)胞與t細(xì)胞混合，置于含有四環(huán)素的培養(yǎng)基中共同培養(yǎng)。四環(huán)素能夠調(diào)控dc細(xì)胞內(nèi)的基因表達(dá)沉默劑的開關(guān)，在dc細(xì)胞和t細(xì)胞相互接觸并形成免疫突觸結(jié)構(gòu)的過程中抑制具有負(fù)調(diào)控作用的tao-1蛋白磷酸激酶的基因表達(dá)，提高形成的免疫突觸的穩(wěn)定性，增加免疫突觸形成的時間和強度。而一旦dc細(xì)胞與t細(xì)胞抗原呈遞結(jié)束，即可在去掉四環(huán)素，恢復(fù)dc細(xì)胞內(nèi)tao-1蛋白磷酸激酶的表達(dá)，保證了dc細(xì)胞在非抗原呈遞階段的正常生理功能不受影響。

實驗結(jié)果表明，在四環(huán)素存在的條件下，導(dǎo)入了基因表達(dá)沉默劑的dc細(xì)胞與t細(xì)胞共同培養(yǎng)時，dc內(nèi)tao-1蛋白磷酸激酶基因表達(dá)受到抑制，dc細(xì)胞與t細(xì)胞表面形成的表面突觸更加穩(wěn)定，能夠刺激t細(xì)胞分化更加成熟，制備的抗原特異性t細(xì)胞中cd3和hla-dr雙陽性的t細(xì)胞數(shù)量能夠占總t細(xì)胞數(shù)量的60％以上，增強t細(xì)胞的免疫活性，得到的抗原特異性t細(xì)胞的免疫應(yīng)答效果好。

此外，本文還提供一實施方式的抗原特異性t細(xì)胞及其在制備抗腫瘤的藥物中的應(yīng)用。

具體地，上述抗原特異性t細(xì)胞可以是應(yīng)用于預(yù)防腫瘤的疫苗，也可以是應(yīng)用于治療已經(jīng)確診為腫瘤甚至癌癥的藥物。

進(jìn)一步地，上述抗原特異性t細(xì)胞為用于制備抗乳腺癌的藥物。

實驗結(jié)果表明，上述抗原特異性t細(xì)胞對乳腺癌有特異性的高效殺傷作用，而對正常的乳腺細(xì)胞的殺傷作用很小。因此，該抗原特異性t細(xì)胞有望應(yīng)用在抗腫瘤的藥物中，為腫瘤治療提供一種思路。

下面為具體實施例部分。

以下實施例中，如無特別說明，未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如參見薩姆布魯克、ef弗里奇、t曼尼阿蒂斯等(金冬雁，黎孟楓等譯)所著的分子克隆實驗指南[m](北京：科學(xué)出版社，1992)中所述的條件或者試劑盒生產(chǎn)廠家推薦的方法實現(xiàn)。實施例中所使用的試劑均為市售。

未特別說明，nc-dc-t表示dc細(xì)胞與t細(xì)胞共同培養(yǎng)后，收集的第一陰性對照t細(xì)胞。elv-dc-t表示plko-tet-on空載體慢病毒感染dc細(xì)胞與t細(xì)胞共同培養(yǎng)后，收集的第二陰性對照t細(xì)胞。tlv-dc-t表示plko-tet-on/tao-1-shrna慢病毒感染dc細(xì)胞與t細(xì)胞共同培養(yǎng)后，收集的第三陰性對照t細(xì)胞。tet-tlv-dc-t(抗原特異性t細(xì)胞)表示plko-tet-on/tao-1-shrna慢病毒感染dc細(xì)胞與t細(xì)胞在四環(huán)素的條件下共同培養(yǎng)后，收集的抗原特異性t細(xì)胞。

實施例1

制備基因表達(dá)沉默劑

(1)設(shè)計tao-1蛋白磷酸激酶的shrna

利用thermo網(wǎng)站的shrna序列在線設(shè)計程序(http://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/setoption.do？designoption＝shrna&pid＝-2900031043253144145)，設(shè)計出tao-1shrnaoligos序列，如下所示：

正義鏈:

5’-ccggggaagtcaagtttctacaaagctcgagctttgtagaaacttgacttccttttt-3’(seqidno.1)。

反義鏈:

5’-aattggaagtcaagtttctacaaagctcgagctttgtagaaacttgacttcc-3’(seqidno.2)。

(2)制備plko-tet-on/tao-1-shrna慢病毒

將上述設(shè)計的tao-1蛋白磷酸激酶的shrna送交基因公司合成，利用agei和ecor1雙酶切慢病毒載體plko-tet-on，將退火后的tao-1-shrna寡核苷酸鏈連接到plko-tet-on載體中，dna連接反應(yīng)體系如下：

室溫反應(yīng)3h后，對連接產(chǎn)物plko-tet-on/tao-1-shrna慢病毒表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定。構(gòu)建的plko-tet-on/tao-1-shrna慢病毒表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)過xhoi單酶切后得到的產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖4，分別在大約150bp、200bp和8kb處有三條清晰條帶，與預(yù)期片段數(shù)和片段大小一致(8kb條帶因為慢病毒載體plko-tet-on中也有一個xhoi酶切位點)。證明tao-1-shrna寡核苷酸成功插入到plko-tet-on載體中。經(jīng)酶切鑒定正確后，將其與三個慢病毒包裝質(zhì)粒plp1、plp2、plp/vsvg共轉(zhuǎn)染293t細(xì)胞，制備出plko-tet-on/tao-1-shrna慢病毒。

實施例2

dc細(xì)胞和t細(xì)胞共同培養(yǎng)制備具有高抗原呈遞的dc細(xì)胞以及抗原特異性t細(xì)胞

1、dc細(xì)胞和t細(xì)胞的培養(yǎng)

(1)抽取健康志愿者外周血50ml，肝素抗凝，用淋巴細(xì)胞分離液分離出外周血單個核細(xì)胞(pbmc)。

(2)用含10％自體血漿的alys-505培養(yǎng)液重懸pbmc細(xì)胞，分裝入六孔板中，5×10⁶個/ml，2ml/孔，置于飽和濕度、37℃、5.0％co2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2h。

(3)洗滌并收集(2)中未貼壁的細(xì)胞，該未貼壁細(xì)胞為t細(xì)胞。將未貼壁的細(xì)胞用含50ng/mlcd3單抗、1000u/ml的il-2和0.5％自體血漿的alys-505培養(yǎng)液進(jìn)行刺激培養(yǎng)，調(diào)整細(xì)胞密度為1×10⁶/ml，轉(zhuǎn)入六孔板中，2ml/孔，同時每孔添加1000u/ml的ifn-γ，置于飽和濕度、37℃、5.0％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每3天調(diào)整細(xì)胞密度為1×10⁶/ml，添加含1000u/ml的il-2和0.5％自體血漿的alys-505培養(yǎng)液。

(4)保留(2)中貼壁細(xì)胞于六孔板中，貼壁細(xì)胞為dc細(xì)胞，向六孔板加入含100ng/mlgm-csf、10ng/ml的il-4及10％自體血漿的alys-505培養(yǎng)液，置于飽和濕度、37℃、5.0％co2培養(yǎng)箱中誘導(dǎo)培養(yǎng)dc細(xì)胞。培養(yǎng)3天后半量換液并補充新鮮的細(xì)胞因子，另外加入一支腫瘤抗原(本專利使用乳腺癌細(xì)胞系mcf-7的凍融抗原，1ml)對dc細(xì)胞進(jìn)行抗原負(fù)載，置于飽和濕度、37℃、5.0％co2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48h。

(5)收集(4中)培養(yǎng)的dc細(xì)胞，計數(shù)，離心后以含100ng/mlgm-csf、10ng/mlil-4及10％自體血漿的alys-505培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度，接種于6孔板中，1×10⁵個細(xì)胞/孔，共接種8個孔。實驗平均分成四組，每組2個平行對照。4組細(xì)胞分別為陰性對照dc細(xì)胞組(nc-dc-t)、plko-tet-on空載體慢病毒感染dc細(xì)胞組(elv-dc-t)、plko-tet-on/tao-1-shrna慢病毒感染dc細(xì)胞組(tlv-dc-t)、四環(huán)素誘導(dǎo)的plko-tet-on/tao-1-shrna慢病毒感染t細(xì)胞組(tet-tlv-dc-t)。

(6)按照moi＝30的比值，elv-dc-t組加入plko-tet-on空載體慢病毒，tlv-dc-t細(xì)胞組和tet-tlv-dc-t細(xì)胞組分別加入plko-tet-on/tao-1-shrna慢病毒，同時加入8μg/ml的polybrane促進(jìn)慢病毒感染，病毒轉(zhuǎn)染后，培養(yǎng)24h。

(7)將(6)中培養(yǎng)的各組dc細(xì)胞更換新鮮的含100ng/mlgm-csf、10ng/ml的il-4及10％自體血漿的alys-505培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24h。

(8)在(7)中培養(yǎng)的各組dc細(xì)胞每孔加入10⁶個(3)中培養(yǎng)的t細(xì)胞，與dc細(xì)胞共培養(yǎng)。其中，tet-tlv-dc-t細(xì)胞組額外加入1mg/ml四環(huán)素，共同培養(yǎng)48h。

(9)補加新鮮的t細(xì)胞完全培養(yǎng)基(含1000u/mlil-2和0.5％自體血漿的alys-505培養(yǎng)液)，tet-tlv-dc-t細(xì)胞組額外加入1mg/ml四環(huán)素，繼續(xù)共同培養(yǎng)48h。

(10)補加新鮮的t細(xì)胞完全培養(yǎng)基，tet-tlv-dc-t細(xì)胞組不再添加四環(huán)素，繼續(xù)共同培養(yǎng)48h。

(11)收獲四組dc細(xì)胞刺激的t細(xì)胞(nc-dc-t、elv-dc-t、tlv-dc-t、tet-tlv-dc-t)，其中t細(xì)胞增殖較快，而dc細(xì)胞基本不增值。共同培養(yǎng)后，貼壁生長的為具有高抗原呈遞的dc細(xì)胞，懸浮生長為t細(xì)胞。然后檢測各組t細(xì)胞表面hla-dr的表達(dá)，以及t細(xì)胞對乳腺癌細(xì)胞系mcf-7的特異性殺傷作用。

t細(xì)胞成熟度的流式檢測

將實施例2中收取的第一陰性對照組、第二陰性對照組、第三陰性對照組以及實驗組的四組t細(xì)胞(nc-dc-t、elv-dc-t、tlv-dc-t、tet-tlv-dc-t)分別取1×10⁶個細(xì)胞，pbs洗滌一次后，利用cd3-fitc抗體、hla-dr-percp抗體進(jìn)行染色，流式上樣檢測t細(xì)胞中cd3⁺以及hla-dr⁺的t細(xì)胞的比例，以鑒定四組t細(xì)胞在成熟度上的差異。

四組t細(xì)胞cd3⁺且hla-dr⁺比例的流式檢測結(jié)果如圖5所示。流式檢測圖中左上角內(nèi)的散點表示cd3^-而hla-dr⁺的t細(xì)胞，左下角內(nèi)的散點表示cd3^-且hla-dr^-的t細(xì)胞，右上角內(nèi)的散點表示cd3⁺且hla-dr⁺雙陽性的t細(xì)胞，右下角內(nèi)的散點表示cd3⁺而hla-dr^-的t細(xì)胞。一般cd3⁺表示的淋巴細(xì)胞為t細(xì)胞，且hla-dr⁺表示分化后活性好的t細(xì)胞。右上角內(nèi)百分?jǐn)?shù)表示cd3⁺且hla-dr⁺的t細(xì)胞的比例。其中nc-dc-t組比例最低，為28.30％。elv-dc-t組和tlv-dc-t組的cd3⁺且hla-dr⁺比例接近，分別為43.28％和46.03％。說明在沒有四環(huán)素誘導(dǎo)時，tlv-dc細(xì)胞對t細(xì)胞的刺激作用與空病毒載體感染elv-dc細(xì)胞相比，沒有顯著差異。而tet-tlv-dc-t細(xì)胞組的cd3⁺hla-dr⁺比例最高，達(dá)到63.58％，與其它組相比有顯著差異，說明在四環(huán)素誘導(dǎo)下，轉(zhuǎn)染了plko-tet-on/tao-1-shrna慢病毒的dc細(xì)胞可以刺激獲得更成熟、更活化的t細(xì)胞。

t細(xì)胞對靶細(xì)胞殺傷的流式檢測結(jié)果

(1)以實施例2中收取的第一陰性對照組、第二陰性對照組、第三陰性對照組以及實驗組的四組t細(xì)胞nc-dc-t、elv-dc-t、tlv-dc-t、tet-tlv-dc-t分別作為效應(yīng)細(xì)胞，分別以cfse標(biāo)記的乳腺癌mcf-7細(xì)胞、cfse標(biāo)記的乳腺正常細(xì)胞系mcf-10a作為靶細(xì)胞，按照20:1的效靶比混合效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞，輕輕混勻，置于5％co2，37℃培養(yǎng)箱中孵育。

(2)24h后，加入1μg/mlpi染液，混勻，室溫避光孵育15min后，利用流式細(xì)胞儀檢測cfse⁺pi⁺細(xì)胞(死亡的靶細(xì)胞)的百分率。

實驗結(jié)果如圖6所示：各組t細(xì)胞對正常細(xì)胞系mcf-10a的殺傷效率差異不大，殺傷效率大致相同，在13％～16％之間。而各組t細(xì)胞對乳腺癌mcf-7細(xì)胞的殺傷效率則有較大的區(qū)別：nc-dc-t細(xì)胞的殺傷效率最低，僅有18.23％的靶細(xì)胞被殺傷。在dc與t細(xì)胞共培養(yǎng)過程中沒有添加四環(huán)素時，tlv-dc-t細(xì)胞對mcf-7的殺傷比例為32.78％。而dc與t細(xì)胞共培養(yǎng)時添加1mg/ml四環(huán)素獲得的tet-tlv-dc-t細(xì)胞對mcf-7細(xì)胞的殺傷比例提高到了68.92％。

這一結(jié)果說明，在四環(huán)素誘導(dǎo)下，plko-tet-on/tao-1-shrna慢病毒感染dc細(xì)胞所刺激的t細(xì)胞(tet-tlv-dc-t)對乳腺癌細(xì)胞mcf-7有特異性的高效殺傷作用，而對正常的乳腺細(xì)胞mcf-10a的殺傷作用很小。

綜上，與對照組相比，在四環(huán)素的條件下，經(jīng)plko-tet-on/tao-1-shrna慢病毒感染dc細(xì)胞與t細(xì)胞共同培養(yǎng)能夠得到具有高抗原呈遞的dc細(xì)胞。dc細(xì)胞刺激收集的抗原特異性t細(xì)胞的cd3和hla-dr雙陽性的t細(xì)胞比例高，t細(xì)胞分化更加成熟，dc細(xì)胞-t細(xì)胞之間的抗原呈遞的效率高，t細(xì)胞的免疫應(yīng)答效果好?？乖禺愋詔細(xì)胞對乳腺癌有特異性的高效殺傷作用，而對正常的乳腺細(xì)胞的殺傷作用很小，有望應(yīng)用在抗腫瘤的藥物中，為腫瘤治療提供一種思路。

以上所述實施例僅表達(dá)了本發(fā)明的一種或幾種實施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對本發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。

sequencelisting

<110>劉韜

<120>具有高抗原呈遞的dc細(xì)胞和抗原特異性t細(xì)胞及其制備方法和應(yīng)用

<160>2

<170>patentinversion3.3

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<212>dna

<213>人工序列

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