一種用于治療黑色素瘤的新的二萜化合物及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于藥物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及從白背葉的干燥葉中分離得到的一種二萜類 化合物，含其的藥物組合物及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 白背葉為大戟科Euphorbiaceae野桐屬植物白背葉Mai lotus apelta(Lour ·) Muell .Arg. [Ricinus apelta Lour.]的根或葉，又名酒藥子樹、白膜葉等。味微苦、濕，性 平。我國主要分布于江蘇、安徽、江西、福建、河南、廣西、海南、陜西、云南等地。白背葉在民 間應(yīng)用廣泛，主要以根及葉入藥，根具有柔肝活血，健脾化濕，收斂固脫之功效，常用于慢性 肝炎，肝脾腫大，子宮脫垂，脫肛，白帶，妊娠水腫；葉能消炎止血，主要是外用，常用于中耳 炎，癤腫，跌打損傷，外傷出血。
[0003] 該屬植物含有豐富的化合物類型，主要以苯并吡喃類、香豆素類、三萜類以及萜類 化合物為主。苯并吡喃衍生物主要存在于白背葉的葉子中；香豆素類化合物主要存在于葉 子中，根和莖亦有分布;三萜類化合物在白背葉的根、莖、葉中均有分布。萜類化合物以二萜 類為主，存在于葉子中。此外，白背葉還含有生物堿類、黃酮類以及揮發(fā)性成分。
[0004] 研究表明白背葉葉子部分有良好的止血、抗腫瘤作用，根部分具有較好的抗病毒 和保肝活性，特別是某些化學(xué)成分具有強烈的抑制HIV、逆轉(zhuǎn)錄酶或細胞DNA聚合酶的活性， 提示其具有應(yīng)用于治療乙肝和艾滋病的潛力。此外，有研究表明，白背葉根水煎劑對金黃色 葡萄球菌有抑制作用，乙醇提取物能夠抑制志賀痢疾桿菌;從根中分離出的化合物均能在 不同程度上抑制金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、大腸桿菌及綠膿桿菌。白背葉煎劑和浸劑能使 釘螺的死亡率達到30%~60%。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種從白背葉的干燥葉中分離得到的一種二萜類化合物，含 其的藥物組合物及其制備方法和應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明的上述目的是通過下面的技術(shù)方案得以實現(xiàn)的：
[0007] 具有下述結(jié)構(gòu)式的化合物(I):
[0008]
[0009] 所還的化甘物（υ的制爸萬'/云，包谷以卜探作步驟：u)將白背葉的干燥葉粉碎，用 70~80 %乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水飽和 的正丁醇萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b)步驟(a)中乙 酸乙酯萃取物用大孔樹脂除雜，先用10%乙醇洗脫6個柱體積，再用70%乙醇洗脫8個柱體 積，收集70%洗脫液，減壓濃縮得70%乙醇洗脫濃縮物；（c)步驟(b)中70%乙醇洗脫濃縮物 用正相硅膠分離，依次用體積比為90 :1、60:1、35:1、15:1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫 得到5個組分；（d)步驟(c)中組分4用正相硅膠進一步分離，依次用體積比為20:1、15:1和5: 1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個組分；（e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反相 硅膠分離，用體積百分濃度為70 %的甲醇水溶液等度洗脫，收集8~12個柱體積洗脫液，洗 脫液減壓濃縮得到純的化合物(I)。
[0010] 進一步地，步驟(a)中，用75%乙醇熱回流提取，合并提取液。
[0011] 進一步地，所述大孔樹脂為D101型大孔吸附樹脂。
[0012] 藥物組合物，其中含有治療有效量的所述的化合物(I)和藥學(xué)上可接受的載體。
[0013] 所述的化合物(I)在制備治療黑色素瘤的藥物中的應(yīng)用。
[0014] 所述的藥物組合物在制備治療黑色素瘤的藥物中的應(yīng)用。
[0015] 本發(fā)明化合物用作藥物時，可以直接使用，或者以藥物組合物的形式使用。
[0016] 該藥物組合物含有治療有效量的本發(fā)明化合物（I)，其余為藥物學(xué)上可接受的、對 人和動物無毒和惰性的可藥用載體和/或賦形劑。
[0017] 所述的可藥用載體或賦形劑是一種或多種選自固體、半固體和液體稀釋劑、填料 以及藥物制品輔劑。將本發(fā)明的藥物組合物以單位體重服用量的形式使用。本發(fā)明藥物可 通過口服或注射的形式施用于需要治療的患者。用于口服時，可將其制成片劑、緩釋片、控 釋片、膠囊、滴丸、微丸、混懸劑、乳劑、散劑或顆粒劑、口服液等;用于注射時，可制成滅菌的 水性或油性溶液、無菌粉針、脂質(zhì)體或乳劑等。
【附圖說明】
[0018] 圖1為化合物(I)結(jié)構(gòu)式；
[0019] 圖2為化合物（I)計算E⑶和實驗E⑶圖；
[0020]圖3為BrdU免疫熒光檢測細胞增殖結(jié)果。
【具體實施方式】
[0021] 下面結(jié)合實施例進一步說明本發(fā)明的實質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明保護范 圍。盡管參照較佳實施例對本發(fā)明作了詳細說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對 本發(fā)明的技術(shù)方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實質(zhì)和范圍。
[0022] 主要材料、試劑來源及儀器類型：
[0023]乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷為分析純，購自上海凌峰化學(xué)試劑有限 公司，甲醇，分析純，購自江蘇漢邦化學(xué)試劑有限公司。
[0024]實施例1:化合物(I)分離制備及結(jié)構(gòu)確證
[0025] (a)白背葉的干燥葉（10kg)粉碎，用75 %乙醇熱回流提?。?0L X 3次），合并提取 液，濃縮至無醇味（6L)，依次用石油醚(6L X 3次）、乙酸乙酯（6L X 3次）和水飽和的正丁醇 (6LX3次)萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物(381g)和正丁醇萃取物；（b)步驟 (a)中乙酸乙酯萃取物用D101大孔樹脂除雜，先用10%乙醇洗脫6個柱體積，再用70%乙醇 洗脫8個柱體積，收集70 %洗脫液，減壓濃縮得70%乙醇洗脫濃縮物（125g);(c)步驟(b)中 70 %乙醇洗脫濃縮物用正相硅膠分離，依次用體積比為90:1 (8個柱體積）、60 :1 (8個柱體 積）、35:1 (8個柱體積）、15:1 (10個柱體積)和1:1 (6個柱體積)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得 到5個組分；（d)步驟(c)中組分4(27g)用正相硅膠進一步分離，依次用體積比為20:1(8個柱 體積）、15:1(8個柱體積)和5:1(6個柱體積)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個組分；（e)步 驟(d)中組分2(15g)用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積百分濃度為70 %的甲醇 水溶液等度洗脫，收集8~12個柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到純的化合物(I)(31mg)。 [0026] 結(jié)構(gòu)確證:HR-ESIMS顯示[M+Na]+為m/z 575.2502，結(jié)合核磁特征可得分子式為 C28H4〇Oii，不飽和度為9。核磁共振氫譜數(shù)據(jù)δΗ(ρρπι，DMS〇-d6，500MHz): H-1 (4 · 68，br，s)，H-2 (1.52，m)，H-2(1.91，m)，H-3(1.02，m)，H-3(1.76，td，J=14.5,3.9)，H-6(5.33，br，s)，H-7 (5.04，m)，H-8(1.83，m)，H-9(1.15，td，J=13.2,4.6)，H-ll(1.26，t，J=12.5)，H-ll(1.49， m)，H-15(5.95，d，J = 2.3)，H-16(6.21，d，J = 2.3)，H-17(1.34，s)，H-18(1.01，s)，H-19 (1.04，s)，H-20(1.07，s)，l-0Ac(2.03，s)，6-0Ac(1.93，s)，7-0Ac(1.96，s)，H-r(3.47，m)， !1-1'（3.78，111)，!1-2'（1.12，111) ;核磁共振碳譜數(shù)據(jù)3。(？?111，0130-(16，1251抱）：75.0(〇1，1-〇， 22.6(CH2,2-C)，32.2(CH2,3-C)，38.1(C，4-C)，79.6(C，5-C)，75.3(CH，6-C)，74.1(CH，7-C)， 52.6(CH，8-C)，38.3(CH，9-C)，42.5(C，10-C)，34.0(CH 2，11-C)，175.8(C，12-C)，57.4(C， 13-C)，87.7(C，14-C)，80.4(CH，15-C)，106.1(CH，16-C)，23.1(CH3，17-C)，29.5(CH 3，18-C)， 23.8(CH3，19-C)，16.1(CH3,20-C)，169.1(C，1-0Ac)，20.7(CH3，1-0Ac)，170.9(C，6-0Ac)， 21.5(CH3,6-0Ac)，169.0(C，7-0Ac)，20.8(CH3,7-0Ac)，62.4(CH2，r-C)，15.4(CH 3,2'-C); 碳原子標(biāo)記參見圖1。紅外光譜表明該化合物含有羥基（3470CHT1)和羰基（1757，1725〇1^) 基團。hNMR 譜顯示出四個含氧次甲基信號5財.68(1^，8，!1-1)，5.33(1^，8，!1-6)，5.04(111，!1-7)，5.95((1，了 = 2.3!^，!1-15)和6.21((1，了 = 2.3抱，!1-16);兩個次甲基3!11.83(111，!1-8)和1.15 (七(1，了 = 13.2,4.6他，!1-9);三個乙酰氧甲基；五個甲基6!11.34(!1-17)丄01(!1-18)丄04(!1-19)，1.07(H-20)，1.12(H-2'）^CNMR譜顯示有28個信號，含有八個甲基，四個亞甲基(一個 含氧），七個次甲基(五個含氧碳)和九個季碳（四個羰基碳，兩個含氧季碳）。上述數(shù)據(jù)表明， 該化合物為含有三個乙酰氧基取代的三環(huán)二萜類化合物。H-1 (δΗ4.68，br，s)，H-6(δΗ5.33， 1^，8)和!1-70!15.〇4，111)與其相應(yīng)的乙酰氧基0(：169.1，17〇.9，169.〇)的相關(guān)性，表明(：-1(3 〇75.〇)，〇60〇75.3)和(：-70〇74.1)位分別連有一個乙酰氧基。圓8(：譜中]^-17與(：-8，(：-13 和C-14的相關(guān)性表明C-17位為甲基。HMBC譜中，H-15和C-14的相關(guān)性表明該化合物含有氧 雜環(huán)丁烷部分。在ROESY譜中，H-1與Me-20，Me-20與H-8，H-8與H-6以及H-6與Me-19的相關(guān)性 表明!1-1，!1-6，!1-8，]\^-19和]^-2〇為0型構(gòu)型，而!1-9與!1-7的交叉峰顯示這些質(zhì)子的€[構(gòu)型。 綜合氫譜、碳譜、HMBC譜和ROESY譜，以及文獻關(guān)于相關(guān)類型核磁數(shù)據(jù)，可基本確定該化合物 如圖1所示，立體構(gòu)型進一步通過E⑶試驗確定，理論值與實驗值基本一致(圖2)。
[0027]實施例2:化合物（I)藥理作用試驗 [0028] -、材料和儀器
[0029] 人A375黑色素瘤細胞株由第三軍醫(yī)大學(xué)贈。化合物（I)自制，制備方法見實施例1， HPLC歸一化純度大于98%<^ΜΕΜ培養(yǎng)基、0.25%胰酶購自美國Gibco公司。MTT(3-(4,5-二甲 基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽；四甲基偶氮唑藍）、DMS0(二甲基亞砜）、BrdU購自美國 Sigma公司。鼠抗BrdU多克隆抗體購自美國ABcam公司。山羊抗鼠二抗購自美國Cel 1 signaling公司。Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自美國Promega公司。
[0030] 恒溫C02培養(yǎng)箱，普通冰箱，-80度冰箱均為美國Forma公司產(chǎn)品。超凈工作臺（中國 蘇州凈化工程公司）。倒置顯微鏡，倒置熒光顯微鏡(Olympus公司）。電熱恒溫培養(yǎng)箱（中國 上海躍進醫(yī)療器械廠）。自動酶標(biāo)儀（日本W(wǎng)ako公司）。紫外分光光度儀(美國Beckman公司）。 J6-HC高速離心機(美國Beckman公司）。低溫微量離心機(德國Eppendorf公司）。振蕩搖床 (美國Forma公司）。
[0031]二、試驗方法 [