甲基丙烯酰-CoA的制造方法
【專利說明】甲基丙烯酰-CoA的制造方法 技術(shù)領(lǐng)域 本發(fā)明涉及使用了酶催化劑的甲基丙烯酰-CoA的制造方法。 【背景技術(shù)】 甲基丙烯酸酯主要作為丙烯酸系樹脂的原料來使用。此外，作為其它的涂料、粘接劑、 樹脂改性劑等領(lǐng)域的共聚單體也有大量需求。作為工業(yè)制法，有若干方法，例如，已知以丙 酮和氰化氫作為原料的ACH(丙酮氰醇）法、以異丁烯、叔丁醇作為原料的直接氧化法。這 些化學制造方法依賴于化石原料，而且需要大量能量。 近年來，從防止地球變暖和環(huán)境保護的觀點考慮，作為成為以往的化石原料的替代品 的碳源，由生物質(zhì)制造各種化學制品的技術(shù)受到關(guān)注。也期待甲基丙烯酸和甲基丙烯酸酯 從生物質(zhì)原料制造。 例如提出了，利用天然存在的微生物，由糖等天然物生產(chǎn)成為甲基丙烯酸的前體的 2_羥基異丁酸和3-羥基異丁酸的方法（參照專利文獻1、2和非專利文獻1)。此外，提出了 使用導(dǎo)入了酶基因的天然不存在的重組微生物而由葡萄糖生成甲基丙烯酸的方法，但這些 方法是組合了已知的酶反應(yīng)以及由此類推的假想的酶反應(yīng)的方法，并未被證實（參照專利 文獻3~5)。這些公報中，關(guān)于3-羥基異丁酸或3-羥基異丁酰-CoA的酶脫水反應(yīng)，有能 夠利用催化類似反應(yīng)的酶的主題的記載。確實可以認為，由于位于丙酮/ 丁醇發(fā)酵途徑的 烯?；?CoA脫水酶催化脫水反應(yīng)，因此這些酶只要以上述化合物作為底物，則能夠利用。 另一方面，脂肪酸的β -氧化或支鏈氨基酸的分解途徑的烯?；鵆oA脫水酶為催化水合反 應(yīng)的酶，并不催化脫水反應(yīng)。 在非專利文獻2中示出，由聚-3-羥基丁酸酯產(chǎn)生菌精制后的烯?；?CoA脫水酶具有 3-羥基丁酰-CoA的脫水反應(yīng)及其逆反應(yīng)（水合反應(yīng)）的活性，但其它烯?；?CoA脫水酶 是否進行兩方向的反應(yīng)還不清楚。進一步，這些現(xiàn)有技術(shù)中，實際上并未報告是否能夠以 3_羥基異丁酰-CoA作為原料，合成甲基丙烯酰-CoA。如果考慮酶的多樣性、底物特異性， 則是否能夠用催化類似反應(yīng)的酶來制造與本來的底物結(jié)構(gòu)不同的甲基丙烯酰-CoA是不清 楚的。 另一方面，甲基丙烯酰-CoA作為纈氨酸分解途徑中的中間體是已知的。此外，被認為 具有細胞毒性，推定在生物體內(nèi)通過烯?；鵆oA脫水酶的作用，甲基丙烯酰-CoA迅速地被 水合，經(jīng)過3-羥基異丁酰-CoA，代謝成3-羥基異丁酸。 在非專利文獻3中示出，從甲基丙烯酰-CoA向3-羥基異丁酰-CoA的采用巴豆酸酶的 水合反應(yīng)的例子。雖然有本反應(yīng)與其它反應(yīng)（丙烯酰-CoA -羥基丙酰-CoA)相比，反應(yīng)以 低轉(zhuǎn)化率達到平衡的主旨的記載，但本反應(yīng)為原料使用了甲基丙烯酰-CoA的水合反應(yīng)的 情況，以3-羥基異丁酰-CoA作為原料實際上是否進行脫水反應(yīng)完全不清楚。進一步，在非 專利文獻4中記載了甲基丙烯酰-CoA自發(fā)地被水合。在甲基丙烯酰-CoA本身自發(fā)地被水 合那樣的水中的環(huán)境下，實際上是否能夠進行3-羥基異丁酰-CoA的脫水反應(yīng)，制造作為本 發(fā)明的目標物質(zhì)的甲基丙烯酰-CoA完全不清楚。 現(xiàn)有技術(shù)文獻 專利文獻 專利文獻1:國際公開第2007/110394號 專利文獻2:國際公開第2008/145737號 專利文獻3:國際公開第2009/135074號 專利文獻4:國際公開第2011/031897號 專利文獻5:國際公開第2012/135789號 非專利文獻 非專利文獻 I: Green Chemistry，2012,14,1942-1948 非專利文獻 2:Biochemistry，1969,8, 2748-2755 非專利文獻 3: Journal of Biological Chemistry，1994, 269,14248-14253 非專利文獻 4: Journal of Biological Chemistry，1957, 224,1-11
【發(fā)明內(nèi)容】
發(fā)明所要解決的課題 本發(fā)明的目的是提供采用酶催化劑的甲基丙烯酰-CoA的制造方法。 用于解決課題的手段 發(fā)現(xiàn)從3-羥基異丁酰-CoA通過具有脫水酶活性的酶的作用，能夠合成甲基丙烯 酰-CoA，從而完成了本發(fā)明。即，本發(fā)明如以下所述。 (1) 一種甲基丙烯酰-CoA的制造方法，在脫水酶的存在下，將3-羥基異丁酰-CoA向甲 基丙烯酰-CoA轉(zhuǎn)變。 (2) 根據(jù)（1)的制造方法，使用從3-羥基異丁酰-CoA向甲基丙烯酰-CoA的轉(zhuǎn)變率為 50%以上的脫水酶。 (3) 根據(jù)（1)或（2)的制造方法，在pH4~10的反應(yīng)條件下向甲基丙烯酰-CoA轉(zhuǎn)變。 (4) 根據(jù)⑴~（3)的任一項的制造方法，在溫度5~80°C的反應(yīng)條件下向甲基丙烯 酰-CoA轉(zhuǎn)變。 (5) 根據(jù)（1)~（4)的任一項的制造方法，在時間1分鐘~1周的反應(yīng)條件下向甲基丙 烯酰-CoA轉(zhuǎn)變。 (6) 根據(jù)（1)~（5)的任一項的制造方法，3-羥基異丁酰-CoA由包含ImM以上滲透壓 調(diào)節(jié)劑的水性介質(zhì)調(diào)制而得。 (7) 根據(jù)（1)~（6)的任一項的制造方法，在表達編碼脫水酶的基因的轉(zhuǎn)化體的存在 下，將3-羥基異丁酰-CoA向甲基丙烯酰-CoA轉(zhuǎn)變。 (8) 根據(jù)（7)的制造方法，編碼脫水酶的基因是微生物來源的基因。 (9) 根據(jù)（8)的制造方法，微生物為屬于假單胞菌屬或紅球菌屬的微生物。 (10) 根據(jù)（7)的制造方法，脫水酶選自由下述（a)~（f)所組成的組。 (a) 包含序列號1或3所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。 (b) 包含在序列號1或3所示的氨基酸序列中缺失、置換、附加和/或插入了 1個或幾 個氨基酸的氨基酸序列，并且具有脫水酶活性的蛋白質(zhì)。 (c) 與包含序列號1或3所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)顯示90%以上的同一性，并且具 有脫水酶活性的蛋白質(zhì)。 (d) 由包含序列號2或4所示的堿基序列的DNA編碼的蛋白質(zhì)。 (e) 由與包含序列號2或4所示的堿基序列的DNA在嚴格的條件下雜交的DNA編碼，并 且具有脫水酶活性的蛋白質(zhì)。 (f) 由與包含序列號2或4所示的堿基序列的DNA顯示90%以上的同一性的DNA編碼， 并且具有脫水酶活性的蛋白質(zhì)。 (11) 一種甲基丙烯酰-CoA的制造方法，在表達編碼微生物來源的脫水酶的基因的轉(zhuǎn) 化體的存在下，使由包含ImM以上滲透壓調(diào)節(jié)劑的水性介質(zhì)調(diào)制而得的3-羥基異丁酰-CoA 水溶液，在PH4~10、溫度5~80°C、時間1分鐘~1周的反應(yīng)條件下反應(yīng)，從而以轉(zhuǎn)變率 50%以上將3-羥基異丁酰-CoA向甲基丙烯酰-CoA轉(zhuǎn)變。 發(fā)明的效果 通過本發(fā)明，能夠?qū)崿F(xiàn)采用酶催化劑的甲基丙烯酰-CoA的制造，通過將本發(fā)明的制造 方法與生物體內(nèi)代謝等組合，也可以達成甲基丙烯酸及其酯的發(fā)酵生產(chǎn)。其結(jié)果是與以往 的化學制造工藝相比，可以顯著降低對能量、資源、環(huán)境的負荷，并且能夠有效率地制造甲 基丙烯酸酯。 【具體實施方式】 以下，詳細說明本發(fā)明。 在本發(fā)明中，所謂甲基丙烯酰-CoA，為以下的式（1)所示的化合物，在生物體內(nèi)作為纈 氨酸的代謝中間體是已知的。
成為本發(fā)明中的甲基丙烯酰-C0A的制造原料的3-羥基異丁酰-CoA為以下的式（2) 所示的化合物，在生物體內(nèi)作為纈氨酸的代謝中間體是已知的。
本發(fā)明中使用的3-羥基異丁酰-CoA可以使用通過公知或新的方法制造的3-羥基異 丁酰-CoA。作為其合成方法，已知有機化學合成的方法（Angew. Chem. 1953,65,186-187) 或使用了酶反應(yīng)的合成方法。進一步，可以使用由生物質(zhì)等通過代謝工程（發(fā)酵）合成的 3-羥基異丁醜-CoA。 在本發(fā)明中，所謂脫水酶（dehydratase)活性，表示催化從底物分子除去水分子的反 應(yīng)的活性，特別是指催化從3-羥基異丁酰-CoA除去水分子而生成甲基丙烯酰-CoA的反應(yīng) 的活性。作為具有脫水酶活性的具體的酶，可舉出分類成烯?；鵆oA脫水酶（EC4. 2. 1. 17)、 巴豆酸酶（crotonase)等的酶。這些酶一般參與脂肪酸的β-氧化、丙酮/ 丁醇發(fā)酵和支 鏈氨基酸的代謝。 在本發(fā)明中使用的所謂具有脫水酶活性的酶（以下，有時簡單表述為"脫水酶"。），只 要是具有從3-羥基異丁酰-CoA向甲基丙烯酰-CoA轉(zhuǎn)變的轉(zhuǎn)變能力的催化劑，則沒有特別 限定，無論其種類和起源如何。優(yōu)選為生物體來源的催化劑，進一步優(yōu)選為具有脂肪酸的 β -氧化、丙酮/丁醇發(fā)酵和支鏈氨基酸的分解能力的微生物來源的脫水酶。 來自這些生物的本發(fā)明中有效的脫水酶的選擇可以利用這些生物的全基因組序列。根 據(jù)全基因組序列，從本發(fā)明人等明確的編碼具有脫水酶活性的蛋白質(zhì)的基因序列信息或編 碼一般的烯?；鵆oA脫水酶或巴豆酸酶的蛋白質(zhì)的基因序列信息中使用相同性檢索來找 出序列的相同性高的基因序列，通過以下所示的方法，能夠選擇適于本發(fā)明的酶。關(guān)于上述 生物中全基因組序列不清楚的生物，可以在全基因組序列確定后同樣地實施。另外，隨著下 一代定序儀的普及，只要是同行業(yè)者，全基因組序列就能夠容易地解析。 關(guān)于本發(fā)明使用的脫水酶的選擇，將上述生物等的推定具有脫水酶活性的酶基因通 過離析、或公知的方法來全合成，導(dǎo)入到一般的宿主載體系統(tǒng)，用該載體系統(tǒng)進行了轉(zhuǎn)化， 通過轉(zhuǎn)化后的微生物使候選蛋白表達，添加到包含3-羥基異丁酰-CoA的溶液中，例如，在 30°C反應(yīng)，通過液相色譜來確認甲基丙烯酰-CoA的生成的有無，從而能夠確認合成活性。 在本發(fā)明中，作為優(yōu)選的酶的來源，可舉出屬于假單胞菌（Pseudomonas)屬或紅球菌 (Rhodococcus)屬的微生物來源的酶。 具體而言，作為分類為假單胞菌（Pseudomonas)屬的微生物，可舉出例如，綠膿桿 菌（Pseudomonas aeruginosa)、傘菌假單胞菌（Pseudomonas agarici)、產(chǎn)喊假單胞菌 (Pseudomonas alcaligenes)、杏仁核假單胞菌（Pseudomonas amygdale)、暢敗血假單胞菌 (Pseudomonas anguiliseptica)、抗微生物假單胞菌（Pseudomonas antimicrobica)、鐵角 蕨假單胞菌（Pseudomonas aspleni)、桔黃假單胞菌（Pseudomonas aurantiaca)、致金色假 單胞菌（Pseudomonas aureofaciens)、洋棒假單胞菌（Pseudomonas avellanae)、產(chǎn)氮假單