一種檢測scml2的時間分辨免疫熒光試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測SCML2的時間分辨免疫焚光試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]SCML2是Montini等于1999年首先在果蠅的SCM基因Xp22染色體被鑒定出來，總長約15Kb，在C端為高度保守內(nèi)含子和外顯子的結(jié)構(gòu)。SCML2在哺乳動物廣泛表達(dá)并且編碼一個700個氨基酸的蛋白。SCML2是多梳基因家族的一個成員，多梳家族基因編碼一組染色體結(jié)合蛋白，研究表明它在胚胎發(fā)育過程中起到關(guān)鍵作用，它能抑制trxG蛋白對胚胎發(fā)育的活化作用。大多數(shù)的哺乳動物的多梳家族基因與果蠅同源，敲除老鼠的多梳家族基因，老鼠出現(xiàn)造血缺陷、神經(jīng)嵴缺陷、心臟畸形。SCML2可能與HOX基因轉(zhuǎn)錄抑制有關(guān)，而后者的突變可導(dǎo)致發(fā)育畸形；并且SCML2與多疏蛋白抑制復(fù)合體的調(diào)節(jié)有關(guān)，后者與維持抑制和阻止染色體重塑有關(guān)，同時它在調(diào)控胚胎發(fā)育的同源基因中起著重要作用。近來部分臨床研究資料也證實多梳家族基因與細(xì)胞增殖和腫瘤形成的調(diào)控有關(guān)，SCML2可在急性髓細(xì)胞白血病過度表達(dá)，進(jìn)一步佐證其在細(xì)胞分化和細(xì)胞周期調(diào)控中起重要作用。
[0003]我們之前運用免疫組織化學(xué)研究發(fā)現(xiàn)SCML2在人神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤組織中呈現(xiàn)高表達(dá)，并且它的表達(dá)水平與神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的病理類型、病理分級、侵潤深度及分期相關(guān)；我們運用自建的SCML2的時間分辨免疫熒光試劑盒檢測發(fā)現(xiàn)，正常人、消化道良性腫塊和其它非神經(jīng)內(nèi)分泌性腫瘤外周血清中均未檢測出SCML2蛋白，而神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤患者外周血清中的SCML2水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。因此，SCML2對神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤具有明確的診斷價值。
[0004]時間分辨免疫熒光檢測方法是一種成熟的免疫分析方法，具有高特異、高靈敏的優(yōu)點，是在臨床醫(yī)學(xué)和檢驗醫(yī)學(xué)等諸多方面得到十分廣泛的應(yīng)用，是目前取代放射性免疫分析的一種定量檢測方法；它的基本原理是利用三價稀土離子(如Eu3+)作為示蹤物，延遲檢測壽命較長的特異性激發(fā)熒光以排除非特異性及背景熒光的干擾，即測定復(fù)合物中的稀土離子被激發(fā)的延遲熒光強(qiáng)度，從而確定待測蛋白的濃度。使用熒光增強(qiáng)液的TRF能夠檢測到皮克水平的蛋白，因此，本試劑盒采用TRF的方法來檢測SCML2的濃度，是考慮了多方面的優(yōu)點。
[0005]目前，國際上還沒有報道專門用于檢測SCML2的時間分辨免疫熒光方法，也沒有相應(yīng)的試劑盒提供，因此，該試劑盒的開發(fā)和應(yīng)用，是填補(bǔ)了這方面的空白。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，現(xiàn)提供一種靈敏、特異的檢測樣本中SCML2蛋白濃度的時間分辨免疫熒光試劑盒。
[0007]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是:一種檢測SCML2的時間分辨免疫焚光試劑盒，其創(chuàng)新點在于:包括盒體，所述盒體中包括以下容器: (1)包被緩沖液容器；
(2)封閉液容器；
(3)洗滌液容器；
(4)加樣緩沖液容器；
(5)熒光增強(qiáng)液容器；
(6)檢測緩沖液容器；
(7)包被抗體容器；
(8)檢測抗體容器；
(9)Eu3+標(biāo)記的鏈親和霉素容器；
(10)標(biāo)準(zhǔn)品容器。
[0008]進(jìn)一步的，所述盒體中容器中試劑成分包括以下組成:
(1)包被緩沖液容器中為磷酸鹽緩沖液，其成分為140mMNaCl、2.7mM KClUOmMNa2HPOjP 1.8mM KH 2P04，所述磷酸鹽緩沖液的pH值為7.4 ；
(2)封閉液容器中成分為含有1%牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液；
(3)洗滌液容器中成分為含0.05%Tween-20的Tris-HCl緩沖液，所述具體成分為50mM的Tris-HCl緩沖液和0.05%Tween_20，所述Tris-HCl緩沖液的PH值為7.8 ；
(4)加樣緩沖液容器的成分為含1%牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液；
(5)熒光增強(qiáng)液容器中成分為熒光增強(qiáng)液；
(6)檢測緩沖液容器成分為50mM的Tris-HCl緩沖液，所述Tris-HCl緩沖液的PH值為7.8，所述Tris-HCl緩沖液中含有1%牛血清白蛋白，1%牛球蛋白、0.05%Tween_40和二乙烯三胺五乙酸；
(7)包被抗體容器中為單克隆小鼠抗人SCML2抗體，所述單克隆小鼠抗人SCML2抗體的儲存濃度為0.2 μ g/ μ I ；
(8)檢測抗體容器中為生物素化的羊抗人SCML2多抗，所述生物素化的羊抗人SCML2多抗的儲存濃度為50ng/ μ I ;
(9)Eu3+標(biāo)記的鏈親和霉素容器中為Eu3+標(biāo)記的鏈親和霉素，所述Eu3+標(biāo)記的鏈親和霉素的儲存濃度為0.1 μ g/ μ I ;
(10)標(biāo)準(zhǔn)品容器中為重組人SCML2蛋白，所述重組人SCML2蛋白的濃度為100μ g/ μ I。
[0009]進(jìn)一步的，具體使用方法包括以下步驟:
(1)用磷酸鹽緩沖液稀釋包被抗體一單克隆小鼠抗人SCML2抗體至濃度為4μ g/ml，以100 μ I/孔加入96孔酶標(biāo)板，進(jìn)行過夜放置，所述放置溫度為4°C ；
(2)棄去包被抗體，采用300μ I/孔洗滌液洗滌三次，加入封閉液200 μ I/孔，在37°C條件下孵育Ih ;
(3)棄去封閉液，采用300μ I/孔洗滌液洗滌三次，加入待測培養(yǎng)上清樣品和倍比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品100 μ I/孔，在37°C條件下孵育Ih ;
(4)棄去樣品和標(biāo)準(zhǔn)品，采用300μ I/孔洗滌液洗滌三次；
(5)用加樣緩沖液稀釋檢測抗體一生物素化的羊抗人SCML2多抗至濃度為75ng/ml，以100 μ I/孔加入稀釋好的檢測抗體，在37°C條件下孵育Ih ;
(6)棄去檢測抗體，采用300μ I/孔洗滌液洗滌三次； (7)用檢測緩沖液稀釋Eu3+標(biāo)記的鏈親和霉素，所述Eu3+標(biāo)記的鏈親和霉素的最終稀釋濃度為500ng/ml，以100 μ I/孔加入酶標(biāo)板，在37°C避光條件下孵育Ih ;
(8)棄去Eu3+標(biāo)記的鏈親和霉素，采用300μ I/孔洗滌液洗滌四次；
(9)加入熒光增強(qiáng)液200μ I/孔，室溫避光緩慢水平搖動5min ;
(10)讀板:設(shè)定激發(fā)光波長為337nm，發(fā)射光波長為615nm，延時200微秒測定615nm處的熒光值；
(11)利用統(tǒng)計學(xué)繪圖軟件根據(jù)測定的值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；
(12)通過標(biāo)準(zhǔn)曲線和未知濃度樣品的熒光值計算待測樣品中的SCML2的濃度。
[0010]本發(fā)明的有益效果如下:
(I)本發(fā)明應(yīng)用時間分辨免疫熒光法能夠高靈敏、高特異地檢測外周血中的SCML2濃度。
[0011 ] (2 )本發(fā)明具有良好的穩(wěn)定性，操作時間短，成本低。
【附圖說明】
[0012]圖1為檢測SCML2蛋白濃度的檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0013]圖2為檢測SCML2的時間分辨免疫熒光試劑盒的結(jié)構(gòu)示意圖。
【具體實施方式】
[0014]以下由特定的具體實施例說明本發(fā)明的實施方式，熟悉此技術(shù)的人士可由本說明書所揭露的內(nèi)容輕易地了解本發(fā)明的其他優(yōu)點及功效。
[0015]如圖2所示為檢測SCML2的時間分辨免疫熒光試劑盒的結(jié)構(gòu)示意圖，一種檢測SCML2的時間分辨免疫熒光試劑盒，包括盒體8，盒體8中包括以下容器:
(1)包被緩沖液容器2;
(2)封閉液容器I；
(3)洗滌液容器3;
(4)加樣緩沖液容器4；
(5)熒光增強(qiáng)液容器5;
(6)檢測緩沖液容器6;
(7)包被抗體容器7;
(8)檢測抗體容器10；
(9)Eu3+標(biāo)記的鏈親和霉素容器11 ;
(10)標(biāo)準(zhǔn)品容器12。
[0016]盒體中容器中試劑成分包括以下組成:
(1)包被緩沖液容器2中為磷酸鹽緩沖液，其成分為140mMNaCl,2.7mM KC