本發(fā)明涉及一種氟苯尼考胺人工抗原的合成方法，屬于生物化工技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

氟苯尼考是替代禁用藥物氯霉素的一種理想的藥物，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖的防病抗病上。盡管氟苯尼考毒性低于氯霉素，但由于不正確或超量的使用，勢必造成氟苯尼考在畜禽水產(chǎn)品中的殘留，特別是現(xiàn)已出現(xiàn)了對氟苯尼考耐藥的菌株，而且氟苯尼考的用量呈上升的趨勢，這對人類的身體健康造成了潛在的威脅。氟苯尼考在動物組織中的主要代謝產(chǎn)物為氟苯尼考胺( florfenicol amine，F(xiàn)FA) ，許多國家以氟苯尼考胺作為使用氟苯尼考的殘留標(biāo)示物。我國規(guī)定氟苯尼考?xì)埩魳?biāo)示物為氟苯尼考胺，歐洲藥品管理局（EMA）確定的殘留標(biāo)示物則為FF+FFA，其在不同動物肌肉組織中的最大殘留限量值MRL為100～300μg/kg。因此，研究氟苯尼考胺殘留監(jiān)控技術(shù)對保障我國人民身體健康和水產(chǎn)品食用安全具有重要意義。

酶聯(lián)免疫法（ELISA）是一種極為高效、敏感、快速的檢測方法，然而得到高親和力和高特異性的單克隆單體是免疫學(xué)檢測的前提，其中人工抗原的合成是其中重要的一步。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種氟苯尼考胺人工抗原的合成方法，所制備的產(chǎn)品用于氟苯尼考胺免疫分析方法研究，為今后人們的研究提供了很好的人工抗原。

本發(fā)明的技術(shù)方案：一種氟苯尼考胺人工抗原的合成方法，其由氟苯尼考與4-溴丁酸芐酯、20% H₂SO₄、K₂CO₃、NH₃.CH₃OH反應(yīng)得到具有羧基的產(chǎn)物，即半抗原FFA-2，用碳二亞胺法將半抗原FFA-2與載體蛋白偶聯(lián)，即得到氟苯尼考胺人工抗原；步驟為：

（1）半抗原FFA-2的合成：

合成路線如下：

稱取10.0g（28.0mmol）FF溶于150mL乙酸中, 在10℃下逐滴地加入120 mL 20% H₂SO₄溶液中，然后在110℃下攪拌3h，再冷卻至室溫，并調(diào)節(jié)pH至14，混合物通過萃取吸收（EA）技術(shù)提取, 再用Na₂SO₄濃縮干燥，得到白色固體FFA 5.0g（20.2mmol），摩爾產(chǎn)率72.4%。

稱取500.0mg（2.02mmol）FFA和335mg（2.42 mmol）K₂CO₃溶于5mL乙腈中，加入624 mg（2.42 mmol）4-溴丁酸芐酯，在50℃下攪拌過夜，然后將混合物倒入水中, 通過萃取吸收(EA)技術(shù)提取，再用Na₂SO₄濃縮干燥，得到粗產(chǎn)物；再將粗產(chǎn)物用硅膠柱純化，得到白色固體FFA-1 805mg（1.90mmol,），摩爾產(chǎn)率94.0%。

稱取805 mg（1.90 mmol ）FFA-1，用8.00 mL、2 M NH₃.CH₃OH溶解，在室溫下攪拌過夜，混合物用DCM清洗濃縮，得到白色固體FFA-2 271 mg（0.81mmol）,摩爾產(chǎn)率42.8%。

（2）完全抗原的制備：步驟（1）制備的半抗原FFA-2，與KLH偶聯(lián)得到偶聯(lián)物完全抗原FFA-2-KLH；或與BSA偶聯(lián)得到偶聯(lián)物完全抗原FFA-2-BSA。

步驟（2）所述完全抗原FFA-2-KLH制備方法如下：

a、稱取步驟（1）中制得的2.2mg FFA-2，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽5mg，N-羥基琥珀酰亞胺3mg，用400μL無水N,N-二甲基甲酰胺溶解，室溫攪拌反應(yīng)4-5h，稱為A液；取匙孔血藍(lán)蛋白KLH 0.735mL(6.8mg/mL， FFA-2與KLH摩爾比為6000︰1)，加入等體積硼酸緩沖溶液，稱為B液；在室溫條件，逐滴將A液加入到B液中，室溫反應(yīng)過夜，即得偶聯(lián)物FFA-2-KLH混合液；

b、透析：取8cm的透析袋，于沸水中煮沸10min，再用50℃的去離子水沖洗2min，保存在4℃去離子水中備用；將偶聯(lián)物FFA-2-KLH混合液裝入透析袋于0.01mol/L的PBS中透析3天，每天換液3次，即得完全抗原FFA-2-KLH。

步驟（2）所述完全抗原FFA-2-BSA制備方法如下：

a、稱取步驟（1）中制得的1.5mg FFA-2，1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽4mg，N-羥基琥珀酰亞胺2.5mg，用250μL無水N,N-二甲基甲酰胺溶解，室溫攪拌反應(yīng)4-5h，稱為A液；稱取5mg 牛血清蛋白BSA（FFA-2與BSA摩爾比為60︰1），溶解于1mL碳酸鈉/碳酸氫鈉緩沖溶液中，加入等體積硼酸緩沖溶液，稱為B液；在室溫條件，逐滴將A液加入到B液中，室溫反應(yīng)過夜，即得偶聯(lián)物FFA-2-BSA混合液；

b、透析：取8cm的透析袋，于沸水中煮沸10min，再用50℃的去離子水沖洗2min，保存在4℃去離子水中備用；將偶聯(lián)物FFA-2-BSA混合液放入透析袋于0.01mol/L的PBS中透析3天，每天換液3次，即得完全抗原FFA-2-BSA。

氟苯尼考胺人工抗原的鑒定

（1）采用核磁共振和液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)鑒定半抗原。

（2）人工抗原采用紫外法鑒定其偶聯(lián)結(jié)果，利用偶聯(lián)物中小分子與蛋白的濃度，計算其偶聯(lián)比。

偶聯(lián)比測定：估算偶聯(lián)物中被偶聯(lián)的兩種分子的比率（偶聯(lián)比率）的方法，雖然測定方法種類很多，但都是依據(jù)檢測偶聯(lián)物中被偶聯(lián)的兩種分子含量（或相對含量）的原理建立起來的。紫外法是依據(jù)合成的人工抗原中的小分子濃度與蛋白濃度的比確定偶聯(lián)比的。

偶聯(lián)物蛋白濃度測定：將反應(yīng)前蛋白的質(zhì)量除以透析后偶聯(lián)物的體積即得到偶聯(lián)物中蛋白的含量。

偶聯(lián)物中小分子濃度的測定：濃度為Xμg/mL的小分子在特征峰處的吸光值A(chǔ)₁，偶聯(lián)物在特征峰處的吸光值A(chǔ)₂，小分子的分子量為M，所以，偶聯(lián)物中小分子的濃度= ( A₂×X)/ A₁

偶聯(lián)比=（( A₂×X)/ A₁/M）/（蛋白濃度/蛋白分子量）×（稀釋倍數(shù)）

本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明成功合成了氟苯尼考胺的人工抗原，合成步驟簡潔、有效，完全可用于免疫分析中，為以后人們的研究提供了方便的途徑。

附圖說明

圖1半抗原FFA-2的NMR鑒定圖。

圖2半抗原FFA-2的LC-MS鑒定圖，為FFA-2的色譜圖。

圖3半抗原FFA-2的LC-MS鑒定圖，為FFA-2的質(zhì)譜圖。

圖4 FFA-2-KLH人工抗原的免疫原紫外鑒定圖。

圖5 FFA-2-BSA人工抗原的免疫原紫外鑒定圖。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1 半抗原FFA-2的合成

稱取10.0g（28.0mmol）FF溶于150mL乙酸中, 在10℃下逐滴地加入120 mL、20% H₂SO₄，然后在110℃下攪拌3h，再冷卻至室溫，并調(diào)節(jié)pH至14，混合物通過萃取吸收(EA)技術(shù)提取, 再用Na₂SO₄濃縮干燥，到白色固體FFA 5.0g（20.2mmol），摩爾產(chǎn)率72.4%。

稱取500.0mg（2.02mmol）FFA和335mg（2.42 mmol）K₂CO₃溶于5mL乙腈中，加入624 mg（2.42 mmol）4-溴丁酸芐酯，在50℃下攪拌過夜，然后將混合物倒入水中, 通過萃取吸收（EA）技術(shù)提取, 再用Na₂SO₄濃縮干燥，得到粗產(chǎn)物。再將粗產(chǎn)物用硅膠柱純化，得到白色固體FFA-1 805mg（1.90mmol），摩爾產(chǎn)率94.0%。

稱取805 mg（1.90 mmol）FFA-1，用8.00 mL、2 M NH₃.CH₃OH溶解，在室溫下攪拌過夜,混合物用DCM清洗濃縮，得到白色固體FFA-2 271 mg（0.81mmol），摩爾產(chǎn)率42.8%。

（2）完全抗原的制備：步驟（1）制備的半抗原FFA-2，與KLH偶聯(lián)得到偶聯(lián)物完全抗原FFA-2-KLH；或與BSA偶聯(lián)得到偶聯(lián)物完全抗原FFA-2-BSA。

實(shí)施例2 所述完全抗原FFA-2-KLH制備方法如下：

a、稱取步驟（1）中制得的2.2mg FFA-2，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽5mg，N-羥基琥珀酰亞胺3mg，用400μL無水N,N-二甲基甲酰胺溶解，室溫攪拌反應(yīng)4-5h，稱為A液。取匙孔血藍(lán)蛋白KLH 0.735mL(6.8mg/mL, FFA-2與KLH摩爾比為6000︰1)，加入等體積硼酸緩沖溶液，稱為B液。在室溫條件，逐滴將A液加入到B液中，室溫反應(yīng)過夜，即得偶聯(lián)物FFA-2-KLH混合液；

b、透析：取8cm的透析袋，于沸水中煮沸10min，再用50℃的去離子水沖洗2min，保存在4℃去離子水中備用；將偶聯(lián)物FFA-2-KLH混合液裝入透析袋于0.01mol/L的PBS中透析3天，每天換液3次，即得完全抗原FFA-2-KLH。

實(shí)施例3所述完全抗原FFA-2-BSA制備方法如下：

a、稱取步驟（1）中制得的1.5mg FFA-2，1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽4mg，N-羥基琥珀酰亞胺2.5mg，用250μL無水N,N-二甲基甲酰胺溶解，室溫攪拌反應(yīng)4-5h，稱為A液。稱取5mg 牛血清蛋白BSA（FFA-2與BSA摩爾比為60︰1），溶解于1mL碳酸鈉/碳酸氫鈉緩沖溶液中，加入等體積硼酸緩沖溶液，稱為B液。在室溫條件，逐滴將A液加入到B液中，室溫反應(yīng)過夜，即得偶聯(lián)物FFA-2-BSA混合液；

b、透析：取8cm的透析袋，于沸水中煮沸10min，再用50℃的去離子水沖洗2min，保存在4℃去離子水中備用；將偶聯(lián)物FFA-2-BSA混合液放入透析袋于0.01mol/L的PBS中透析3天，每天換液3次，即得完全抗原FFA-2-BSA。

實(shí)施例4 氟苯尼考胺人工抗原的鑒定

（1）采用核磁共振和液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)鑒定半抗原。

（2）人工抗原采用紫外法鑒定其偶聯(lián)結(jié)果，利用偶聯(lián)物中小分子與蛋白的濃度，計算其偶聯(lián)比。

偶聯(lián)比測定：估算偶聯(lián)物中被偶聯(lián)的兩種分子的比率（偶聯(lián)比率）的方法，雖然測定方法種類很多，但都是依據(jù)檢測偶聯(lián)物中被偶聯(lián)的兩種分子含量（或相對含量）的原理建立起來的。紫外法是依據(jù)合成的人工抗原中的小分子濃度與蛋白濃度的比確定偶聯(lián)比的。

偶聯(lián)物蛋白濃度測定：將反應(yīng)前蛋白的質(zhì)量除以透析后偶聯(lián)物的體積即可得到偶聯(lián)中蛋白的含量。

實(shí)施例2中FFA-2-KLH免疫原的紫外鑒定圖如圖4所示。

實(shí)施例3中FFA-2-BSA免疫原的紫外鑒定圖如圖5所示。

FFA-2免疫原偶聯(lián)物中小分子濃度的測定: 濃度為0.05mg/mL的小分子在特征峰267nm處的吸光值A(chǔ)₁= 0.501，偶聯(lián)物在267nm處的吸光值A(chǔ)₂=0.412，小分子的分子量為333.3g/mol，所以，偶聯(lián)物中小分子的濃度 =(0.412×0.05mg/mL)/ 0.501=0.041mg/mL；BSA濃度2mg/mL，BSA分子量67000。

偶聯(lián)比=（0.041mg/mL/333.3）/（2mg/mL /67000）×3（稀釋倍數(shù)）=12.4。