復合型納米疫苗及其制備方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)學技術領域，尤其是涉及一種以聚合物納米顆粒為載體的復合 型納米疫苗及其制備方法。
【背景技術】
[0002] 腫瘤疫苗介導的抗腫瘤免疫治療是繼手術、化療、和放療后的第四種抗腫瘤療法， 主要利用腫瘤細胞的抗原物質刺激機體產(chǎn)生特異性腫瘤細胞免疫殺傷，從而達到消滅腫瘤 的目的。與傳統(tǒng)的抗腫瘤治療相比，腫瘤疫苗具有安全性好、特異性高等諸多優(yōu)點，目前已 被廣泛用于治療肺癌、結腸癌、前列腺癌、乳腺癌、黑色素瘤等各類惡性腫瘤，然而其臨床療 效仍有待進一步提1?。
[0003] 樹突狀細胞（DC)作為體內功能最強的抗原遞呈細胞，是激發(fā)機體產(chǎn)生抗腫瘤免疫 應答的首要核心環(huán)節(jié)。它能迅速攝取抗原，并將抗原信息通過MHCI類分子提呈給CD8+T淋 巴細胞，使之活化成為細胞毒性T淋巴細胞（cytotoxic Tlymphocyte, CTL)，繼而殺死腫瘤 細胞。此外，DC還通過分泌一系列細胞因子和趨化因子，進一步增強CTL介導的腫瘤細胞 殺傷。然而，在腫瘤患者體內，特別是在腫瘤組織中，成熟的DC數(shù)量減少且功能明顯降低， 不能有效刺激機體T細胞活化。這一現(xiàn)象被認為是腫瘤細胞逃逸機體免疫監(jiān)視、誘導免疫 耐受的重要機制之一。因此，誘導腫瘤微環(huán)境中的DCs (tumor-associated DCs，TADCs)的 成熟和活化，是提高腫瘤疫苗臨床療效的重要策略。
[0004] RNA干擾技術（RNAi)被認為是研究功能基因組最有力的工具之一。這種新興 的生物技術為腫瘤分子水平的基因治療提供了新的技術和方法。RNAi是指通過雙鏈RNA (dsRNA)介導，特異性地降解靶mRNA，導致轉錄后水平的基因沉默現(xiàn)象。它與傳統(tǒng)的基因敲 除技術相比，具有投入少，周期短，操作簡單等優(yōu)勢。RNAi已作為一種簡單有效的基因敲除 的技術，廣泛地應用于功能基因組學研究以及抗病毒、抗腫瘤治療的研究中。最近的研究表 明，利用RNAi阻斷TADC的免疫抑制信號通路是克服免疫抑制的重要手段。文獻報道，利用 RNAi技術降低DC細胞分泌抑制性因子(如IL-IO和TGF-)的分泌，減少DC表面免疫抑制分 子H)-L1的表達水平，顯著促進DC的抗原呈遞功能和抑瘤效果。然而，由于缺乏合適的載 體，利用RNAi技術增強腫瘤疫苗的療效在體內目前尚難得以實現(xiàn)。處于腫瘤微環(huán)境中的腫 瘤相關樹突狀細胞（tumor-associated dendritic cells,TADCs)不但功能受到抑制，而且 對免疫佐劑的刺激反應低下，是制約腫瘤疫苗臨床療效的重要原因。目前尚無有效的手段 可以活化TADCs，也缺乏高效安全的載體可將siRNA遞送到TADCs以阻斷其胞內的免疫抑制 性信號通路。
[0005] 納米載體是指可以負載小分子藥物、基因和蛋白質等目標物質且具有納米尺度的 系統(tǒng)。其中，基于可降解高分子化合物的聚合物納米顆粒因其良好的生物相容性和安全性， 被廣泛用于藥物、基因及疫苗載體。例如，聚氨基酸是一種由氨基酸組成的均聚物或共聚 物，它的降解產(chǎn)物為氨基酸，是一種人體需要的成分，由于氨基酸的種類很多，可以通過選 擇不同的氨基酸聚合可以得到各種性質不同的聚氨基酸材料(親水、疏水、電正性、電負性 等)，所以聚氨基酸是一種非常有潛力的生物材料。
[0006] 但是，現(xiàn)有的納米載體仍然存在許多不足，如多數(shù)納米載體穩(wěn)定性較差，生物相容 性不是非常良好，不能在體內完全降解和代謝，不能同時負載基因和蛋白質等多種物質等， 制備復雜且不能很好的控制納米載體的粒徑大小等，這些缺點的存在很大程度上限制了聚 合物納米載體在制備納米疫苗中的應用。例如，"納米疫苗及其制備方法"(CN 102068698A) 提供了一種采用甘露糖基化的陽離子脂質體復合物作為疫苗載體，負載蛋白質抗原，但該 發(fā)明中的納米載體不能同時負載siRNA。又如，"一種樹突狀細胞靶向納米脂質體瘤苗的制 備工藝"(CN101690805A)，該方案是將a l，3Gal糖脂引入到納米脂質體表面，制備具有DCs 靶向性的納米瘤苗脂質體，活化DCs以增強抗腫瘤免疫反應，但同樣地，該發(fā)明也不能聯(lián)合 負載siRNA。另外，"一種高分子基因藥物載體及其制備方法和在制備抗腫瘤藥物中的應用" (公開號CN102512683A)使用環(huán)糊精羥丙基環(huán)糊精作為載體骨架，構建帶正電荷的納米顆粒 負載能夠抑制腫瘤血管內皮生長因子生成的siRNA進入腫瘤細胞；但是，該發(fā)明只用于基 因治療，不能用于納米疫苗介導的免疫治療。

【發(fā)明內容】

[0007] 基于此，本發(fā)明的目的之一在于提供一種以性三嵌段共聚物為聚乙二醇衍生 物-聚賴氨酸-聚亮氨酸的三嵌段聚合物同時負載腫瘤抗原、免疫佐劑和siRNA的復合型 納米疫苗，具體技術方案如下：
[0008] -種復合型納米疫苗，包括以下組份：
[0009] 腫瘤抗原：1_20重量份；
[0010] 免疫佐劑：1-20重量份；
[0011] siRNA :大于0小于等于10重量份；
[0012] 聚乙二醇衍生物-聚賴氨酸-聚亮氨酸的三嵌段聚合物：50-100重量份。
[0013] 優(yōu)選地，所述復合型納米疫苗包括以下組份：
[0014] 腫瘤抗原：10~20重量份；
[0015] 免疫佐劑：1~10重量份；
[0016] siRNA :0· 5-5 重量份；
[0017] 聚乙二醇衍生物-聚賴氨酸-聚亮氨酸的三嵌段聚合物：65~100重量份。
[0018] 在其中一些實施例中，上述納米疫苗中的所述聚乙二醇衍生物-聚賴氨酸-聚亮 氨酸的三嵌段聚合物（PEG-PLys-PLeu)的一端通過酰胺鍵與所述聚乙二醇衍生物相連，另 一端與所述聚亮氨酸相連，所述聚乙二醇衍生物為單甲醚氨基聚乙二醇（CH 3O-PEG-NH2)或 者氨基聚乙二醇羧酸（NH2-PEg-COOH),所述聚乙二醇衍生物分子量為1000-10000 (更優(yōu)選 為1500-2500)，所述聚賴氨酸的聚合度為10-100 (更優(yōu)選為20-50)，所述聚亮氨酸的聚合 度為10-100 (更優(yōu)選為20-50)。
[0019] 在其中一些實施例中，上述納米疫苗中的所述免疫佐劑為Toll樣受體激動劑、 NOD樣受體激動劑、細胞因子、趨化因子或其組合。
[0020] 在其中一些實施例中，上述納米疫苗中的所述siRNA為化學合成的siRNA或載體 表達的siRNA。
[0021] 在其中一些實施例中，上述納米疫苗中的所述腫瘤抗原為腫瘤組織細胞的蛋白抗 原提取物或重組的蛋白/多肽抗原。
[0022] 本發(fā)明還提供上述復合型納米疫苗的制備方法，包括以下步驟：
[0023] ( 1)按重量份稱取所述聚乙二醇衍生物-聚賴氨酸-聚亮氨酸的三嵌段聚合物，完 全溶解于超純水中，形成均一、透明的聚合物納米膠束水溶液；
[0024] (2)按重量份稱取所述腫瘤抗原，免疫佐劑，和siRNA，加入到所述聚合物納米膠束 水溶液中，充分混合均勻，室溫條件下放置〇. 5-2小時，制成所需的復合型納米疫苗。
[0025] 本發(fā)明所述的復合型納米疫苗可采用皮下注射、皮內注射、和肌肉注射等方法對 機體進行免疫，用于腫瘤免疫治療。
[0026] 本發(fā)明具有如下有益效果：
[0027] 本發(fā)明采用聚乙二醇-聚賴氨酸-聚亮氨酸三嵌段聚合物溶于水后得到的聚多肽 納米膠束作為疫苗載體，聯(lián)合負載腫瘤抗原、免疫佐劑和針對免疫抑制信號的siRNA，制備 一種復合型抗腫瘤疫苗，解決了現(xiàn)有技術中納米載體制劑穩(wěn)定性差，生物相容性差，體內循 環(huán)時間短，不能同時負載小分子藥物、基因和蛋白質多種物質等問題。這種納米疫苗將同時 實現(xiàn)以下功能：1、通過納米膠束負載抗原，提高抗原呈遞細胞對抗原的攝取呈遞，從而提高 腫瘤疫苗的免疫效力；2、將siRNA高效地遞送至TADCs，通過阻斷其免疫抑制信號，打破免 疫耐受；3、協(xié)同免疫佐劑（Toll樣受體激動劑）誘導活化TADCs，從而進一步提高腫瘤疫苗 的抗腫瘤作用。
[0028] 另外，該疫苗所采用的聚乙二醇-聚賴氨酸-聚亮氨酸三嵌段聚合物載體，具有生 物相容性好，毒性低的優(yōu)點，在生物體內可降解，降解產(chǎn)物無毒無害可吸收或代謝。其制備 方法簡便易行，穩(wěn)定性良好，便于推廣。
【附圖說明】
[0029] 圖1是實施例2中，聚合物納米膠束負載疏水性分子的結構圖和示意圖。
[0030] 圖2是實施例2中，復合型納米疫苗的合成過程和產(chǎn)物結構示意圖。
[0031] 圖3是實施例3中，復合型納米疫苗促進DC對抗原和siRNA的攝取實驗的檢測結 果。
[0032] 圖4是實施例4中，聚合物膠束負載siRNA和免疫佐劑對TADC中STAT3表達及磷 酸化水平的影響實驗的Western blot檢測結果圖。
[0033] 圖5是實施例5中，聚合物膠束負載siRNA和免疫佐劑協(xié)同誘導TADC活化實驗的 流式細胞術檢測結果；其中，圖5A為⑶86在TADC上的表達水平；圖5B為⑶40在TADC上 的表達水平。
[0034] 圖6是實施例6中，復合型納米疫苗對小鼠腫瘤生長的抑制作用試驗結果圖；其 中，圖6A為腫瘤體積隨時間(天數(shù)）變化圖，圖6B為小鼠存活率隨時間變化圖。
【具體實施方式】
[0035] 下面結合附圖與實施例對本發(fā)明進行進一步的詳細說明。若未特別指明，實施例 中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規(guī)手段。
[0036] 實施例1
[0037] 本實施例是本發(fā)明所公開的復合型納米疫苗所采用的聚乙二醇單甲醚-聚賴氨 酸-聚亮氨酸三嵌段聚合物載體的制備過程。
[0038] 該制備方法包括以下步驟：
[0039] (1)將聚合管抽真空后充氮氣保護，取Ig分子量為2000的CH3O-PEG-NH 2，用 20mLN，N-二甲基甲酰胺（DMF)溶解后加入到聚合管內；
[0040] (2)按賴氨酸環(huán)狀酸酐單體與CH3O-PEG-NH2的摩爾比為10 :1的比例加入Lys-NCA 單體，氮氣保護下恒溫反應24小時；
[0041] 然后，按亮氨酸環(huán)狀酸酐單體與CH3O-PEG-NH2的摩爾比為10:1的比例加入 Leu-NCA單體，氮氣保護下繼續(xù)恒溫反應24小時；
[0042] 反應結束后，加入10倍的乙醚沉淀、過濾、干燥得到聚乙二醇-側鏈保護的聚賴氨 酸-聚亮氨酸（PEG-PLZ-PLeu)三嵌段聚合物；
[0043] (3)將以上所得PEG-PLZ-PLeu聚合物溶于(TC的三氟乙酸，加入2倍量的HBr體 積含量為30%的HBr/HA。反應2小時后，加入10倍的乙醚沉淀、過濾；
[0044] 將所得產(chǎn)物溶解于N，N-二甲基甲酰胺，使用截留分子量為2000的透析袋在水 中透析48小時，每2小時換透析水一次，隨后凍干，得到聚乙二醇-聚賴氨酸-聚亮氨酸 (PEG-PLys-PLeu)的三嵌段聚合物（PEG-PLL 3tl-PLLeu4tl),平均分子量為 2700。
[0045] 聚賴氨酸鏈段聚合度為30,聚亮氨酸鏈段的聚合度為40。
[0046] 實施例2
[0047] 本實施例是用實施例1中所制得的PEG-PLys-PLeu三嵌段共聚物、腫瘤抗原 (