流體裝置的新用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 各實施方案總體上涉及流體裝置，具體涉及此類流體裝置用于測定微生物對測檢 物的響應(yīng)的用途。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 抗生素抗性細(xì)菌日漸成為全球性問題，因為抗生素?zé)o法殺滅這些細(xì)菌或使其停止 分裂。細(xì)菌的傳代時間在許多情況下可非常快（大約20分鐘），并且由于細(xì)菌的短傳代時 間和相對的遺傳不穩(wěn)定性，細(xì)菌可快速獲得對抗生素的抗性?？股乜剐约?xì)菌感染的患病 率在日益增加，這些細(xì)菌中的一些已經(jīng)變得具有多重抗性，這有時意味著沒有可用于終止 這些細(xì)菌生長的有效抗生素。這些多重抗性細(xì)菌是嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題，因為感染此類細(xì) 菌的患者可由于其細(xì)菌感染無法被治療而死亡。
[0004] 用于鑒定和研究微生物（包括但不限于細(xì)菌、真菌、寄生生物和病毒）及其對殺滅 微生物或抑制微生物生長的抗生素的抗性的傳統(tǒng)方法在細(xì)菌實例中主要受限于Luria肉 湯（LB)瓊脂平板。這些LB瓊脂平板于是被制成包含限定濃度的殺菌和抑菌抗生素。針對 抗生素易感性測試（AST)和抗生素或其他測檢物對微生物的效應(yīng)評價的此類二維（2D)培 養(yǎng)法具有若干限制。例如，這些設(shè)置通常需要將微生物如細(xì)菌過夜培養(yǎng)以允許清楚的結(jié)果 讀出，該結(jié)果讀出顯示特定的細(xì)菌菌株對給定的抗生素是否具有抗性。此外，通常每個LB 瓊脂平板僅可測試單一抗生素濃度。
[0005] 另一種現(xiàn)有技術(shù)AST方法采用所謂的E試驗。E試驗基本上為瓊脂擴(kuò)散法并使用 浸漬有不同濃度的測檢物的矩形條，所述測檢物作為抗生素的效應(yīng)有待評價。在典型的方 法中，在將E試驗條置于瓊脂平板的情況下，細(xì)菌在2D培養(yǎng)中在瓊脂平板的頂部散布和生 長。E試驗條通過擴(kuò)散來釋放測檢物，并且在孵育24小時后檢測釋放的測檢物的生長抑制 效應(yīng)。除了很長的孵育時間之外，此方法的局限是僅可在數(shù)字步階不同并且E試驗條中使 用選定濃度的情況下讀出測檢物的抑制濃度。
[0006] 另一傳統(tǒng)的AST方法使用微量滴定板測定，其中不同的孔內(nèi)具有不同濃度的測檢 物。通常將添加有細(xì)菌的微量滴定板孵育過夜，并且通過測量不同孔中的光學(xué)濁度來評價 對細(xì)菌的抑制效應(yīng)。此方法的缺點與使用E試驗條時的缺點基本上相同。
[0007] 為了縮短AST時間，已開發(fā)出用于快速AST (RAST)的微流體通道系統(tǒng)。此類RAST 方法包括液滴式微流體通道系統(tǒng)，在該液滴式微流體通道系統(tǒng)中，細(xì)菌被捕獲在包含抗生 素的液滴中[1-3]。液滴式系統(tǒng)的局限是僅可測試單一抗生素濃度。其他RAST方法包括使 用氣體可滲透聚二甲基硅氧烷（PDMS)微通道[4];將細(xì)菌介電電泳捕獲在微流體電極結(jié)構(gòu) 中[5-6];含有抗生素的預(yù)載PDMS層[7];使細(xì)菌共價結(jié)合到微流體通道并使它們經(jīng)受機(jī) 械剪切應(yīng)力[8];使用異步磁珠旋轉(zhuǎn)（AMBR)生物傳感器[9]或跟蹤微流體瓊脂糖通道系統(tǒng) 內(nèi)的單細(xì)胞生長[10]，這些各種RAST方法的主要局限是它們僅可測試單一抗生素濃度或 一組少量的選定抗生素濃度。
[0008] 還進(jìn)一步提議使用用于分析細(xì)菌生物膜抗生素易感性的微流體系統(tǒng)[11]，然而其 微流體系統(tǒng)需要24小時的孵育并且待測試細(xì)菌含有能夠表達(dá)綠熒光蛋白（GFP)的質(zhì)粒。
[0009] 因此，仍然需要不具有現(xiàn)有技術(shù)缺點的響應(yīng)微生物檢驗的快速方法和系統(tǒng)。
[0010] 發(fā)明概述
[0011] 總體目標(biāo)是允許有效快速地測定微生物對測檢物的響應(yīng)。
[0012] 此目標(biāo)和其他目標(biāo)通過本文所定義的實施方案來滿足。
[0013] 實施方案的一個方面涉及一種測定微生物對測檢物的響應(yīng)的方法。所述方法包括 在三維（3D)培養(yǎng)基質(zhì)中提供微生物的培養(yǎng)物，所述三維培養(yǎng)基質(zhì)布置在流體裝置的培養(yǎng) 室中，所述流體裝置具有側(cè)接所述培養(yǎng)室的第一末端部分的第一流體通道和側(cè)接所述培養(yǎng) 室的第二不同末端部分的第二流體通道。所述方法還包括將第一流體通道的輸入連接至包 含第一濃度的測檢物的第一流體流。所述方法還包括將第二流體通道的輸入連接至不含測 檢物或包含第二濃度的測檢物的第二流體流，所述第二濃度低于所述第一濃度，從而在3D 培養(yǎng)基質(zhì)的至少一部分上形成測檢物的濃度梯度。所述方法另外包括基于3D培養(yǎng)基質(zhì)中 的任意邊界區(qū)相對于第一末端部分和/或第二不同末端部分的位置來測定微生物對測檢 物的響應(yīng)。所述邊界區(qū)在微生物顯示出對測檢物的第一響應(yīng)的第一響應(yīng)區(qū)與微生物顯示出 對測檢物的第二不同響應(yīng)的第二響應(yīng)區(qū)之間。
[0014] 實施方案的另一方面涉及一種用于測定微生物對測檢物的響應(yīng)的系統(tǒng)。所述系統(tǒng) 包括流體裝置，所述流體裝置包括培養(yǎng)室，所述培養(yǎng)室被構(gòu)造成將微生物的培養(yǎng)物容納在 3D培養(yǎng)基質(zhì)中。所述流體裝置還包括側(cè)接所述培養(yǎng)室的第一末端部分的第一流體通道和 側(cè)接所述培養(yǎng)室的第二不同末端部分的第二流體通道。所述系統(tǒng)還包括第一流體貯存器， 所述第一流體貯存器包含第一流體，所述第一流體包含第一濃度的測檢物。所述第一流體 貯存器被構(gòu)造成連接至所述第一流體通道的輸入。所述系統(tǒng)還包括第二流體貯存器，所述 第二流體貯存器包含第二流體，所述第二流體不含測檢物或包含低于第一濃度的第二濃度 的測檢物。所述第二流體貯存器被構(gòu)造成連接至所述第二流體通道的輸入以在3D培養(yǎng)基 質(zhì)的至少一部分上形成測檢物的濃度梯度。所述系統(tǒng)另外包括基于計算機(jī)的系統(tǒng)，所述基 于計算機(jī)的系統(tǒng)被配置成獲取3D培養(yǎng)基質(zhì)的至少一個圖像并對所述至少一個圖像進(jìn)行處 理以鑒定3D培養(yǎng)基質(zhì)中的任意邊界區(qū)相對于第一末端部分和/或第二不同末端部分的位 置。所述邊界區(qū)在微生物顯示出對測檢物的第一響應(yīng)的第一響應(yīng)區(qū)與微生物顯示出對測檢 物的第二不同響應(yīng)的第二響應(yīng)區(qū)之間。所述基于計算機(jī)的系統(tǒng)還被配置成基于邊界區(qū)的位 置來測定微生物對測檢物的響應(yīng)。
[0015] 實施方案的另一方面涉及流體裝置用于測定微生物對測檢物的響應(yīng)的用途。所述 流體裝置包括培養(yǎng)室，所述培養(yǎng)室被構(gòu)造成將微生物的培養(yǎng)物容納在3D培養(yǎng)基質(zhì)中。所述 流體裝置還包括第一流體通道，所述第一流體通道側(cè)接所述培養(yǎng)室的第一末端部分并且被 構(gòu)造成運載包含第一濃度的測檢物的第一流體流。所述流體裝置還包括第二流體通道，所 述第二流體通道側(cè)接所述培養(yǎng)室的第二不同末端部分并且被構(gòu)造成運載不含測檢物或包 含第二濃度的測檢物的第二流體流，所述第二濃度低于所述第一濃度，從而在3D培養(yǎng)基質(zhì) 的至少一部分上形成測檢物的濃度梯度。所述用途包括基于3D培養(yǎng)基質(zhì)中的任意邊界區(qū) 相對于第一末端部分和/或第二不同末端部分的位置來測定微生物對測檢物的響應(yīng)。所述 邊界區(qū)在微生物顯示出對測檢物的第一響應(yīng)的第一響應(yīng)區(qū)與微生物顯示出對測檢物的第 二不同響應(yīng)的第二響應(yīng)區(qū)之間。
[0016] 實施方案的各方面允許快速有效地測定微生物對各種測檢物的響應(yīng)?？筛鶕?jù)實施 方案測試微生物對連續(xù)范圍的濃度的響應(yīng)。
【附圖說明】
[0017] 結(jié)合以下描述和附圖可最佳地理解各實施方案以及其另外的目的和優(yōu)點，在附圖 中：
[0018] 圖1為示出根據(jù)一個實施方案測定微生物對測檢物的響應(yīng)的方法的流程圖；
[0019] 圖2為示出圖1中的連接步驟的一個實施方案的流程圖；
[0020] 圖3為示出根據(jù)一個實施方案的圖1中的方法的附加任選步驟的流程圖；
[0021] 圖4為示出根據(jù)一個實施方案的圖1中的方法的附加任選步驟的流程圖；
[0022] 圖5為示出根據(jù)一個實施方案的圖1中的方法的附加任選步驟的流程圖；
[0023] 圖6為示出根據(jù)一個實施方案的圖3中的方法的附加任選步驟的流程圖；
[0024] 圖7為示出圖6中的測定MIC步驟的一個實施方案的流程圖；
[0025] 圖8為根據(jù)一個實施方案的微流體裝置和含有微生物的3D培養(yǎng)基質(zhì)的示意性概 覽圖；
[0026] 圖9為根據(jù)一個實施方案的微流體裝置的培養(yǎng)室和流體通道的示意圖；
[0027] 圖10為根據(jù)另一個實施方案的微流體裝置的培養(yǎng)室和流體通道的示意圖；
[0028] 圖11為根據(jù)另一個實施方案的微流體裝置的培養(yǎng)室和流體通道的示意圖；
[0029] 圖12為根據(jù)另一個實施方案的微流體裝置的培養(yǎng)室和流體通道的示意圖；
[0030] 圖13為根據(jù)另一個實施方案的微流體裝置的培養(yǎng)室和流體通道的示意圖；
[0031] 圖14為根據(jù)另一個實施方案的微流體裝置的培養(yǎng)室和流體通道的示意圖；
[0032] 圖15為根據(jù)另一個實施方案的微流體裝置的培養(yǎng)室和流體通道的示意圖；
[0033] 圖16示意性地示出根據(jù)一個實施方案的用于測定微生物對測檢物的響應(yīng)的系統(tǒng) 以及示出3D培養(yǎng)基質(zhì)中濃度梯度形成的時間序列；
[0034] 圖17A示出在貫穿含有大腸桿菌（E. coli)K12 MG1655的3D培養(yǎng)基質(zhì)的氨芐青霉 素的線性梯度（從左到右為20-0 μ g/ml)形成后獲取的3D培養(yǎng)基質(zhì)的圖像（黑色框指示 用于強(qiáng)度測量的選定區(qū)域）；
[0035] 圖17B示出圖17A中的選定區(qū)域的強(qiáng)度分布曲線，其中5 μ g/ml的強(qiáng)度增加指示 大腸桿菌K12 MG1655對氨芐青霉素的最小抑制濃度；
[0036] 圖17C示意性地示出貫穿圖17A的3D培養(yǎng)基質(zhì)的氨芐青霉素的線性梯度 (20-0 μ g/ml)；
[0037] 圖18A示出在貫穿含有大腸桿菌K12 MG1655的3D基質(zhì)的壯觀霉素的線性梯度 (從左到右為50-0 μ g/ml)形成后獲取的3D培養(yǎng)基質(zhì)的圖像（黑色框指示用于強(qiáng)度測量的 選定區(qū)域）；
[0038] 圖18B示出圖18A中的選定區(qū)域的強(qiáng)度分布曲線；
[0039] 圖18C示意性地示出貫穿圖18A的3D培養(yǎng)基質(zhì)的壯觀霉素的線性梯度（從左到 右為 50-0 μ g/ml);
[0040] 圖19為暴露于各種濃度的壯觀霉素的大腸桿菌K12 MG1655隨時間推移的生長曲 線的圖；以及
[0041] 圖20示意性地示出在微流體裝置中用穩(wěn)定和連續(xù)梯度的抗微生物劑培養(yǎng)細(xì)胞的 結(jié)果。
[0042] 發(fā)明詳述
[0043] 在整個附圖中，相同的附圖標(biāo)號針對相似或?qū)?yīng)的元件使用。
[0044] 本發(fā)明的實施方案總體上涉及流體裝置，具體地涉及此類流體裝置在測定微生物 對測檢物的響應(yīng)中的用途。已得出的結(jié)論是諸如微流體裝置的流體裝置可被設(shè)計為特別適 合于監(jiān)測或測定微生物對各種測檢物的響應(yīng)。更詳細(xì)地講，此類流體裝置提供了快速測定 微生物對測檢物或?qū)嶋H上對多種測檢物的任意組合的響應(yīng)的有效工具，所述流體裝置具有 含有三維（3D)培養(yǎng)基質(zhì)的培養(yǎng)室，所述三維培養(yǎng)基質(zhì)包含相關(guān)微生物的培養(yǎng)物。
[0045] 此類流體裝置具有使其成為非常有效的工具的關(guān)鍵特征。首先，可在3D培養(yǎng)基質(zhì) 的至少一部分上快速準(zhǔn)確地確立相關(guān)測檢物的穩(wěn)態(tài)梯度。這意味著連續(xù)范圍的測檢物濃度 是從3D培養(yǎng)基質(zhì)的其中一個末端部分或側(cè)面的高濃度降至3D培養(yǎng)基質(zhì)的另一末端部分或 側(cè)面的低濃度或零濃度來確立。因此，可用單一流體裝置來測試測檢物的連續(xù)范圍的濃度。 這與其中可測試一種或少量預(yù)定濃度但不能測試任何連續(xù)范圍的濃度的現(xiàn)有技術(shù)形成鮮 明對比。因此，可對例如抗生素的最小抑制濃度進(jìn)行更精確的測定。
[0046] 其次，將微生物在3D培養(yǎng)基質(zhì)中進(jìn)行培養(yǎng)。因此，使得微生物以三維形式生長。這 繼而在3D培養(yǎng)基質(zhì)的存在活的和生長的微生物的區(qū)域與細(xì)胞死亡或低生長的區(qū)域之間提 供更佳顯著的差異。因此，實施方案提供了增強(qiáng)的信噪比。因此，與微生物以生物膜的形式 在二維（2D)表面（較少的微生物可在該二維表面上生長，因此產(chǎn)生較低的檢測信號）上生 長相比，更易于在3D培養(yǎng)基質(zhì)中的不同區(qū)域或區(qū)之間進(jìn)行區(qū)分。
[0047] 可在3D培養(yǎng)基質(zhì)的至少一部分上快速地確立測檢物的梯度。這連同微生物三維 生長的可能性允許在非常短的時間內(nèi)（通常在一小時或最多