berg等人（上面引用的 美國(guó)專利公開(kāi)）所進(jìn)一步例證的；因而，需要電子地鑒別哪個(gè)微孔含有分析物和哪個(gè)微孔 是空的方法。
[0052] 通常，僅將單個(gè)分析物設(shè)置在單個(gè)微孔中。在一個(gè)方面，將相同分析物的多個(gè)拷貝 連接在固體支持物（諸如珠子或顆粒）上，并選擇所述固體支持物，以在大小和形狀方面 與微孔匹配，使得僅單個(gè)固體支持物適合進(jìn)入單個(gè)微孔，從而確保僅一類分析物在單個(gè)微 孔中。如上所述，對(duì)于有些類型的分析物，諸如核酸，可以使用諸如滾環(huán)擴(kuò)增（RCA)等方法 來(lái)構(gòu)建連接的擴(kuò)增子，所述擴(kuò)增子形成可以排它地占據(jù)微孔的單個(gè)主體，例如如在Drmanac 等人，美國(guó)專利公開(kāi)2009/0137404中所公開(kāi)的。在將分析物隨機(jī)地分布進(jìn)微孔中以后，可 以使用對(duì)表面電荷的變化做出響應(yīng)的電子傳感器來(lái)鑒別含有分析物的微孔。因而，在一個(gè) 方面，本發(fā)明的方法包括：導(dǎo)入傳感器活性試劑，其可以與在目標(biāo)分析過(guò)程中使用的試劑相 同或不同，所述試劑能夠隨著它的濃度的變化而改變?cè)趥鞲衅鞲浇碾姾伞?br>[0053] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的該方面可以包括下述步驟：(a)將流動(dòng)室中的試劑 從第一試劑（傳感器響應(yīng)于該第一試劑產(chǎn)生第一輸出信號(hào)）改變?yōu)榈诙噭▊鞲衅黜憫?yīng) 于該第二試劑產(chǎn)生第二輸出信號(hào)）；和（b)將傳感器響應(yīng)于所述改變而產(chǎn)生第二輸出信號(hào) 的時(shí)間延遲與分析物在它的對(duì)應(yīng)的微孔中的存在相關(guān)聯(lián)。在本發(fā)明的該方面，可以使用任 意類型的電化學(xué)傳感器，包括電位傳感器、阻抗傳感器或電流傳感器，只要輸出信號(hào)取決于 電極或其它分析物-敏感的表面和傳感器活性試劑（其到達(dá)被微孔中的物理或化學(xué)阻礙所 延遲）的相互作用。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述傳感器活性試劑是洗滌溶液，所述洗滌溶液 的PH不同于它替代的試劑，所述試劑也可以是洗滌溶液。改變?cè)噭┑牟襟E包括：記錄陣列 中傳感器的輸出信號(hào)，從而得到信號(hào)值（或其數(shù)字表示）的連續(xù)時(shí)間記錄，可以對(duì)其進(jìn)行分 析，以確定與傳感器活性試劑到達(dá)各個(gè)傳感器的時(shí)間相對(duì)應(yīng)的輸出信號(hào)的變化時(shí)機(jī)。通過(guò) 常規(guī)的數(shù)據(jù)獲取和分析組件，可以進(jìn)行這樣的數(shù)據(jù)記錄和分析。
[0054] 如圖2C所示，當(dāng)傳感器活性試劑流入流動(dòng)室中時(shí)，它穿過(guò)含有顆粒（212)的微孔 (201)以及穿過(guò)微孔（250)從流動(dòng)室（206)擴(kuò)散，并到達(dá)在傳感器板（220)對(duì)面的鈍化層 (216)區(qū)域。只要微孔（201)含有分析物或顆粒（212)，裝載試劑的擴(kuò)散鋒線（252)就會(huì)相 對(duì)于空孔（250)中的鋒線（254)延遲，無(wú)論是通過(guò)分析物/顆粒在擴(kuò)散通道中的物理阻礙， 還是通過(guò)與分析物/顆?；蛩Y(jié)合的固體支持物的化學(xué)相互作用（如果存在的話）。因而， 通過(guò)將傳感器的輸出信號(hào)的變化的時(shí)間延遲（256)與分析物/顆粒的存在相關(guān)聯(lián)，可以確 定含有分析物的微孔。在一個(gè)實(shí)施方案中，在將傳感器構(gòu)造成測(cè)量PH的情況下，裝載試劑 是具有預(yù)定PH的溶液，其用于替代在不同的預(yù)定pH的第一試劑。在用于核酸測(cè)序的實(shí)施 方案中，氫離子擴(kuò)散的延遲受到分析物和/或顆粒的物理阻礙和緩沖容量二者的影響。優(yōu) 選地，第一試劑pH是已知的，且試劑的改變會(huì)有效地將微孔的傳感器暴露于pH的階躍函數(shù) 變化，這將產(chǎn)生它們各自的傳感器板上的電荷的快速變化。在一個(gè)實(shí)施方案中，第一試劑和 裝載試劑（或有時(shí)在本文中稱作"第二試劑"或"傳感器活性的"試劑）之間的PH變化是 2. OpH單位或更??；在另一個(gè)實(shí)施方案中，這樣的變化是1.0 pH單位或更小；在另一個(gè)實(shí)施 方案中，這樣的變化是〇. 5pH單位或更小；在另一個(gè)實(shí)施方案中，這樣的變化是0.1 pH單位 或更小。使用常規(guī)試劑，例如HCl、NaOH等，可以產(chǎn)生pH變化。用于基于pH的DNA測(cè)序反 應(yīng)的這種試劑的示例性濃度是在5至200 μ M或10至100 μ M范圍內(nèi)。測(cè)量在傳感器板對(duì)面 的微孔表面處的電荷的變化，其指示分析物（或分析物的反應(yīng)所產(chǎn)生的副產(chǎn)物）的存在與 否，并記錄為傳感器的輸出信號(hào)的相關(guān)變化，例如電壓水平隨時(shí)間的變化。圖2D顯示了來(lái) 自陣列上的傳感器的數(shù)據(jù)，所述陣列根據(jù)Rothberg等人，美國(guó)專利公開(kāi)2009/0127589來(lái) 生產(chǎn)，其具有在圖1〇、11Α、和19中所述的傳感器布局、間距（9 μπι)、和平面圖。給與第一傳 感器相對(duì)應(yīng)的微孔裝載5. 9 μ m直徑珠子（其連接有模板、引物和聚合酶），且與第二傳感器 相對(duì)應(yīng)的微孔是空的。當(dāng)流動(dòng)池中的試劑從PH7. 2變成pH 8. 0并在pH 8. 0值維持5. 4秒 時(shí)，記錄來(lái)自每個(gè)傳感器的輸出信號(hào)。曲線（270)顯示了來(lái)自第一傳感器（其微孔含有珠 子）的輸出信號(hào)的值，曲線（272)顯示了來(lái)自第二傳感器（其微孔是空的）的輸出信號(hào)的 值。兩條曲線都顯示了從與pH 7. 2相對(duì)應(yīng)的高值改變?yōu)榕cpH 8.0相對(duì)應(yīng)的低值。但是， 與攜帶珠子的微孔的對(duì)應(yīng)信號(hào)相比，空孔的對(duì)應(yīng)信號(hào)明顯更快地達(dá)到低值。使用常規(guī)數(shù)據(jù) 分析技術(shù)，可以容易地測(cè)定各個(gè)輸出信號(hào)達(dá)到更低值的時(shí)間差A(yù)t (274)或相當(dāng)?shù)亩攘俊Ｍ?過(guò)多種方法，包括作為等高線圖或"熱"圖，如圖3C所示，可以用圖形顯示陣列內(nèi)含有顆粒 的微孔的位置和密度。
[0055] 在本發(fā)明的一個(gè)方面，可以給微孔陣列提供隨機(jī)分布的待測(cè)分析物的位置。這樣 的產(chǎn)品或制品包括：（i)傳感器陣列，其包括多個(gè)形成在回路支持基質(zhì)中的傳感器，所述陣 列的每個(gè)傳感器被構(gòu)造成產(chǎn)生至少一個(gè)與在其附近的一種或多種預(yù)定的物質(zhì)的濃度或存 在有關(guān)的電信號(hào)；和微孔陣列，其設(shè)置在回路支持基質(zhì)上，使得它的每個(gè)微孔具有在微孔 陣列的表面上的開(kāi)口并設(shè)置在至少一個(gè)傳感器上；和（ii)多個(gè)隨機(jī)地分布在微孔中的分 析物，所述分析物的位置可通過(guò)它的對(duì)應(yīng)的傳感器所產(chǎn)生的輸出信號(hào)來(lái)確定。在一個(gè)實(shí)施 方案中，所述分析物包含顆粒，所述顆粒具有與其相連的核酸片段（諸如基因組DNA片段、 cDNA片段等）的克隆群體。
[0056] 流動(dòng)池和輸出信號(hào)收集
[0057] 許多構(gòu)型的流動(dòng)池設(shè)計(jì)是可行的；因而，本文提供的系統(tǒng)和方法不依賴于特定流 動(dòng)池構(gòu)型的使用。本發(fā)明的流動(dòng)池的設(shè)計(jì)和性能規(guī)范包括、但不限于下述的：（i)使改變分 析物所暴露的試劑所需的時(shí)間最小化，（ii)使順序的試劑的混合最小化，也就是說(shuō)，在順序 的試劑之間提供均勻的流鋒線，（iii)提供流體在陣列上的層流和均勻的渡越時(shí)間（包括 消除或最小化截留流體從而可以發(fā)生順序流之間的混合的任意區(qū)域（諸如死體積）），（iv) 提供足夠的流過(guò)微孔的體積（例如，通過(guò)在微孔陣列的上方提供足夠體積的流動(dòng)室），使得 在微孔容積和流之間通過(guò)擴(kuò)散發(fā)生有效的物質(zhì)交換），（V)使氣泡形成最小化（包括減少會(huì) 促進(jìn)氣泡形成的尖銳的拐角或邊緣，控制試劑中溶解的氣體，和提供可被水性試劑容易地 潤(rùn)濕的表面），（Vi)使參比電極的放置簡(jiǎn)易化，（Vii)使分析物向陣列的微孔或反應(yīng)室中的 裝載簡(jiǎn)易化等。
[0058] 在一個(gè)方面，本發(fā)明的流動(dòng)池將試劑流導(dǎo)向微孔陣列，使得隨著試劑被遞送至陣 列，每個(gè)微孔基本上同時(shí)暴露于基本上相同的經(jīng)過(guò)微孔陣列的流動(dòng)條件（包括流量、濃度 等）。在提及這樣的暴露時(shí)，"基本上同時(shí)"是指，與微孔暴露于任一種試劑的時(shí)間長(zhǎng)度相 比，2種順序試劑之間的邊界穿過(guò)流動(dòng)室的渡越時(shí)間較小。對(duì)于有些流動(dòng)池構(gòu)型，在每個(gè)微 孔處相同的流量是不可能的，例如具有位于流動(dòng)室的對(duì)角處的入口和出口的流動(dòng)池被限制 為直線空間。盡管如此，一個(gè)優(yōu)選的設(shè)計(jì)特征是，不同的微孔所經(jīng)歷的流動(dòng)條件（諸如流 量）的差異被流動(dòng)室和它限定的流動(dòng)通道最小化。如上所述，流動(dòng)池可以具有多種用于實(shí) 現(xiàn)上述性能和生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)的設(shè)計(jì)，諸如公開(kāi)在：R〇thberg等人，美國(guó)專利公開(kāi)2009/0127589 ; Rothberg等人，英國(guó)專利申請(qǐng)GB24611127。滿足這樣的設(shè)計(jì)和性能標(biāo)準(zhǔn)的本發(fā)明的流動(dòng) 池如圖4A-4E所示。圖解的設(shè)計(jì)提供了簡(jiǎn)單的生產(chǎn)，其中通過(guò)將具有入口和出口的組件連 接至芯片或包裹的微孔陣列-傳感器陣列單元上，形成流動(dòng)池。在該實(shí)施方案中，流動(dòng)室是 當(dāng)將這樣的組件相組合或彼此連接時(shí)形成的內(nèi)部空間。在該設(shè)計(jì)中，將入口定位在流動(dòng)室 的拐角處，將出口定位在對(duì)角線相對(duì)的拐角處。該設(shè)計(jì)是簡(jiǎn)單的，因?yàn)樗鼉H需要2個(gè)生產(chǎn)的 組件，且入口和出口的對(duì)角線定位會(huì)使截留試劑或延遲它們的渡越時(shí)間的流動(dòng)室區(qū)域最小 化（例如在圖3A中的（301))。圖3A圖解了試劑的流動(dòng)通道（300)，所述試劑沿著流動(dòng)室 的對(duì)角線軸從入口（302)至出口（304)穿過(guò)流動(dòng)室。在一個(gè)實(shí)施方案中，參照這樣的流動(dòng) 通道來(lái)定義流動(dòng)室，如圖3B所示。也就是說(shuō)，在圖4A的實(shí)施例中，使壁（410)和邊界（307) (限定在下面更完整地描述的"塞住的"傳感器）的形狀基本上符合試劑穿過(guò)具有對(duì)角線相 對(duì)的入口和出口的正方形或矩形流動(dòng)室時(shí)所流經(jīng)的流動(dòng)通道。結(jié)果是，試劑流被限制在中 央?yún)^(qū)（308)和拐角區(qū)（306)，使得試劑發(fā)生混合或形成渦流的區(qū)域不可接近。可以估測(cè)邊界 (307)的曲率（例如使用一部分二次方程或類似的標(biāo)準(zhǔn)曲線），或可以使用下述可商業(yè)得到 的流體動(dòng)力學(xué)軟件來(lái)計(jì)算它：例如，來(lái)自Dassault Systems(Concord, MA)的SolidWorks ; 來(lái)自 FlowMaster USA, Inc. (Glenview, IL)的 Flowmaster ;和 OpenFOAM (在環(huán)球網(wǎng) www. opencfd. co. uk上可得到的用于計(jì)算流體動(dòng)力學(xué)的開(kāi)放源代碼）。在采用浮動(dòng)閘chemFET 作為傳感器的實(shí)施方案中，優(yōu)選地，在試劑不可接近區(qū)域（306)中的傳感器被電連接，所以 不會(huì)將假電壓水平導(dǎo)入在傳感器陣列的那些部分中產(chǎn)生的輸出信號(hào)中。也就是說(shuō)，在這樣 的實(shí)施方案中，傳感器陣列的讀出回路連續(xù)讀出所有列和所有行，所以不需要專門(mén)的回路 或編程來(lái)避免不可接近區(qū)域中的傳感器。相反，從這樣的區(qū)域中的傳感器記錄恒定的預(yù)定 輸出信號(hào)。
[0059] 在本發(fā)明的上述的一個(gè)方面，通過(guò)將順序的試劑（在本文中稱作第一試劑和預(yù) 定試劑）導(dǎo)入流動(dòng)池，所述流動(dòng)池以預(yù)定的方式改變陣列的傳感器所感知的電荷，可以鑒 別出含有分析物的反應(yīng)室或微孔。如圖3C所示，這樣的鑒別的結(jié)果可以顯示為微孔陣列 (310)在流動(dòng)室中的密度圖譜，其中用色度（312)指示分析物在陣列微孔內(nèi)的分布。在該實(shí) 施方案中，色度（312)指示在整個(gè)陣列中含有分析物的微孔的局部百分比（例如100個(gè)微 孔的每個(gè)不重疊區(qū)域的百分比），除了未使用的區(qū)域（306)以外。
[0060] 可以以多種方式用微孔陣列和傳感器陣列裝配流動(dòng)池，諸如公開(kāi)在：R〇thberg等 人，美國(guó)專利公開(kāi)2009/0127589和Rothberg等人，英國(guó)專利申請(qǐng)GB24611127,它們通過(guò) 引用并入。在圖4A-4D所示的一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)將流控接口部件連接至含有傳感器芯 片的殼體上，制備流動(dòng)池。通常，將集成的微孔-傳感器陣列（即，傳感器芯片）安裝在保 護(hù)芯片的殼體或封裝件中，并提供用于與其它裝置連通的電接觸件。將流控接口部件設(shè)計(jì) 成提供試劑在其中穿過(guò)的腔或流動(dòng)室（當(dāng)它密封地連接至這樣的封裝時(shí)）。在一個(gè)方面，通 過(guò)將組件粘合在一起，實(shí)現(xiàn)這樣的連接。圖4A顯示了本發(fā)明流動(dòng)池的組件（400)的底視圖 (或正面）（下面稱作"直線主體"）。在圖解的實(shí)施方案中，通過(guò)將組件（400)連接至含有 傳感器陣列的封裝件上，形成完整的流動(dòng)池（如圖4C和4D所示）。隆起物（401)從表面 (413)隆起，并在與圖4C所示的芯片（430)配合時(shí)，形成橢圓形流動(dòng)室（408)的壁（410)。 可以將組件（400)粘合至芯片殼體（430)(下面統(tǒng)稱為"直線接口封裝件"）上以形成不透 流體的密封件。圖4B顯示了組件或部件（400)的頂視圖（或正面）（416)，其顯示了入口環(huán) (418)和出口環(huán)（420)，它們?cè)试S流動(dòng)池密封地連接至流控系統(tǒng)。入口管和出口管連接至插 入環(huán)（418)和（420)中的彈性體環(huán)形部件上，使得彈性體材料形成沿著底板和環(huán)（418)和 (420)的壁的密封件。可以使用將流動(dòng)池連接至流控系統(tǒng)上的其它方式，包括其它類型的 壓力配合、基于卡箍的配合、螺旋配合等，它們是普通技術(shù)人員的設(shè)計(jì)選擇。用簡(jiǎn)單的設(shè)計(jì) 變化，可以改造組件（400)，以適應(yīng)不同尺寸的芯片，如通道（422)和（424)所示。也就是 說(shuō)，對(duì)于圖4C所示的小陣列（434)，具有在入口環(huán)（418)和出口環(huán)（420)的中心處的開(kāi)口 的通道，可以被這樣的通道引向組件或部件（400)的中心，在陣列（430)上到達(dá)入口孔和出 口孔。同樣地，對(duì)于圖4D所示的大陣列（436)，類似的通道（442和444)可以被引導(dǎo)遠(yuǎn)離 組件（400)的中心，并到達(dá)陣列（436)的入口和出口。這具有提供單個(gè)基礎(chǔ)流動(dòng)池設(shè)計(jì)的 優(yōu)點(diǎn)，所述單個(gè)基礎(chǔ)流動(dòng)池設(shè)計(jì)可以與多個(gè)傳感器陣列尺寸一起使用。突出部（412)和斜 角（414)用于確保芯片以正確的朝向放入互補(bǔ)的插座或裝置中，以用于產(chǎn)生與裝置的剩余 部分的流控連接和電連接。
[0061] 在一個(gè)方面，本發(fā)明包括流動(dòng)池部件（在圖4A和4B中圖解），其用于形成與設(shè)置 在直線接口封裝件中的不同直線尺寸的傳感器陣列的流控界面。這樣的部件包括下述元 件：（a)具有上面和下面的直線主體，且直線主體的形狀與直線接口封裝件的形狀匹配，使 得直線主體的下面可結(jié)合直線接口封裝件，以形成傳感器陣列的不透流體的外殼，其中在 上面的一端設(shè)置有入口，在上面的相對(duì)端設(shè)置有出口；(b)位于直線主體內(nèi)部的入口通道， 所述入口通道提供從入口至不透流體的外殼的流體通道，形成位于傳感器陣列的上方且在 傳感器陣列一端處的直線主體的下面中的入口孔；和（C)位于直線主體內(nèi)部的出口通道， 所述出口通道提供從出口至不透流體的外殼的流體通道，形成位于傳感器陣列的上方且在 所述傳感器陣列的與入口孔相對(duì)的一端處的直線主體的下面中的出口孔。在一個(gè)實(shí)施方案 中，所述入口與入口環(huán)同心地設(shè)置在所述上面的拐角中，且所述出口與出口環(huán)同心地設(shè)置 在所述上面的與所述入口和入口環(huán)對(duì)角地相對(duì)的拐角中。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述入口 環(huán)和出口環(huán)各自具有半徑，且其中所述入口孔和所述出口孔各自分別在所述入口環(huán)和出口 環(huán)的半徑的垂直突出部?jī)?nèi)定位在所述直線主體的所述下面上。在另一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)使 直線主體連接至直線接口封裝件上時(shí)，形成多個(gè)不透流體的外殼，如圖4E所示。
[0062] 圖4E圖解了如何使用上面的設(shè)計(jì)概念來(lái)制做多個(gè)單獨(dú)的流動(dòng)池，其中使用單個(gè) 大傳感器陣列。流控接口部件（462)安裝在殼體（未顯示）上且與其密封連接，所述殼體容 納傳感器陣列（450)，并限定2個(gè)流動(dòng)室（451)和（453)，每個(gè)流動(dòng)室具有單獨(dú)的入口（分 別是454和456)和單獨(dú)的對(duì)角線相對(duì)的出口（分別是458和460)，它們分別連接至共同 的試劑源和共同的廢物管線。通過(guò)把流控接口部件（452)連接至芯片殼體上所形成的內(nèi) 壁（480、482、484和486)會(huì)限定穿過(guò)流動(dòng)室（451)和（453)的流動(dòng)通道，并防止對(duì)角區(qū)域 (470、474、476、和 478)接觸穿過(guò)流動(dòng)室的試劑。優(yōu)選地，在采用浮動(dòng)閘FET的實(shí)施方案中， 在拐角區(qū)（470、474、476、和478)中的傳感器如上所述被塞住。同樣地，在中央隔離物（462) 所限定的區(qū)域中或在其下面的傳感器也被塞住，使得它們不產(chǎn)生有源傳感器的輸出信號(hào)噪 音。
[0063] 通過(guò)多種方法和材料，可以制造本發(fā)明的流動(dòng)池和流控回路（下面描述）。在 選擇材料時(shí)應(yīng)當(dāng)考慮的因素包括：需要的化學(xué)惰性程度、工作條件（例如溫度等）、要 遞送的試劑的體積、是否需要參比電壓、可制造性等。對(duì)于小規(guī)模流體遞送，微流控制 造技術(shù)非常適用于制造本發(fā)明的流控回路，這樣的技術(shù)的指導(dǎo)是本領(lǐng)域普通技術(shù)人 員可容易地得到的，例如 Malloy, Plastic Part Design for Injection Molding:An Introduction(Hanser Gardner Publications, 1994) ;Herold 等人編，Lab-on-a-Chip Technology(Vol. I)!Fabrication and Microfluidics(Caister Academic Press,2009)； 等。對(duì)于中規(guī)模和更大規(guī)模的流體遞送，常規(guī)的加工技術(shù)可以用于制造可裝配進(jìn)本發(fā)明的 流動(dòng)池或流控回路中的部件。在一個(gè)方面，可以使用塑料諸如聚碳酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯 等來(lái)制造本發(fā)明的流動(dòng)池和流控回路。
[0064] 如上所述，將分析物隨機(jī)地分布在陣列的微孔中，如在圖5A中關(guān)于陣列部分 (