一種提高拜氏梭菌阿魏酸抗逆性的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種提高拜氏梭菌阿魏酸抗逆性的方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著石油能源的枯竭，生物丁醇作為第二代能源成為研宄熱點。傳統(tǒng)的丙酮-丁 醇-乙醇發(fā)酵（ABE發(fā)酵）底物原料直接采用葡萄糖、木糖等，消耗成本高。利用廉價的廢 棄可再生的木質(zhì)纖維素原料（玉米芯、甘蔗渣、秸桿等），通過微生物發(fā)酵法生產(chǎn)丁醇的成 為研宄重點之一。然而木質(zhì)纖維素原料在預(yù)處理成為微生物可利用的糖的同時也降解出大 量的有機酸、糠醛、5-羥甲基糠醛、酚類化合物等抑制物，然而在去除該抑制物的工藝上，成 本消耗高，因此，提高微生物自身的抗逆性尤其重要。
[0003]目前，生物丁醇的抗逆性研宄主要集中在拜氏梭菌利用木質(zhì)纖維素水解液方面， 其酚類化合物的毒害作用尤為顯著。高濃度酚類物質(zhì)能夠改變細(xì)胞膜疏水性，破壞細(xì)胞 膜，導(dǎo)致菌體死亡。Thaddeus Ezeji 等（Biotechnol.Bioeng.2007,97, 1460-1469.)報 道拜氏梭菌突變株BAlOl在2g/L阿魏酸脅迫下完全不生長；此外，Thaddeus Ezeji等 (Bioresource Technol. 2008, 99:5915-5922)利用 BAlOl，以 XAD-4 樹脂脫毒的玉米芯稀 硫酸水解和酶解液為發(fā)酵底物，得到總?cè)軇┊a(chǎn)量為9. 3g/L ;然而，BAlOl在未脫毒的稀酸 水解液中幾乎不產(chǎn)丁醇。郭亭等（J and Microbiol Biotechnol. ,2012, 39 (3) ,401-407) 研宄發(fā)現(xiàn)，當(dāng)玉米芯和甘蔗渣水解液中的酚類化合物的濃度提升到〇. 5g/L時，拜氏梭 菌（Clostridium beijerinckii)8052 基本不生長。Richmond 等發(fā)現(xiàn)丁香酸抑制 CoAT 的表達(dá)，阻斷了乙酸和丁酸的轉(zhuǎn)化，而導(dǎo)致溶劑量的降低。Tomas等（Appl Environ Microbiol, 2003, 69 (8) :4951-4965)在丙酮丁醇梭菌中過表達(dá)編碼熱激蛋白groESL基因， 使丁醇對菌體細(xì)胞的抑制作用降低了 85%，并最終使產(chǎn)物濃度提高了 33%。模式酚類化合 物對菌體的抑制具體機制尚未明確，然而通過基因工程手段獲的重組菌來提高產(chǎn)溶劑菌的 抗逆性，提高丁醇得率問題將得到重視。
[0004] 由此可見，提高拜氏梭菌對廉價的木質(zhì)纖維素原料水解液中酚類化合物等毒素的 抗逆性，將是木質(zhì)纖維素原料生產(chǎn)丁醇產(chǎn)業(yè)化必須解決的關(guān)鍵問題之一。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題是，提供一種提高拜氏梭菌阿魏酸抗逆性的方法。
[0006] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0007] -種提高拜氏梭菌阿魏酸抗逆性的方法，該方法是將拜氏梭菌中編碼依賴于 NADPH的FMN還原酶基因失活，使該基因在拜氏梭菌中不能正常表達(dá)。
[0008] 其中，所述的拜氏梭菌為拜氏梭菌NCMB 8052,所述的編碼依賴于NADPH的FMN還 原酶基因為Cbei_4693,其核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示。
[0009] 其中，所述將拜氏梭菌中編碼依賴于NADPH的FMN還原酶基因失活，是通過二型內(nèi) 含子基因敲除技術(shù)使編碼依賴于NADPH的FMN還原酶基因失活。
[0010] 其中，所述的通過二型內(nèi)含子基因敲除技術(shù)使編碼依賴于NADPH的FMN還原酶基 因失活，包括如下步驟：
[0011] (1)利用軟件分析SEQ ID No :1所示的序列，得到內(nèi)含子的核苷酸序列和基因的 插入位點；
[0012] (2)將得到的內(nèi)含子序列構(gòu)建到二型內(nèi)含子基因敲除質(zhì)粒中，得到重組質(zhì)粒；
[0013] (3)將步驟⑵得到的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化拜氏梭菌，篩選得到編碼依賴于NADPH的FMN 還原酶基因失活的菌株。
[0014] 步驟（1)中，所述內(nèi)含子的核苷酸序列如SEQ ID No :2所示，所述基因的插入位點 為SEQ ID No :1中第335bp和第336bp之間。
[0015] 步驟⑵中，所述二型內(nèi)含子基因敲除質(zhì)粒為pWJ質(zhì)粒，該質(zhì)粒的核苷酸序列如 SEQ ID No : 5 所示。
[0016] 上述提高拜氏梭菌阿魏酸抗逆性的方法構(gòu)建得到的拜氏梭菌在本發(fā)明的保護(hù)范 圍之內(nèi)。
[0017] 上述拜氏梭菌在發(fā)酵制備丁醇中的應(yīng)用也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。：
[0018] 本發(fā)明的高抗逆拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii)重組菌，對阿魏酸具有較 強抗逆性，能夠在含有該酚類化合物的發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵生產(chǎn)丁醇。（阿魏酸是酚類物質(zhì)比 較有代表性的一種化合物，
[0019] 其中，所述的發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的方法包含如下步驟：
[0020] 1)平板培養(yǎng)：將本發(fā)明的高抗阿魏酸重組拜氏梭菌接種至平板培養(yǎng)基厭氧培養(yǎng)， 培養(yǎng)溫度37°c，培養(yǎng)時間12~18h ;
[0021] 2)種子培養(yǎng)：將平板培養(yǎng)的高抗阿魏酸重組拜氏梭菌接種到種子培養(yǎng)基中， IOOmL厭氧瓶裝液量50mL，充N23min，培養(yǎng)溫度37°C，培養(yǎng)時間12~18h ;
[0022] 3)發(fā)酵產(chǎn)丁醇：將種子培養(yǎng)液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量10(v/v) %，充 N23min，發(fā)酵溫度37°C，發(fā)酵培養(yǎng)時間為60~72h。
[0023] 所述的平板培養(yǎng)基包含如下質(zhì)量百分?jǐn)?shù)的組分：碳源0.3%~1%、氮源0.5%~ 1%、無機鹽0.5%~0.8%、瓊脂1.5%~2%、其余為水；其中，所述碳源為淀粉或葡萄糖； 所述氮源為有機或無機含氮化合物，其中無機含氮化合物為乙酸銨、氯化銨中的一種或多 種，有機含氮化合物為蛋白胨、酵母粉和玉米漿中的一種或多種；無機鹽為鈉鹽、鉀鹽、鎂 鹽、磷酸鹽、亞鐵鹽中的一種或多種，固體培養(yǎng)基中添加瓊脂。平板培養(yǎng)基優(yōu)選為：酵母粉 3g/L，蛋白胨5g/L，可溶性淀粉10g/L，乙酸按2g/L，氯化鈉3g/L，七水合硫酸鎂3g/L，磷酸 二氫鉀lg/L，磷酸氫二鉀lg/L，七水合硫酸亞鐵0. lg/L，瓊脂15g/L，其余為水，pH 6。
[0024] 所述的種子培養(yǎng)基包含如下質(zhì)量百分?jǐn)?shù)的組分：碳源0. 5%~1%、氮源0. 5%~ 1%、無機鹽0. 5%~0. 8%、其余為水；所述的碳源為淀粉或葡萄糖；所述氮源為有機或無 機含氮化合物，其中無機含氮化合物為乙酸銨和氯化銨中的一種或兩種的混合，有機含氮 化合物為蛋白胨、酵母粉和玉米漿中的一種或幾種的混合；所述的無機鹽為鉀鹽、鎂鹽、鈣 鹽、磷酸鹽、亞鐵鹽中的一種或多種。種子培養(yǎng)基優(yōu)選為：酵母粉3g/L，蛋白胨5g/L，可溶性 淀粉l〇g/L，乙酸銨2g/L，氯化鈉3g/L，七水合硫酸鎂3g/L，磷酸二氫鉀lg/L，磷酸氫二鉀 lg/L，七水合硫酸亞鐵0. lg/L，其余為水，pH 6。
[0025] 所述的發(fā)酵培養(yǎng)基包含如下質(zhì)量百分?jǐn)?shù)的組分：碳源3%~6%、氮源0.1 %~ 0. 3%、無機鹽0. 1 %~0. 2%、生長因子0. 05%~0. 1 %、阿魏酸0. 05%、其余為水；所述的 碳源為葡萄糖；所述的氮源為乙酸銨、氯化銨和酵母粉中的一種或多種；所述的無機鹽為 鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、鈣鹽、磷酸鹽、亞鐵鹽中的一種或多種；所述生長因子為對氨基苯甲酸、維 生素 B1、生物素和玉米漿中的一種或幾種的混合。發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)選為：葡萄糖30g/L，乙酸 按2. 2g/L，磷酸二氫鉀0. 5g/L，磷酸氫二鉀0. 5g/L，氯化鈉0. 01g/L，七水合硫酸鎂0. 2g/L， 七水合硫酸亞鐵〇. 〇lg/L，一水合硫酸猛0. 01g/L，玉米衆(zhòng)0. l(v/v) %，阿魏酸0. 5g/L，其余 為水，pH 6. 6。
[0026] 有益效果：
[0027] (1)本發(fā)明將拜氏梭菌中編碼依賴于NADPH的FMN還原酶基因 Cbei_4693進(jìn)行插 入失活后，使得此基因不能正常表達(dá)，獲得Cbei_4693基因插入失活的重組菌株。
[0028] (2)本發(fā)明提供了一種簡單、高效的提高拜氏梭菌抗逆性的方法，借助此方法得到 的重組菌株對阿魏酸具有較高抗逆性，當(dāng)以葡萄糖為碳源，在100mL厭氧瓶中含有阿魏酸 的發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)時，丁醇產(chǎn)量達(dá)到5. 6g/L，而同等條件培養(yǎng)的出發(fā)菌株基本不產(chǎn)醇。
[0029] (3)利用本發(fā)明方法構(gòu)建的重組菌株，其阿魏酸抗逆性強、丁醇產(chǎn)量高。
【附圖說明】
[0030] 圖1為本發(fā)明二型內(nèi)含子基因敲除質(zhì)粒PWJ的質(zhì)粒圖譜。
[0031] 圖2為本發(fā)明使用二型內(nèi)含子插入失活的機理圖。
[0032] 圖3為轉(zhuǎn)化子菌落PCR電泳圖。
[0033] 圖4為重組菌和出發(fā)菌株對阿魏酸的抗逆性考察。
【具體實施方式】
[0034] 根據(jù)下述實施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實 施例所描述的內(nèi)容僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會限制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本 發(fā)明。
[0035] 實施例1 :拜氏梭菌Cbei_4693基因失活突變株的構(gòu)建方法。
[0036] 1.設(shè)計內(nèi)含子：
[0037] 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫收錄的拜氏梭菌的Cbei_4693基因序列（如SEQ ID No :1所示）， 借助軟件設(shè)計合適的插入基因位點(http://www. clost:ron. com),選擇插入在第335-336 個堿基之間，并生成內(nèi)含子序列，合成內(nèi)含子序列S-335其序列如SEQ ID NO :2所示。
[0038] 2. Cbei_4693插入失活載體的構(gòu)建：
[0039] 用Xho I和BsrG I分別雙酶切載體pWJ (上海生科院楊晟老師提供，其序列如SEQ ID NO :5所示）和DNA片段S-335。酶切產(chǎn)物經(jīng)純化試劑盒（Takara)純化后，通過T4連接 酶（Takara)過夜連接。將連接的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌E. coli DH5a (本實驗室），涂布 到含有50ug/ml氨芐霉素抗性LB平板，37°C培養(yǎng)12-16h，挑取轉(zhuǎn)化子，接到液體含有50ug/ ml氨芐霉素 LB培養(yǎng)基中，37°C、200rpm培養(yǎng)12h，提取重組質(zhì)粒（AXYGEN質(zhì)粒提取試劑