本發(fā)明屬于分子生物學領(lǐng)域，涉及一種柑橘類病毒cdna二聚體及其侵染性克隆的快速制備新方法。

背景技術(shù)：

類病毒是一類246～401-nt大小的閉合環(huán)狀的單鏈小分子rna，能在敏感寄主上引發(fā)嚴重病癥，是一種重要的植物病原物。柑橘裂皮類病毒(citrusexocortisviroid,cevd)屬于馬鈴薯塊莖類病毒科(pospiviroidae)馬鈴薯塊莖類病毒屬(pospiviroid)，是柑橘裂皮病的病原，可在枳和枳橙砧木上引起嚴重的裂皮癥狀，是威脅世界柑橘產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要病害之一。柑橘樹皮裂紋類病毒(citrusbarkcrackingviroid,cbcvd)屬于馬鈴薯塊莖類病毒科(pospiviroidae)椰子死亡類病毒屬(cocadviroid)，可在無cevd的情況下與其他柑橘類病毒復(fù)合侵染枳橙砧木引起類似柑橘裂皮病的癥狀。由cbcvd引起的啤酒花矮縮病是啤酒花上一種毀滅性病害，癥狀包括葉片卷曲，黃化，過早開花和球果尺寸變小，干根腐爛，植株發(fā)育遲緩甚至死亡。

另外，前人研究表明，cevd和cbcvd在某些敏感寄主上存在交叉保護現(xiàn)象，然研究者對其互作機理尚不清楚。兩種類病毒復(fù)合侵染能明顯降低cevd在敏感砧木上的癥狀，這為預(yù)防柑橘裂皮病提供了交叉保護的新思路。最近研究表明，來源于類病毒的小rna在類病毒致病性上扮演了重要角色。前期研究表明，由cevd和cbcvd負鏈產(chǎn)生的小rna主要來自于兩者基因組具有高度序列同源性的區(qū)域，分析交叉保護現(xiàn)象與這些小rna可能有緊密聯(lián)系。

方便快捷的植物病原物侵染性克隆構(gòu)建方法，是研究病原致病性的基礎(chǔ)和保證，可用于植物和病原之間的互作，外源基因的表達以及由其引起的基因沉默研究等。類病毒侵染性克隆的構(gòu)建方法可廣泛應(yīng)用在其侵染性研究，癥狀分析，致病性研究，以及類病毒在寄主中的移動途徑研究等。

傳統(tǒng)的類病毒構(gòu)建方法操作步驟繁瑣，耗時費力，且所用載體和試劑復(fù)雜多樣，成本較高。以下是常見的類病毒侵染性克隆構(gòu)建方法：選擇合適的酶切位點設(shè)計引物擴增類病毒全長目標片段，克隆測序后篩選優(yōu)勢序列用于構(gòu)建侵染性克隆，通常選用pgem-t載體，類病毒單體質(zhì)粒構(gòu)建完成后進行酶切并回收目的片段和載體(目的片段用于連接成二聚體，回收載體經(jīng)脫磷后與二聚體進行連接)。將回收的單體片段加入連接酶后進行連接，得到含有類病毒全長二聚體的連接混合液，向此混合液中加入回收并且脫磷的載體，再一次進行連接處理。之后轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物，涂板培養(yǎng)后挑選單克隆進行酶切或者菌液pcr鑒定，最后通過測序鑒定是否得到正確的二聚體重組質(zhì)粒。根據(jù)插入片段的方向，選擇合適的酶進行單酶切，使用rna聚合酶體外轉(zhuǎn)錄目標片段獲得具有侵染活性的類病毒二聚體rna。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于針對上述技術(shù)問題，提供一種柑橘類病毒cdna二聚體及其侵染性克隆的快速制備新方法。

本發(fā)明實現(xiàn)其目的的技術(shù)方案為：

一種柑橘類病毒cdna二聚體的快速制備新方法，包括如下步驟：

(1)提取柑橘類病毒的總rna；

(2)利用一步法rt-pcr對提取的總rna進行擴增，pcr反應(yīng)體系包括：primescript1stepenzymemix、mgcl2、類病毒全長擴增引物、總rna、無rna酶的水；擴增完畢即得柑橘類病毒cdna二聚體。

在上述技術(shù)方案中，所述的柑橘類病毒為cevd，使用的類病毒全長擴增引物對為：cevd-for/cevd-rev，引物序列為cevd-for：5'-ggaaacctggaggaagtcgag-3'，cevd-rev：5'-ccggggatccctgaaggactt-3'。

在上述技術(shù)方案中，所述的pcr反應(yīng)體系總體積為25ul，由如下組分組成：2×one-stepbuffer12.5ul、25mm的mgcl23～5ul、10um的cevd-for0.4～0.6ul、10um的cevd-rev0.4～0.6ul、primescript1stepenzymemix0.2～1ul、總rna100～1000ng，余量為無rna酶的水。

在上述技術(shù)方案中，pcr反應(yīng)條件為：50℃反轉(zhuǎn)錄30min；95℃酶滅活3min；然后95℃/30s，58℃/30s，68℃/1min，35個循環(huán)；最后68℃延伸10min。

在上述技術(shù)方案中，所述的柑橘類病毒為cbcvd，使用的類病毒全長擴增引物對為：cbcvd-for/cbcvd-rev，引物序列為cbcvd-for：5'-ggggaaatctcttcagac-3'，cbcvd-rev：5'-ggggatccctcttcaggt-3'。

所述的柑橘類病毒為cbcvd時，在利用總rna進行一步法rt-pcr擴增之前，先將總rna進行高溫解鏈處理，其擴增效果會更好，得到的cdna二聚體更多，雜質(zhì)更少。

所述的柑橘類病毒為cbcvd時，所述的pcr反應(yīng)體系總體積為25ul，由如下組分組成：2×one-stepbuffer12.5ul、25mm的mgcl23～5ul、10um的cbcvd-for0.4～0.6ul、10um的cbcvd-rev0.4～0.6ul、primescript1stepenzymemix0.5ul、總rna100～1000ng，余量為無rna酶的水。8、如權(quán)利要求7所述的柑橘類病毒cdna二聚體的快速制備新方法，其特征在于，pcr反應(yīng)條件為：55℃反轉(zhuǎn)錄30min；94℃酶滅活3min；然后94℃/30s，58℃/30s，68℃/45min，35個循環(huán)；最后68℃延伸7min。

一種柑橘類病毒侵染性克隆的快速制備新方法，先利用前述的方法制備得到柑橘類病毒cdna二聚體，然后將該二聚體克隆進t載體，獲得包含該二聚體的連接產(chǎn)物，即得此柑橘類病毒的侵染性克隆。

所述的t載體為pgem-teasy載體。

本發(fā)明的有益效果是：

首次利用一步法rt-pcr直接擴增得到了類病毒的二聚體，并首次建立了本發(fā)明的快速有效的類病毒侵染性克隆構(gòu)建新方法，通過對反應(yīng)體系和擴增條件的創(chuàng)新性改進，一步法rt-pcr就可以直接擴增得到類病毒的二聚體，對二聚體純化回收后連接進pgem-teasy載體里面，大腸桿菌轉(zhuǎn)化，經(jīng)測序分析篩選后提取質(zhì)粒即可得到穩(wěn)定有效的類病毒侵染性克隆載體，包含類病毒二聚體的質(zhì)粒載體線性化后即可作為模板進行體外轉(zhuǎn)錄獲得具有侵染活性的類病毒二聚體rna。

該方法快速、高效、穩(wěn)定，方法獨特，通過指示植物驗證及分子生物學檢測證明此種類病毒侵染性克隆構(gòu)建新方法高效可行。操作者可以快速高效的完成類病毒侵染性克隆的構(gòu)建工作，對在多種病原復(fù)合侵染情況下分離類病毒，并為接下來更深入的類病毒致病機理研究及類病毒與其他病原和寄主的互作關(guān)系研究提供基礎(chǔ)和保證。

利用本發(fā)明方法建立的cevd和cbcvd的侵染性克隆，有效排除其它病原物的影響，為研究者探索二者之間在寄主上的拮抗機制提供基礎(chǔ)和保障，同時本方法對于科研工作者研究cevd和cbcvd各自與寄主之間的互作及其致病機理都有重要的價值和意義。

附圖說明

圖1是cevd和cbcvd的總rna分別通過一步法rt-pcr獲取的二聚體產(chǎn)物，其中，m：dl2000；1和3：健康對照；2：cevd陽性；4：cbcvd陽性。

圖2是cevd或cbcvd全長二聚體cdna序列插入進t載體序列中的示意圖。

圖3是體外轉(zhuǎn)錄cevd/cbcvd二聚體rna接種指示植物香櫞后的癥狀表現(xiàn)，其中，a為健康香櫞,b為cevd接毒香櫞,c為cbcvd接毒香櫞。

圖4是cevd/cbcvd二聚體rna接種植物的一步法rt-pcr驗證，其中，m：dl2000，1、5：健康對照，2：cevd陽性，3：cevd接毒香櫞，4：cevd接毒番茄，6：cbcvd陽性，7：cbcvd接毒香櫞。

圖5是利用地高辛標記探針法檢測cevd接毒番茄的northernblot結(jié)果，其中，a為northernblot結(jié)果，b為rna質(zhì)量檢測結(jié)果，在a/b中，1：健康番茄，2：cevd接毒番茄。

具體實施方式

實施例1類病毒資源和一步法rt-pcr

cevd毒源取自臍橙‘眉山9號’，cbcvd毒源取自雜柑‘朱見’。利用植物rna快速提取試劑盒(或trizol法)提取植物葉片總rna。設(shè)計特異性引物，利用primescript^tm一步法rt-pcr試劑盒(貨號：rr055a,takara公司,中國大連)直接擴增所需類病毒二聚體全長序列。本發(fā)明中所用cevd特異性引物對為cevd-for(5'-ggaaacctggaggaagtcgag-3')和cevd-rev(5'-ccggggatccctgaaggactt-3')，cbcvd特異性引物對為cbcvd-for:(5'-ggggaaatctcttcagac-3')和cbcvd-rev(5'-ggggatccctcttcaggt-3')。

利用獲得的總rna直接進行一步法rt-pcr擴增cevd，具體反應(yīng)體系及擴增條件如下：

1、cevd反應(yīng)體系：

cevd擴增條件：50℃反轉(zhuǎn)錄30min；95℃酶滅活3min；然后95℃/30s，58℃/30s，68℃/1min，35個循環(huán)；最后68℃延伸10min。取5ulpcr產(chǎn)物在1.5％瓊脂糖凝膠中電泳，經(jīng)eb染色后，使用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果，結(jié)果見圖1所示。

2、對于cbcvd，一步法rt-pcr擴增cbcvd前還需進行高溫解鏈處理，解鏈具體反應(yīng)體系及解鏈條件如下：

cbcvd解鏈反應(yīng)體系：

cbcvd解鏈反應(yīng)條件：94℃解鏈5min,冰上冷卻2min。

接下來進行一步法rt-pcr擴增cbcvd，具體反應(yīng)體系及擴增條件如下：

cbcvd反應(yīng)體系：

cbcvd擴增條件：55℃反轉(zhuǎn)錄30min；94℃酶滅活3min；然后94℃/30s，58℃/30s，68℃/45min，35個循環(huán)；最后68℃延伸7min。取5ulpcr產(chǎn)物在1.5％瓊脂糖凝膠中電泳，經(jīng)eb染色后，使用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果(結(jié)果見圖1)。

實施例2cevd/cbcvd二聚體克隆載體的構(gòu)建及體外轉(zhuǎn)錄

將實施例1中經(jīng)一步法rt-pcr獲得的cevd/cbcvd二聚體純化后克隆進pgem-teasy載體獲得包含cevd/cbcvd二聚體的連接產(chǎn)物，其原理如圖2所示，t7啟動子位點和spei位點被用來合成cevd或cbcvd二聚體rna。轉(zhuǎn)化進感受態(tài)細胞大腸桿菌dh5α中進行擴增，菌液測序判定所需的cevd/cbcvd二聚體的優(yōu)勢序列及插入方向。提取質(zhì)粒，限制性內(nèi)切酶spei線性化質(zhì)粒后用乙醇進行純化處理。二聚體純化、克隆、轉(zhuǎn)化感受態(tài)、質(zhì)粒線性化等步驟按照相關(guān)試劑的操作說明操作即可。

spei線性化質(zhì)粒后用乙醇進行純化處理方法：

首先將得到的混合液用滅菌雙蒸水補足100ul,后進行如下處理：

混勻后-20℃冷卻20min,高速(推薦13000r)離心15min,倒掉上清液，高速(推薦13000r)2min,除去殘留液體，加適量雙蒸滅菌水(推薦15ul)。

這些純化后的包含cevd/cbcvd二聚體優(yōu)勢序列的線性化質(zhì)粒將用來作為模板進行體外轉(zhuǎn)錄，使用t7rna聚合酶(megascriptt7transcriptionkit,invitrogen^tm)獲得具有侵染活性的cevd/cbcvd二聚體rna。

實施例3體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物活性驗證

將經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄獲得的cevd/cbcvd二聚體rna用稀釋液(100mmtris-hcl,10mmedta,ph7.5)稀釋到500ng/ul,將cevd和cbcvd體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物刀割接種木本指示植物香櫞和將cevd體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物摩擦接種草本寄主番茄，四個月后觀察被侵染香櫞癥狀(結(jié)果見圖3)和rt-pcr檢測(結(jié)果見圖4)，并提取草本寄主番茄的葉片總rna運用地高辛標記探針法進行northernblot實驗進一步驗證cevd表達活性(結(jié)果見圖5)。

結(jié)果表明，cevd接毒香櫞表現(xiàn)出典型的cevd侵染癥狀，cevd接毒番茄northern雜交信號明顯，rt-pcr檢測結(jié)果呈陽性，說明構(gòu)建的cevd侵染性克隆體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物能夠完成系統(tǒng)侵染木本寄主香櫞和草本寄主番茄；同時，cbcvd接毒香櫞表現(xiàn)出典型的cbcvd侵染癥狀，rt-pcr檢測結(jié)果呈陽性，說明構(gòu)建的cbcvd侵染性克隆體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物也能夠完成系統(tǒng)侵染木本寄主香櫞。綜上指示植物驗證及分子生物學檢測結(jié)果足以證明此種類病毒侵染性克隆構(gòu)建新方法切實可行。

序列表

<110>西南大學

<120>柑橘類病毒cdna二聚體及其侵染性克隆的快速制備新方法

<160>4

<210>1

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<223>cevd-for

<400>1

ggaaacctggaggaagtcgag21

<210>2

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<223>cevd-rev

<400>2

ccggggatccctgaaggactt21

<210>3

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<223>cbcvd-for

<400>3

ggggaaatctcttcagac18

<210>4

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<223>cbcvd-rev

<400>4

ggggatccctcttcaggt18