棉花纖維和花粉特異表達(dá)啟動(dòng)子fpsp-1及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及棉花纖維和花粉特異表達(dá)啟動(dòng)子FPSP-1 及其應(yīng)用。
[0002]
【背景技術(shù)】
[0003] 我國(guó)是棉花生產(chǎn)和消費(fèi)大國(guó)，棉花生產(chǎn)在我國(guó)國(guó)民經(jīng)濟(jì)中占有重要的地位。利用 傳統(tǒng)的育種方法曾在棉花品種改良上取得了較大的成功，但近20年來，世界棉花品種的產(chǎn) 量已經(jīng)達(dá)到平臺(tái)期。因此，利用現(xiàn)有的遺傳資源和傳統(tǒng)育種手段難W再大幅度提高棉花產(chǎn) 量?；蚬こ谭椒ň哂泻蟠子诜€(wěn)定，育種周期短等優(yōu)點(diǎn)，可W打破物種間的遺傳障礙，實(shí) 現(xiàn)優(yōu)良目的基因的定向轉(zhuǎn)移。利用基因工程改良棉花產(chǎn)量和纖維品質(zhì)是解決該一難題的有 效途徑。
[0004] 但基因工程在作物改良中的作用發(fā)揮取決于S個(gè)方面的進(jìn)展程度：目標(biāo)基因的功 能、調(diào)控目標(biāo)性狀的分子機(jī)理和控制目標(biāo)基因在特定部位表達(dá)的特異啟動(dòng)子。在棉花纖維 品質(zhì)和產(chǎn)量的基因工程改良中，常常需要在纖維細(xì)胞中超量或抑制一些基因的表達(dá)，來達(dá) 到提高產(chǎn)量或改良品質(zhì)的目的。同時(shí)棉花纖維產(chǎn)量的重要指標(biāo)是棉花育性，而花粉育性是 棉花育性的重要指標(biāo)，直接關(guān)系到棉花成鈴率、座果率和產(chǎn)量，因此需要有纖維花粉特異的 啟動(dòng)子來控制目標(biāo)基因的表達(dá)。在棉花纖維發(fā)育的分子機(jī)理研究中，也需要纖維細(xì)胞特異 表達(dá)啟動(dòng)子來上調(diào)或下調(diào)目標(biāo)基因的表達(dá)，進(jìn)而分析其在纖維細(xì)胞中的功能，最大限度地 減少目標(biāo)基因?qū)ζ渌M織和器官的不良影響。但是，目前已報(bào)道的具有棉花纖維特異性的 啟動(dòng)子非常有限；如在利用基因工程改良棉花纖維產(chǎn)量和品質(zhì)過程使用組成型啟動(dòng)子巧曰 CaMV35S)常常引起副作用的問題，即在不需要表達(dá)目的基因的部位而發(fā)生了目標(biāo)基因的表 達(dá)，常常引起植株生長(zhǎng)的異常變化，達(dá)不到改良纖維產(chǎn)量和品質(zhì)的效果。因此，棉花纖維特 異啟動(dòng)子的克隆，在轉(zhuǎn)基因棉花中限制目標(biāo)基因在棉花花粉和纖維中特異性表達(dá)，對(duì)棉花 纖維發(fā)育相關(guān)基因功能研究和棉花纖維的基因工程改良，具有十分重要的意義。
[0005] 近年來，植物組織器官和發(fā)育特異性表達(dá)基因的研究成為植物分子生物學(xué)的一個(gè) 重要研究領(lǐng)域，特別是在植物基因工程的實(shí)用化階段中，為了使目的基因在特定的組織器 官和特定的發(fā)育階段優(yōu)先表達(dá)，對(duì)組織特異性表達(dá)的研究更是成為熱點(diǎn)。由于棉花種子和 纖維是棉花的經(jīng)濟(jì)器官，花粉育性是棉花產(chǎn)量的一個(gè)重要因子，纖維的發(fā)育直接影響纖維 的品質(zhì)和產(chǎn)量。因此，研究和篩選纖維和花粉特異表達(dá)的啟動(dòng)子不僅有助于解析基因表達(dá) 調(diào)控的分子機(jī)制，并可為植物基因工程提供有用的調(diào)控元件，有著重要的理論意義和應(yīng)用 價(jià)值。
[0006]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，本發(fā)明的目的是解決現(xiàn)有組成型啟動(dòng)子巧曰 CaMV35S)常常引起副作用，即在不需要表達(dá)目的基因的部位而發(fā)生了目標(biāo)基因的表達(dá)，常 常引起植株生長(zhǎng)的異常變化，達(dá)不到改良纖維產(chǎn)量和品質(zhì)的效果的技術(shù)問題，而提供一種 棉花纖維和花粉特異表達(dá)啟動(dòng)子FPSP-1。
[0008] 本發(fā)明還提供棉花纖維和花粉特異表達(dá)啟動(dòng)子FPSP-1的應(yīng)用。
[0009] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：棉花纖維和花粉特異表達(dá)啟動(dòng)子 FPSP-1，所述啟動(dòng)子具有如SEQIDNO. 1所示的核巧酸序列。
[0010] 上述棉花纖維和花粉特異表達(dá)啟動(dòng)子FPSP-1的應(yīng)用，在制備轉(zhuǎn)基因棉花中的應(yīng) 用，用于控制目標(biāo)基因在轉(zhuǎn)基因棉花纖維和花粉中特異表達(dá)。
[0011] 一種棉花纖維和花粉特異型表達(dá)的啟動(dòng)子制備轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括W下步 驟： (1) 構(gòu)建具有上述SEQIDNO. 1所示序列的啟動(dòng)子FPSP-1 ; (2) 將所述啟動(dòng)子可操作地插入到表達(dá)載體中，構(gòu)建植物表達(dá)載體； (3) 將步驟（2)獲得植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主，獲得轉(zhuǎn)化體； (4 )將所述轉(zhuǎn)化體轉(zhuǎn)化植物，經(jīng)培養(yǎng)獲得轉(zhuǎn)基因植物。
[0012] 一種棉花纖維和花粉特異型表達(dá)的啟動(dòng)子制備轉(zhuǎn)基因棉花的方法，包括W下步 驟： (1) 構(gòu)建具有上述SEQIDNO. 1所示序列的啟動(dòng)子FPSP-1 ; (2) 將所述啟動(dòng)子可操作地插入到表達(dá)載體中，構(gòu)建植物表達(dá)載體； (3) 將步驟（2)獲得植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到棉花的愈傷再生組織中； (4) 培養(yǎng)所述棉花愈傷再生組織，經(jīng)篩選和誘導(dǎo)獲得含棉花纖維和花粉特異性的啟動(dòng) 子的棉花植株。
[0013] 相比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有如下有益效果： 1、由于棉花纖維是胚珠外珠被表皮細(xì)胞經(jīng)極性伸長(zhǎng)而成，因此纖維細(xì)胞是胚珠表皮細(xì) 胞的一部分；為了篩選棉花纖維特異或優(yōu)勢(shì)表達(dá)的啟動(dòng)子，本發(fā)明通過篩選纖維細(xì)胞伸長(zhǎng) 期cDNA文庫(kù)，獲得一個(gè)在纖維細(xì)胞伸長(zhǎng)期優(yōu)勢(shì)表達(dá)的基因，該基因與其它物種的花粉特異 性蛋白基因SF3同源，命名為姑況(SF3Uke-l)基因；通過檢測(cè)該基因在棉花不同組 織器官和細(xì)胞的表達(dá)特性，表明該基因在纖維細(xì)胞和花粉中特異表達(dá)；同時(shí)在纖維細(xì)胞中 的表達(dá)主要集中在纖維快速伸長(zhǎng)期。
[0014] 2、本發(fā)明通過染色體步行，獲得了姑況基因5'-上游調(diào)控序列；通過克隆、序 列分析、構(gòu)建啟動(dòng)子分析植物表達(dá)載體和棉花遺傳轉(zhuǎn)化，并通過分子鑒定為轉(zhuǎn)基因棉花后， 對(duì)轉(zhuǎn)基因棉花不同組織器官和細(xì)胞W及不同發(fā)育時(shí)期的纖維細(xì)胞進(jìn)行GUS染色分析；明確 了該段克隆的啟動(dòng)子序列在棉花中的表達(dá)特性，即在纖維細(xì)胞和花粉中特異表達(dá)，是一個(gè) 纖維和花粉特異表達(dá)啟動(dòng)子；將該段啟動(dòng)子序列命名為FPSP-1 (Fiber-PollenSpecific Promoter-1)〇
[0015] 3、本發(fā)明利用基因工程技術(shù)成功地分離了棉花纖維花粉特異表達(dá)的化SF化-1基 因的啟動(dòng)子，所述FPSP-1啟動(dòng)子含1486bp片段；由于花粉發(fā)育(花粉育性）是棉花產(chǎn)量 的一個(gè)重要指標(biāo)，纖維細(xì)胞發(fā)育直接與纖維的產(chǎn)量和品質(zhì)相關(guān)；本發(fā)明通過驗(yàn)證得出所述 FPSP-1啟動(dòng)子序列在棉花中具有纖維花粉表達(dá)特異性，能夠指導(dǎo)報(bào)告基因在棉花纖維和花 粉中特異性表達(dá)，為利用基因工程改良棉花纖維的品質(zhì)和產(chǎn)量提供了纖維和花粉特異性表 達(dá)的啟動(dòng)子序列，為基因工程改良棉花的產(chǎn)量和品質(zhì)提供了可能性和有效途徑。
[0016] 4、長(zhǎng)期的棉花栽培過程(不斷地選擇和培育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)品種)，使得較多基因巧曰 化SF化-1基因）在纖維和花粉中發(fā)揮作用；如果在棉花基因工程中使用本發(fā)明的棉花花粉 和纖維特異性表達(dá)啟動(dòng)子指導(dǎo)目標(biāo)基因只在纖維和花粉中表達(dá)，將有利于更好改良棉花纖 維產(chǎn)量和品質(zhì)，具有巨大的發(fā)展前景和意義。
[0017]
【附圖說明】
[0018] 圖1顯示姑基因在棉花不同組織器官和不同發(fā)育時(shí)期纖維胚珠中的表達(dá) 特性； 圖2顯示姑基因在棉花纖維不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)特性； 圖3是FPSP-1啟動(dòng)子擴(kuò)增產(chǎn)物電泳； 圖4顯示了FPSP-1啟動(dòng)子序列上具有的順式調(diào)控元件； 圖5是FPSP-1啟動(dòng)子分析的植物表達(dá)載體地I121-FPSP-1: :GUS酶切驗(yàn)證； 圖6是地I121-FPSP-1: :GUS植物表達(dá)載體圖譜； 圖7是擴(kuò)增驗(yàn)證轉(zhuǎn)基因棉花中的FPSP-1: :GUS基因； 圖8顯示FPSP-1啟動(dòng)子控制GUS基因在花粉中表達(dá)----野生型棉花； 圖9顯示FPSP-1啟動(dòng)子控制GUS基因在花粉中表達(dá)----轉(zhuǎn)基因棉花； 圖10顯示FPSP-1在轉(zhuǎn)基因棉花纖維中表達(dá)--野生型纖維和胚珠； 圖11顯示FPSP-1在轉(zhuǎn)基因棉花纖維中表達(dá)-----轉(zhuǎn)基因纖維和胚珠； 圖12是FPSP-1啟動(dòng)子控制GUS基因在轉(zhuǎn)基因棉花不同組織器官和纖維胚珠不同發(fā)育 時(shí)期的表達(dá)情況。
[0019]
【具體實(shí)施方式】
[0020] W下結(jié)合具體實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)說明。W下的描述并不對(duì) 本發(fā)明進(jìn)行限定，任何對(duì)本發(fā)明的變形和改變，只要不脫離本發(fā)明的精神，均應(yīng)屬于本發(fā) 明所附權(quán)利要求的范圍。
[0021] 除非另有說明，本發(fā)明實(shí)例中的試劑、藥品、材料均為市售可得，方法均參考《分子 克隆實(shí)驗(yàn)指南》（Sambrook和Russell, 2001)。
[0022] 在本發(fā)明的下述實(shí)例中，所用的棉花實(shí)驗(yàn)材料為徐州142(Gossypiumhirsutum L.cv徐州142)，來源于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所。轉(zhuǎn)基因受體為冀棉14,來源于河北 農(nóng)業(yè)大學(xué)。
[0023] 實(shí)施例1;棉花RNA的提??； 選取約3g新鮮棉花材料(分別取根、莖、葉、花、開花后0天的胚珠和纖維、開花后6天 的胚珠和纖維、開花后6天的纖維、開花后20天的纖維、開花后6天的胚珠和花后20天的 胚珠各3g);在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末，裝入50毫升離屯、管，加入15毫升65°C預(yù)熱 的RNA提取液（2% (W/V)十六烷基S甲基