一株高產(chǎn)阿魏酸酯酶的枝狀枝孢菌及在食醋釀造中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一株高產(chǎn)阿魏酸酯酶的枝狀枝孢菌及在食醋釀造中的應(yīng)用，屬于發(fā)酵 工程與生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 阿魏酸酯酶（FEA，EC3. 1. 1. 73)是羧酸酯水解酶的一個亞類，主要生物功能是水 解植物細(xì)胞壁多糖與阿魏酸（FA)連結(jié)的酯鍵，從而將阿魏酸及其它苯丙烯酸釋放出來。目 前，報道的產(chǎn)阿魏酸酯酶的菌株約有30株，其中主要包括黑曲霉、米曲霉、土曲霉、黃曲霉、 黃柄曲霉、泡盛曲霉、塔賓曲霉、構(gòu)巢曲霉、宇佐美曲霉、根霉、青霉、嗜熱側(cè)孢霉、尖孢鐮刀 菌、層出鐮刀菌、粗糙脈孢菌、米黑根毛霉、柄籃狀菌、變綠紅菇、杏鮑菇、出芽短梗霉、厭氧 真菌、新美麗絲菌等，但是這些菌株產(chǎn)阿魏酸酯酶的活力普遍較低，不足以滿足工業(yè)應(yīng)用。 也有通過基因改造手段來提高微生物產(chǎn)阿魏酸酯酶能力的相關(guān)研究，但是目前構(gòu)建的工程 菌株產(chǎn)量都不是很高，仍達(dá)不到工業(yè)化生產(chǎn)要求。因此探索酶活高、安全的野生型阿魏酸酯 酶產(chǎn)生菌顯得很有必要，具有極大的研究和開發(fā)價值。
[0003] 阿魏酸因?yàn)榫哂卸喾N生理活性功能近幾年來一直成為人們研究的熱點(diǎn)。目前已報 道，阿魏酸對過氧化氫、超氧自由基、羥自由基、過氧化亞硝基都有強(qiáng)烈的碎滅作用。阿魏酸 可通過對內(nèi)皮素（Endothelin，ET)的作用，起到降低血壓的功效。阿魏酸對感冒病毒、呼吸 道合胞體病毒和艾滋病病毒都有顯著抑制作。阿魏酸能降低心肌缺血的耗氧量，在臨床上 已用于治療冠心病、心絞痛。近年來，有關(guān)阿魏酸及其衍生物抑制結(jié)腸癌、直腸癌和舌癌的 報道在不斷增加。而且發(fā)現(xiàn)阿魏酸在護(hù)肝、治療糖尿病方面有顯著效果。
[0004]目前，國外有關(guān)阿魏酸的功能性食品的報道在逐漸增多，本發(fā)明旨在利用微生物 資源將生物廢棄資源通過發(fā)酵工程技術(shù)轉(zhuǎn)化為可利用物質(zhì)添加到食醋發(fā)酵體系中，制得一 種富含阿魏酸的功能性保健食醋，加大保健醋的開發(fā)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是：針對目前微生物阿魏酸酯酶活性較低，無法實(shí)現(xiàn) 工業(yè)化應(yīng)用的問題，提供一株新的高產(chǎn)阿魏酸酯酶的枝狀枝孢菌，其可利用小麥麩皮發(fā)酵 產(chǎn)生阿魏酸酯酶，首次添加到食醋發(fā)酵過程中，所制得富含阿魏酸的食醋具有抗氧化、降血 壓、抗血栓、降血脂、抗菌消炎、預(yù)防癌癥、護(hù)肝、治療糖尿病等功效。
[0006] 本發(fā)明的第一個目的是提供一株新的高產(chǎn)阿魏酸酯酶的枝狀枝孢菌，來源于浙江 塔牌紹興酒有限公司黃酒麥曲，經(jīng)過篩選，分離純化得到的。該枝狀枝孢菌（Cladosporium cladosporioides)，由中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，簡稱CCTCC，保藏編號為CCTCC NO:M2015549，保藏日期2015年9月16號，保藏地址為中國武漢武漢大學(xué)。
[0007] 本發(fā)明所得枝狀枝孢菌的平板觀察特征如下：在PDA固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)72h，菌株 菌落厚，呈厚絨毛狀，與培養(yǎng)基結(jié)合緊密，不易挑起。顏色初為煙褐色至綠褐色，后期為黑褐 色至黑色。菌落背面黑色。
[0008]所述枝狀枝抱菌的rDNAITS1-5. 8S-ITS2序列與Cladosporiumcladosporioides strainFR5-SAR1 同一性達(dá)到 100%。
[0009] 本發(fā)明的第二個目的是提供所述枝孢霉在生產(chǎn)阿魏酸酯酶方面的應(yīng)用。
[0010] 所述生產(chǎn)阿魏酸酯酶是以麥麩作為培養(yǎng)基的主要成分。
[0011] 所述應(yīng)用是將枝狀枝孢菌種子液按照3~8%的接種量接種于麥麩液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng) 基中進(jìn)行培養(yǎng)，麥麩加量〇. 5~6 % (其余為水），培養(yǎng)溫度32~35 °C，培養(yǎng)時間48~120h， 通氧量 0· 5 ~2vvm，轉(zhuǎn)速 100 ~150r/min，ρΗ4· 8 ~6. 5。
[0012] 所述麥麩液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中還可以含有NaCl0. 3g/L，（NH4) 2S041. 3g/L， MgS04 · 7Η200· 3g/L，Κ2ΗΡ040 · 3g/L。
[0013] 本發(fā)明的第三個目的是提供所述枝狀枝孢菌在食醋釀造方面的應(yīng)用。
[0014] 所述應(yīng)用是在麥麩液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中接種枝狀枝孢菌，進(jìn)行液體發(fā)酵得發(fā)酵料 液；然后將發(fā)酵料液按照占原料糯米質(zhì)量10~40%的量加入到食醋釀造落缸工段，同時在 醋酸發(fā)酵工段多次流加占原料大米質(zhì)量3~12%的發(fā)酵料液。
[0015] 所述應(yīng)用是在醋酸發(fā)酵的第72h、96h、120h各流加一次發(fā)酵料液。
[0016] 所述食醋釀造包括浸米、蒸飯、淋飯、落缸、糖化、酒精發(fā)酵、醋酸發(fā)酵、淋醋、殺菌 工段。
[0017] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：
[0018] 1.本發(fā)明提供了一種新的枝狀枝孢菌（Cladosporiumcladosporioides)，所述菌 株具有高產(chǎn)阿魏酸酯酶的能力，極大的補(bǔ)充了提取束縛型阿魏酸菌的資料庫；所述枝狀枝 孢菌已經(jīng)從生物界中分離純化出來，并且易于培養(yǎng)保存，繁殖迅速，生長能力強(qiáng)；
[0019] 2.本發(fā)明枝狀枝孢菌發(fā)酵產(chǎn)阿魏酸酯酶的酶活可達(dá)到308U/L，可以作為從植物 中提取束縛型酚酸的新型野生菌；
[0020] 3.本發(fā)明創(chuàng)造性地將枝狀枝孢菌麥麩發(fā)酵料液首次應(yīng)用到食醋生產(chǎn)中，綜合利用 了小麥加工過程中的副產(chǎn)物一麩皮，實(shí)現(xiàn)了開發(fā)高品質(zhì)食醋和節(jié)能減排的雙重效益；枝孢 霉麥麩發(fā)酵料液的使用，在保證原有食醋風(fēng)味口感的前提下，具有顯著提升阿魏酸含量的 效果。
[0021] 4.按本發(fā)明的生產(chǎn)方法得到的食醋，最終測定食醋中阿魏酸含量達(dá)到45~ 80ppm，色澤明亮，酒精度低，口感清爽獨(dú)特，并具有一定的保健功能。
[0022] 生物保藏信息
[0023] 枝狀枝孢菌，分類學(xué)命名為枝狀枝孢菌S2CladosporiumcladosporioidesS2,于 2015年9月16日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址為中國武漢武漢大學(xué)，保藏編 號為CCTCCΝ0:Μ2015549。
【附圖說明】
[0024]圖1:枝狀枝孢菌在初篩培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)；
[0025] 圖2 :枝狀枝孢菌PDA分離純化后的菌落形態(tài)；
[0026] 圖3:HPLC測定枝狀枝孢菌發(fā)酵液的色譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0027] 培養(yǎng)基配方：
[0028] 初篩培養(yǎng)基：NaCl0· 3g，（NH4)2S041. 3g，MgS04 · 7H20 0· 3g，Κ2ΗΡ040· 3g，瓊脂粉 18g，15ml阿魏酸乙酯（溶于10%V/V二甲基甲酰胺），蒸餾水1000ml，pH自然，121°C滅菌 20min〇
[0029] 純化培養(yǎng)基：馬鈴薯瓊脂固體培養(yǎng)基（PDA固體培養(yǎng)基），馬鈴薯200g，蔗糖20g， 瓊脂18g，蒸餾水1000ml，pH自然，121°C滅菌20min。
[0030] 種子培養(yǎng)基：液體PDA培養(yǎng)基，不加瓊脂，pH自然，121°C滅菌20min。
[0031] 復(fù)篩培養(yǎng)基：NaCl0· 3g，（NH4)2S041. 3g，MgS04 ·7Η20 0· 3g，K2HP040 . 3g，蒸餾水 1L， pH6. 5。在250mL三角瓶中稱取lOg麥麩，再加入lOOmL液體部分，于121°C滅菌20min，得 復(fù)篩培養(yǎng)基。將培養(yǎng)24h的種子液按體積比為4 %的接種量接種到100mL復(fù)篩培養(yǎng)基中，于 30°C，200r/min下培養(yǎng)一定時間。
[0032] 實(shí)施例1 :枝孢霉菌株的篩選
[0033] 枝狀枝孢菌的初篩，通過以阿魏酸乙酯為唯一碳源，產(chǎn)生透明圈現(xiàn)象篩選出具備 產(chǎn)阿魏酸酯酶能力的菌株。
[0034] 從浙江塔牌紹興酒有限公司采取食醋麥曲樣品，取麥曲10g，放置在含90ml無菌 蒸餾水與玻璃珠的250mL三角瓶中，封口，在振蕩儀上200r/min振搖30m