D-二聚體近紅外熒光法檢測試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是設(shè)及一種D-二聚體近紅外法巧光檢測試劑盒 及其用途。
【背景技術(shù)】
[000引D-二聚體是交聯(lián)纖維特異性降解產(chǎn)物，也是繼發(fā)性纖溶特有代謝產(chǎn)物。D-二聚 體是在各種病理或生理狀態(tài)下，凝血系統(tǒng)激活導(dǎo)致凝血活酶將纖維蛋白原轉(zhuǎn)化成纖維蛋白 體，并在活化因子XIII的作用下形成交聯(lián)纖維蛋白。D-二聚體是交聯(lián)纖維蛋白在纖溶酶講 解過程中所釋放碎片進一步降級產(chǎn)生的含有丫鏈的片段。受到病理因素影響，機體凝血及 纖溶動態(tài)平衡遭到破壞，凝血傾向不斷增加，從而導(dǎo)致纖維蛋白降解產(chǎn)物增加。因此，D-二 聚體含量升高，表明機體內(nèi)存在纖維蛋白血栓形成和纖溶發(fā)生，臨床上也將D-二聚體含量 的變化作為機體高凝狀態(tài)與纖溶亢進狀態(tài)的分子標志物。
[0003]D-二聚體的檢測是臨床對繼發(fā)性纖溶靈敏度較高、特異性強的檢驗項目，是目前 判斷機體高凝狀態(tài)和鑒別原發(fā)性與繼發(fā)性纖溶、觀察溶栓治療效果等方面有重要臨床價值 的指標。D-二聚體的檢測有重大的臨床應(yīng)用價值；可用于彌漫性血管內(nèi)凝血值1C)的早期 診斷，深靜脈血栓值VT)及肺栓塞的篩查，急性腦梗死的早期診斷、治療和愈后觀察，肝病 的治療和診斷及對惡性腫瘤的療效和愈后觀察等。
[0004] 因此，對D-二聚體的快速、全面、準確、特異檢測顯得尤為重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 鑒于W上所述現(xiàn)有技術(shù)的缺點，本發(fā)明的目的在于提供一種D-二聚體近紅外巧 光法檢測試劑盒及其用途，用于建立高效可行的D-二聚體近紅外巧光檢測技術(shù)，解決現(xiàn)有 技術(shù)中的問題。本發(fā)明所提供的檢測試劑盒結(jié)合近紅外巧光檢測技術(shù)，可快速，準確的檢測 出人全血/血清/血漿中D-二聚體。
[0006] 為實現(xiàn)上述目的及其他相關(guān)目的，本發(fā)明采用W下技術(shù)方案：
[0007] 本發(fā)明的第一方面提供一種D-二聚體近紅外巧光法檢測試劑盒，包括位于背板 上的試劑條，試劑條從加樣端開始依次為樣品墊、標記有免疫巧光探針的玻璃纖維素膜、包 被有抗D-二聚體單克隆抗體的硝酸纖維素膜和吸水紙。
[000引優(yōu)選的，所述免疫巧光探針為抗D-二聚體單克隆抗體包被的近紅外巧光乳膠微 球顆粒。
[0009] 優(yōu)選的，硝酸纖維素膜上包被的抗D-二聚體單克隆抗體和所述近紅外巧光乳膠 微球顆粒上包被的抗D-二聚體單克隆抗體可W為相同的抗D-二聚體單克隆抗體，也可W 為不同的抗D-二聚體單克隆抗體。
[0010] 更優(yōu)選的，所述硝酸纖維素膜上包被的抗D-二聚體單克隆抗體為Abeam嚴Anti-D-Dimer抗體巧D1]，所述近紅外巧光乳膠微球顆粒上包被的抗D-二聚體單克 隆抗體為Abeam盛Anti-D-Dimer抗體巧D1]，或所述硝酸纖維素膜上包被的Abeam? Anti-D-Dimer抗體巧Dl]，所述近紅外巧光乳膠微球顆粒上包被的抗D-二聚體單克隆抗體 為Abeam篡Anti-D-Dimer抗體I!孤2]。
[0011] 更優(yōu)選的，所述巧光乳膠微球顆粒的直徑為140-160nm。
[001引近紅外光（NIR)，是介于可見光（VI巧和中紅外光（MIR)之間的電磁波，ASTM定義NIR為波長在780nm-2526皿范圍內(nèi)的電磁波。在近紅外光區(qū)，生物體自吸收或巧光強度很 小，可避免背景干擾。同時由于散射光強度與波長的四次方呈反比，近紅外區(qū)的散射干擾大 為減少。
[0013] 本發(fā)明的第二方面提供所述D-二聚體近紅外巧光法檢測試劑盒的制備方法，包 括如下步驟：
[0014] 1)用緩沖液將巧光乳膠微粒離屯、清洗并將乳膠顆粒分散，在清洗好的乳膠顆粒分 散液中加入抗D-二聚體單克隆抗體；加入邸CA使抗體與顆粒偶聯(lián)；再加入封閉液封閉乳 膠顆粒上多余的基團，制備獲得探針溶液；
[0015] 2)將含有抗D-二聚體單克隆抗體的緩沖溶液噴加到硝酸纖維素膜上，烘干備用；
[0016]扣將步驟1)制備獲得的探針溶液浸潤玻璃纖維薄膜，干燥備用；
[0017] 4)將步驟2)所得的硝酸纖維素膜、步驟3)所得的標記有免疫巧光探針的玻璃纖 維素膜、樣品墊、吸水紙及背板組裝制備成D-二聚體近紅外巧光檢測試劑盒。
[0018] 優(yōu)選的，所述步驟1)中，再加入封閉液封閉乳膠顆粒上多余的基團，并加入冠離， 制備獲得探針溶液，所述冠離選自二環(huán)已基-18-冠-6、15-冠離-5、18-冠離-6中的一種 或多種的組合。
[0019] 更優(yōu)選的，步驟1)制備獲得的探針溶液中冠離的濃度為0.l-20mg/ml，更優(yōu)選為 4-8mg/ml。
[0020] 優(yōu)選的，所述步驟1)中，緩沖液為磯酸鹽（PB巧緩沖液。
[002U 更優(yōu)選的，所述PBS緩沖液為0. 009-0.0 llmol/L，PH7. 25-7. 35的PBS緩沖液。
[0022] 優(yōu)選的，所述步驟1)中，巧光乳膠微粒的直徑為140-160nm。
[0023] 優(yōu)選的，所述步驟1)中，乳膠顆粒、抗D-二聚體單克隆抗體、邸CA的重量比為 9-11 ;0. 9-1. 1 ;0. 9-1. 1。
[0024] 在本發(fā)明一優(yōu)選實施例中，乳膠顆粒、抗D-二聚體單克隆抗體、邸CA的投料量分 別為lmg、100ug、100ug。
[0025] 優(yōu)選的，所述封閉液為己醇胺，加入量為適量，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)實際情況調(diào) 整己醇胺的用量。
[0026] 優(yōu)選的，所述步驟2)中，所述緩沖溶液為PBS緩沖液。
[0027] 本領(lǐng)域技術(shù)人員可選取適當濃度和抑的PBS緩沖液，更優(yōu)選為0. 009-0.0 llmol/ L，PH7. 25-7. 35 的PBS緩沖液。
[002引優(yōu)選的，所述步驟2)中，含有抗D-二聚體單克隆抗體的緩沖溶液中還含有冠離， 所述冠離選自二環(huán)已基-18-冠-6、15-冠離-5、18-冠離-6中的一種或多種的組合。
[0029] 更優(yōu)選的，所述含有抗D-二聚體單克隆抗體的緩沖溶液中冠離的濃度為 0.l-20mg/ml，更優(yōu)選為 4-8mg/ml。
[0030] 優(yōu)選的，所述步驟2)中，含有抗D-二聚體單克隆抗體的緩沖溶液中抗D-二聚體 單克隆抗體的濃度為1. 8-2. 2mg/ml。
[0031] 優(yōu)選的，所述步驟2)中，抗D-二聚體單克隆抗體的緩沖溶液的噴加量為 0. 9-1. lul/cm。
[0032] 優(yōu)選的，所述步驟2)中，烘干的具體條件為36-38°C烘箱烘干。
[0033] 所述噴加過程利用微量蛋白點膜系統(tǒng)。
[0034] 優(yōu)選的，所述步驟1)中的抗D-二聚體單克隆抗體為Abeam戀Anti-D-Dimer抗體 曲)1]，所述步驟2)中的抗D-二聚體單克隆抗體為Abeam?Anti-D-Dimer抗體曲)1]，或 所述步驟1)中的抗D-二聚體單克隆抗體為Abeam?Anti-D-Dimer抗體巧D1]，所述步驟 2)中的抗D-二聚體單克隆抗體為Abeam嚴Anti-D-Dimer抗體腳)2]。
[0035] 優(yōu)選的，所述步驟3)中，干燥的具體條件為真空干燥機干燥。
[0036] 本發(fā)明的第S方面提供了所述D-二聚體近紅外巧光法檢測試劑盒在D-二聚體檢 測領(lǐng)域的用途。
[0037] 所述用途具體為使用所述D-二聚體近紅外巧光法檢測試劑盒對樣品中的D-二聚 體進行檢測，所述樣品選自人全血、血清或血漿中的一種或多種的組合。
[003引本發(fā)明所提供的檢測試劑盒W人全血/血清/血漿為檢測樣本，結(jié)合近紅外巧光 檢測技術(shù)，可快速，準確的檢測出患者標本中的D-二聚體。所述試劑盒采用免疫巧光層析 法，其最小可測量可達2.Oug/l，檢測方便、成本低，靈敏度高，特異性好，比同類定量診斷試 劑價格低20-30%，大大節(jié)約了社會醫(yī)療成本，檢測過程中樣品收集及處理簡單，可快速準 確的獲得結(jié)果，非常適合突發(fā)事件現(xiàn)場和基層使用，并可應(yīng)用到臨床檢測中，為臨床治療提 供定性依據(jù)。
【具體實施方式】
[0039]W下通過特定的具體實例說明本發(fā)明的實施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可由本說明書 所揭露的內(nèi)容輕易地了解本發(fā)明的其他優(yōu)點與功效。本發(fā)明還可W通過另外不同的具體實 施方式加W實施或應(yīng)用，本說明書中的各項細節(jié)也可W基于不同觀點與應(yīng)用，在沒有背離 本發(fā)明的精神下進行各種修飾或改變。
[0040] 在進一步描述本發(fā)明【具體實施方式】之前，應(yīng)理解，本發(fā)明的保護范圍不局限于下 述特定的具體實施方案；還應(yīng)當理解，本發(fā)明實施例中使用的術(shù)語是為了描述特定的具體 實施方案，而不是為了限制本發(fā)明的保護范圍；在本發(fā)明說明書和權(quán)利要求書中，除非文中 另外明確指出，單數(shù)形式"一個"、"一"和"該個"包括復(fù)數(shù)形式。
[0041] 當實施例給出數(shù)值范圍時，應(yīng)理解，除非本發(fā)明另有說明，每個數(shù)值范圍的兩個端 點W及兩個端點之間任何一個數(shù)值均可選用。除非另外定義，本發(fā)明中使用的所有技術(shù)和 科學術(shù)語與本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的意義相同。除實施例中使用的具體方法、設(shè)備、 材料外，根據(jù)本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員對現(xiàn)有技術(shù)的掌握及本發(fā)明的記載，還可W使用與本 發(fā)明實施例中所述的方法、設(shè)備、材料相似或等同的現(xiàn)有技術(shù)的任何方法、設(shè)備和材料來實 現(xiàn)本發(fā)明。
[0042] 除非另外說明，本發(fā)明中所公開的實驗方法、檢測方法、制備方法均采用本技術(shù) 領(lǐng)域常規(guī)的分子生物學、生物化學、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和分析、分析化學、細胞培養(yǎng)、重組DNA技 術(shù)及相關(guān)領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。該些技術(shù)在現(xiàn)有文獻中已有完善說明，具體可參見Sambrook 等MOLECULAR CLONING ;A LABORATORY MANUAL, Second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989and "Third edition，2001;Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, J