專利名稱：：治療腹瀉的藥物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種治療腹瀉的藥物及其制備方法。
背景技術(shù)：
：腹瀉病是兒科臨床醫(yī)療的常見病和多發(fā)病。根據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，每年約有10億人患腹瀉，其中5億發(fā)生在第三世界。導(dǎo)致每年400-500萬小兒死亡。中國預(yù)防疫司1988年調(diào)査資料顯示中國估計(jì)每年約有8.63億人次腹瀉(包括成人和兒童)，其中5歲以下小兒發(fā)病率平均為2.5次/人，推算5歲以下小兒每年有2.945億人次患腹瀉，可見危害之大。該病治療的藥物品種雖多，但主要局限于抗生素殺菌，減少腸蠕動(dòng)，調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)或被動(dòng)補(bǔ)液等，這些治療雖解決了部分患者腹瀉的癥狀，但仍有相當(dāng)一部分患兒因?yàn)槟c道粘膜不能及時(shí)修復(fù)，腹瀉遷延甚至轉(zhuǎn)為慢性，導(dǎo)致嚴(yán)重的營養(yǎng)不良，生長(zhǎng)障礙或喪失勞動(dòng)力。ITF的發(fā)現(xiàn)，為臨床診斷、治療腹瀉病提供了一個(gè)全新的概念。整個(gè)胃腸道總是不斷受到種種物理、化學(xué)因素(如食物、胃酸、消化酶、藥物、細(xì)菌毒素等)的侵害，在生理?xiàng)l件下，胃腸道的自身防御機(jī)制使其能夠在消化食物的同時(shí)避免自身被消化，這需要有一套有效的機(jī)制來保護(hù)和及時(shí)修復(fù)粘膜層。如果侵襲因素和防御因素之間失平衡，就會(huì)損傷腸道粘膜，發(fā)生一系列的病理變化，導(dǎo)致腹瀉、炎癥性腸病等胃腸疾病的發(fā)生。在急性粘膜損傷后，粘膜屏障被破壞，機(jī)體需要快速修復(fù)來保護(hù)粘膜下組織免于被消化酶和胃酸消化。早期修復(fù)有助于限制液體流動(dòng)、電解質(zhì)丟失，以及防止胃腸道腔內(nèi)的外部抗原彌散入局部或全身而引起免疫反應(yīng)。己有資料顯示粘膜上皮的早期修復(fù)主要是通過細(xì)胞遷移來完成的，即損傷區(qū)域周邊的細(xì)胞遷移到剝露區(qū)，重建上皮的完整性和重組粘膜屏障。但是腸道粘膜損傷和早期細(xì)胞遷移修復(fù)腸粘膜的機(jī)制仍不清楚。小腸三葉因子(intestinaltrefoilfactor,ITF)是一個(gè)具有特定三葉結(jié)構(gòu)的胃腸肽，與胃腸道粘膜的早期修復(fù)有關(guān)。ITF結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、緊密，使之具有不被多種消化酶破壞的生物學(xué)特性，因而在消化道腔內(nèi)ITF能保持結(jié)構(gòu)及功能上的完整。生理情況下，ITF主要由腸粘膜的杯狀細(xì)胞分泌進(jìn)入腸腔內(nèi)。在胃炎、腸炎、消化性潰瘍、炎癥性腸病等疾病時(shí)，ITF的表達(dá)量顯著升高。值得注意的是，ITF在胃腸道粘膜損傷后表達(dá)量快速升高，因此，有學(xué)者設(shè)想其可能參與損傷粘膜的早期修復(fù)。近年研究證實(shí)，ITF有預(yù)防性保護(hù)胃腸道粘膜以及促進(jìn)粘膜損傷后修復(fù)的作用?？诜推は伦⑸銲TF能預(yù)防和治療吲哚美辛、乙醇和消炎痛引起的大鼠胃潰瘍，使大鼠潰瘍指數(shù)不同程度地下降。對(duì)于體外培養(yǎng)的單層結(jié)腸細(xì)胞，ITF對(duì)腸上皮的屏障功能保護(hù)作用明顯，細(xì)胞損傷減輕。在上皮細(xì)胞修復(fù)的體外模型中，給予ITF后，遷移到損傷處的上皮細(xì)胞增加36倍。ITF基因剔除小鼠生長(zhǎng)正常，無腹瀉和便血，粘膜結(jié)構(gòu)正常，但表皮細(xì)胞移動(dòng)減慢。缺失ITF基因的小鼠飲用硫酸葡聚糖鈉水溶液后，50%的小鼠因大面積結(jié)腸炎出現(xiàn)腹瀉和便血而死。將重組ITF經(jīng)口灌胃給缺失ITF基因的小鼠后，能夠恢復(fù)正常的粘膜修復(fù)功能。研究證實(shí)ITF具有"運(yùn)動(dòng)因子"的作用，在潰瘍修復(fù)時(shí)促進(jìn)受損區(qū)域上皮細(xì)胞重建并加快上皮細(xì)胞移行速度，有助于維持粘膜的完整性。利用大鼠小腸表皮細(xì)胞系IEC-6單層細(xì)胞用刀片刮傷作為細(xì)胞培養(yǎng)修復(fù)模型，加入ITF后能提高損傷細(xì)胞的修復(fù)，促進(jìn)細(xì)胞向損傷邊緣移動(dòng)。因此，ITF表達(dá)水平的變化可能是腸炎發(fā)生和早期修復(fù)的機(jī)制之一，目前國內(nèi)尚無ITF在腸炎模型中促進(jìn)腸粘膜修復(fù)作用的研究。由于ITF在組織中含量極低，因此直接分離天然ITF用于結(jié)構(gòu)和功能研究十分困難。并且，如果能對(duì)ITF在腸粘膜損傷及早期修復(fù)中的作用有比較深入的認(rèn)識(shí)，則有益于臨床診斷、治療腹瀉病、炎癥性腸病、消化性潰瘍等疾病。尤其對(duì)于兒科常見的腹瀉病，ITF將成為新的有效診斷、治療手段，有較大的臨床應(yīng)用價(jià)值。因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)一種獲得高活性的hITF的技術(shù)，以生產(chǎn)出大量具有活性的hITF，以便于進(jìn)一步的深入研究hITF或用于臨床用藥。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種人人小腸三葉因子蛋白的用途，用于制備治療腹瀉的藥物。本發(fā)明的另一目的在于提供一種制備人人小腸三葉因子蛋白的方法，通過所述的方法可以獲得高活性的人小腸三葉因子蛋白，并且成本低廉。本發(fā)明的另一目的在于提供一種純化人小腸三葉因子蛋白的方法，所述純化方法成本低廉，且純化得率很高。在本發(fā)明的第一方面，提供一種制備人小腸三葉因子蛋白的方法，包括以下步驟(1)將攜帶小腸三葉因子基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到畢赤酵母中；(2)將(l)獲得的畢赤酵母置于基本鹽培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，獲得發(fā)酵液；(3)從發(fā)酵液中分離出人小腸三葉因子蛋白。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的人小腸三葉因子蛋白中，雙體形式的人小腸三葉因子蛋白的量占總的人小腸三葉因子蛋白的量大于80%。更優(yōu)選的，所述的人小腸三葉因子蛋白中，雙體形式的人小腸三葉因子蛋白的量占總的人小腸三葉因子蛋白的量大于87%。最優(yōu)選的，所述的人小腸三葉因子蛋白中，雙體形式的人小腸三葉因子蛋白的量占總的人小腸三葉因子蛋白的量大于90%。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的表達(dá)載體為pPIC9載體。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的畢赤酵母為GS115酵母，更優(yōu)選的，所述的畢赤酵母為GS115(Mut+Zu'")。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的基本鹽培養(yǎng)基含有磷酸22-32ml/L，硫酸鈣0.8-1.1g/L，硫酸鉀15-21g/L，硫酸鎂12-17g/L，氫氧化鉀3-6g/L，甘油30.0-50.0g/L。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的基本鹽培養(yǎng)基含有磷酸24-30ml/L，硫酸鈣0.9-1.0g/L，硫酸鉀16-20g/L，硫酸鎂13-16g/L，氫氧化鉀3-5g/L，甘油35.0-45.0g/L。比如，可釆用的配方為磷酸26.7ml/L，硫酸f丐0.93g/L，硫酸鉀18.2g/L，硫酸鎂14.9g/L，氫氧化鉀4.13g/L，甘油40.0g/L。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的基本鹽培養(yǎng)基中添加10-15ml/LPTM1微量元素溶液。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的PTM1微量元素溶液含有4.0-8.0g/lCuS04'51120，0.06-0.1g/1Na2I，1,5-4.5g/1MnS04，0.1—0.3g/1NaMo04'2H20，0.01—0.03g/1H3B03，0.3—0.7g/lCoCL2'61120，15.0—25.0g/1ZnCl2，55.0—75.0g/1FeS047H20，0.1-0.3g/l生物素(Biotin)，4,0-6.0ml/1H2S04。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的PTMl微量元素溶液含有5.0-70g/1CuS045H20，0.07-0.09g/1Na2I,2.0-4.0g/1MnS04，0.15-0.25g/1NaMo04'2H20，0.015—0.025g/lH3B03，0.4-0.6g/lCoCL2'61^20，18.0-22.0g/1ZnCl2，60.0—70.0g/1FeS04*7H20，0.15—0.25g/l生物素(Biotin)，4.5-5.5ml/lH2S04。比如，可采用的配方為在1升溶液中，含有6.0gCuS045H20，0.08gNa2I，3.0gMnS04，0.2gNaMo042H20，0.02gH3B03，0.5gCoCL26H20，20.0gZnCl2，65.0gFeS047H20，0.2g生物素(Biotin)，5.0mlH2S04。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，步驟(3)包括以SPXL陽離子交換層析和SOURCE30Q陰離子交換層析兩步法從發(fā)酵液中純化人小腸三葉因子蛋白。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的SPXL陽離子交換層析包括步驟(1)將發(fā)酵液調(diào)整PH至3.5-4.0，調(diào)整電導(dǎo)率為6-8ms/cm，離心收集上清；(2)以18-22mM甲酸溶液(pH3.5-4.0)平衡SPXL陽離子交換層析柱，將(l)中獲得的上清上柱；(3)以0100。/。的含有0.8-1.2MNaCl和18-22mM甲酸的溶液(pH3.5-4.0)進(jìn)行梯度洗脫；(4)收集洗脫峰樣品。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的SOURCE30Q陰離子交換層析包括步驟(1)以18-22mMTris-HCl調(diào)整SPXL陽離子交換層析的洗脫峰樣品至pH8.5-9.0;(2)以18-22mMTris-HCl(pH8.5-9.0)的緩沖液稀釋(l)的樣品至電導(dǎo)率為7.0-7.5ms/cm;(3)以18-22mMTris-HCl(pH8.5-9.0)平衡SOURCE30Q陰離子交換層析柱，將(2)的樣品上樣；(4)以0-100。/o的含有18-22mMTris-HC1和0.8陽1,2MNaCl的溶液(pH8.5-9.0)進(jìn)行梯度洗脫；(5)收集洗脫峰。在本發(fā)明的第二方面，提供一種釆用所述的方法獲得的人小腸三葉因子蛋白。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，采用所述的方法獲得的人小腸三葉因子蛋白中，雙體形式的人小腸三葉因子蛋白的量占總的人小腸三葉因子蛋白的量大于80%。更優(yōu)選的，所述的采用所述的方法獲得的人小腸三葉因子蛋白中，雙體形式的人小腸三葉因子蛋白的量占總的人小腸三葉因子蛋白的量大于87%。最優(yōu)選的，所述的所述的方法獲得的人小腸三葉因子蛋白中，雙體形式的人小腸三葉因子蛋白的量占總的人小腸三葉因子蛋白的量大于90%。在本發(fā)明的第三方面，提供用所述的方法獲得的人小腸三葉因子蛋白的用途，用于制備治療胃炎、腸炎、消化性潰瘍、或炎癥性腸病的藥物。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的人小腸三葉因子蛋白的用途是用于制備治療腹瀉的藥物。在本發(fā)明的第四方面，提供一種藥物組合物，所述藥物組合物含有(i)有效量的所述的人小腸三葉因子蛋白；以及(ii)藥學(xué)上可接受的載體。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述藥物組合物為單元?jiǎng)┬?，其中含?0-80mg/劑的所述的人小腸三葉因子蛋白。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。圖1顯示了重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9/hlTF構(gòu)建示意圖。圖2顯示了RT-PCR擴(kuò)增hITF結(jié)果，其中，泳道l為Marker:100bpDNALadder,泳道2為hlTF。圖3顯示了重組質(zhì)粒pPIC9/hlTF酶切鑒定結(jié)果。其中，泳道l為pPIC9雙酶切(XhoI/NotI);泳道2為重組質(zhì)粒pPIC9/hlTF雙酶切(XhoI/NotI);泳道3為hITF;泳道4為Marker:DL2000。圖4顯示了重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9/hlTF測(cè)序部分結(jié)果。圖5顯示了不同甲醇誘導(dǎo)時(shí)間的細(xì)胞濕重的變化。圖6A和圖6B顯示了甲醇誘導(dǎo)不同時(shí)間，蛋白表達(dá)變化。圖3A中，泳道l表示Marker，泳道2表示甲醇誘導(dǎo)0h，泳道3表示甲醇誘導(dǎo)12h，泳道4表示甲醇誘導(dǎo)24h，泳道5表示甲醇誘導(dǎo)48h。圖3B中，泳道l表示甲醇誘導(dǎo)60h，泳道2表示甲醇誘導(dǎo)72h，泳道3表示甲醇誘導(dǎo)84h，泳道4表示Marker，泳道5表示甲醇誘導(dǎo)103h。圖7顯示了蛋白純化結(jié)果。泳道l表示發(fā)酵液；泳道2表示純化后蛋白；泳道3表示ITF標(biāo)準(zhǔn)品；泳道4表示Marker。圖8顯示了本發(fā)明獲得的重組hlTF的蛋白質(zhì)分子量鑒定的結(jié)果。圖9顯示了對(duì)照組及不同濃度的重組hlTF對(duì)大鼠小腸隱窩上皮細(xì)胞遷移功能的影響，其中，*表示同對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。圖10顯示了不同實(shí)驗(yàn)組腸粘膜中MPO含量，其中，**表示同對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。具體實(shí)施例方式本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究和試驗(yàn)，意外地發(fā)現(xiàn)一種可大規(guī)模生產(chǎn)和/或純化人小腸三葉因子(MTF)蛋白的方法。采用本發(fā)明的方法，可獲得具有高的雙體比例(占蛋白總和的80y。以上)的hlTF蛋白，其活性大大高于現(xiàn)有技術(shù)中一般獲得的hITF蛋白。并且，由于采用了基本鹽培養(yǎng)基，價(jià)格低廉，從而大大降低了發(fā)酵的成本?；诖送瓿杀景l(fā)明。小腸三葉因子(hITF)具有單體和二聚體兩種形式，所述的二聚體是由兩個(gè)Cys形成分子間二硫鍵連接而成。hITF二聚體是hITF的活性形式，而單體沒有活性，因此評(píng)判hITF二聚體的含量比評(píng)判ITF總量更具意義。如本發(fā)明所用，所述的"小腸三葉因子"優(yōu)選為人小腸三葉因子，即hITF;更優(yōu)選的為重組人小腸三葉因子，即rhITF。如本文所用，"高活性的人小腸三葉因子蛋白"是指在人小腸三葉因子蛋白中，雙體形式的人小腸三葉因子蛋白的量占總的人小腸三葉因子蛋白的量的80%或更高。更優(yōu)選的，是指所述的人小腸三葉因子蛋白中，雙體形式的人小腸三葉因子蛋白的量占總的人小腸三葉因子蛋白的量的87%或更高。最優(yōu)選的，是指所述的人小腸三葉因子蛋白中，雙體形式的人小腸三葉因子蛋白的量占總的人小腸三葉因子蛋白的量的90%或更高?？刹扇”绢I(lǐng)域已知的多種形式來制備或獲得ITF的基因，如人工合成、聚合酶聯(lián)反應(yīng)(PCR)等。在本發(fā)明的優(yōu)選方式中，本發(fā)明人從人結(jié)腸粘膜cDNA中擴(kuò)增并獲得了hITF基因。將目的基因克隆入適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體，并將表達(dá)載體轉(zhuǎn)入適當(dāng)?shù)南到y(tǒng)(如細(xì)胞)中進(jìn)行目的蛋白的表達(dá)是本領(lǐng)域常規(guī)的技術(shù)。在本發(fā)明的優(yōu)選方式中，為了實(shí)現(xiàn)ITF的高效分泌表達(dá)，本發(fā)明人選用含有a分泌信號(hào)肽的載體pPIC9作為表達(dá)載體。更優(yōu)選的，本發(fā)明人選用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)來表達(dá)所述的ITF。畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)是一種真核表達(dá)系統(tǒng)，其自身分泌到培養(yǎng)基中的蛋白很少，高分泌的外源蛋白易從無蛋白培養(yǎng)基質(zhì)中分離，而且畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)具有高表達(dá)、高穩(wěn)定、高分泌的特點(diǎn)。本發(fā)明提供了一種制備人小腸三葉因子蛋白的方法，所述方法包括以下步驟(1)將攜帶小腸三葉因子基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到畢赤酵母中；(2)將(l)獲得的畢赤酵母置于基本鹽培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，獲得發(fā)酵液；并且，所述的基本鹽培養(yǎng)基中含有10-15ml(如12ml)PTM1微量元素溶液；(3)從發(fā)酵液中分離出人小腸三葉因子蛋白。在本發(fā)明的優(yōu)選方式中，所述的表達(dá)載體為PPIC9載體。在本發(fā)明的優(yōu)選方式中，所述的畢赤酵母為GS115酵母，更優(yōu)選的，所述的畢赤酵母為GS115(Mut+與大腸桿菌(EColi.)表達(dá)系統(tǒng)相比，酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)ITF有更多的優(yōu)勢(shì)，包括(1)蛋白產(chǎn)量更高，酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)ITF的水平約為50-100mg/L，而大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)僅有約100ug/L;(2)產(chǎn)生的雜蛋白較少，后續(xù)的純化步驟更簡(jiǎn)單，得率更高；(3)不需后續(xù)的修飾加工，通過大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)獲得的蛋白，是非折疊的e-半乳糖苷酶融合蛋白，必須經(jīng)過進(jìn)一步的折疊等加工修飾，才能獲得具有天然結(jié)構(gòu)的ITF，而通過畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)可以直接獲得天然ITF，而且質(zhì)譜分析證實(shí)酵母表達(dá)的ITF沒有O-糖基化。為了實(shí)現(xiàn)在降低成本的基礎(chǔ)上，大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)具有高活性的hITF，本發(fā)明采用基本鹽培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵。采用基本鹽培養(yǎng)基與其它一些培養(yǎng)基如YPD和BMMY/BMGY培養(yǎng)基等相比，價(jià)格低廉，在大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)無疑可以降低生產(chǎn)成本，增加收益。并且，發(fā)明人出乎意料地發(fā)現(xiàn)，采用基本鹽培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)獲得的hITF蛋白中，雙體含量很高，比采用其它培養(yǎng)基效果更好。所述的基本鹽培養(yǎng)基含有磷酸22-32ml/L，硫酸鈣0.8-1.1g/L，硫酸鉀15-21g/L，硫酸鎂12-17g/L，氫氧化鉀3-6g/L，甘油30.0-50.0g/L。更優(yōu)選的，所述的基本鹽培養(yǎng)基含有磷酸24-30ml/L，硫酸鈣0.9-1.0g/L，硫酸鉀16-20g/L,硫酸鎂13-16g/L，氫氧化鉀3-5g/L，甘油35.0-45.0g/L。比如，可采用的配方為磷酸26.7ml/L，硫酸鈣0.93g/L，硫酸鉀18.2g/L，硫酸鎂14.9g/L，氫氧化鉀4.13g/L，甘油40.0g/L。在進(jìn)行發(fā)酵時(shí)，還添加PTM1微量元素溶液，其中含有4.0-8.0g/1CuS04'5H20，0.06-0.1g/1Na2I，1.5-4.5g/1MnS04，0.卜O.3g/1NaMo04'2^0，0.01-0.03g/1H3B03，0.3-0.7g/lCoCL2'6^0，15.0-25.0g/1ZnCl2，55.0-75.0g/1FeS047H20，0.1-0.3g/l生物素(Biotin),4.0-6.0ml/1H2S04。更優(yōu)選的，其中含有5.0-70g/1CuS04'5即，0,07-0.09g/1Na2I，2.0-4.0g/1MnS04，0.15-0.25g/1NaMo042H20，0.015-0.025g/lH3B03，0.4-0.6g/lCoCL26H20，18.0-22.0g/1ZnCl2，60.0-70.0g/1FeS047H20，0.15-0.25g/l生物素(Biotin)，4.5-5.5ml/lH2S04。比如，可釆用的配方為在1升溶液中，含有6.0gCuS045H20，0.08gNa2I，3.0gMnS04，0.2gNaMo042H20，0.02gH3B03，0.5gCoCL26H20，20.0gZnCl2，65.0gFeS047H20，0.2g生物素(Biotin)，5.0mlH2S04。此外，以往本領(lǐng)域人員在小規(guī)模制備hITF蛋白時(shí)，一般是采用高效液相層析(HPLC)方法進(jìn)行純化。HPLC方法僅適合于微量的蛋白純化，但是不適合于大規(guī)模蛋白純化，并且成本高昂，純化得率也不高。為了克服采用HPLC方法存在的問題，本發(fā)明人對(duì)此作了改進(jìn)，開發(fā)了一種新的純化方法，即以SPXL陽離子交換層析和SOURCE30Q陰離子交換層析兩步法從發(fā)酵液中純化人小腸三葉因子蛋白。采用本發(fā)明的純化方法，特別適合于大規(guī)模的蛋白純化，純化得率大大提高，由一般的低于25%上升為35-45%;并且，該純化方法能夠最大程度保持ITF蛋白的活性，保持蛋白中高的雙體含量。在本發(fā)明的優(yōu)選方式中，所述的SPXL陽離子交換層析包括步驟(1)將發(fā)酵液調(diào)整PH至3.5-4.0，調(diào)整電導(dǎo)率為6-8ms/cm，離心收集上清；(2)以18-22mM甲酸溶液(pH3.5-4.0)平衡SPXL陽離子交換層析柱，將(l)中獲得的上清上柱；(3)以0100。/o的含有0.8-1.2MNaCl和18-22mM甲酸的溶液(pH3.5-4.0)進(jìn)行梯度洗脫；(4)收集洗脫峰樣品。在本發(fā)明的優(yōu)選方式中，所述的SOURCE30Q陰離子交換層析包括步驟(1)以18-22mMTris-HCl調(diào)整SPXL陽離子交換層析的洗脫峰樣品至pH8.5-9,0;(2)以18-22mMTris-HCl(pH8.5-9.0)的緩沖液稀釋(l)的樣品至電導(dǎo)率為7.0-7.5ms/cm;(3)以18-22mMTris-HCl(pH8.5-9.0)平衡SOURCE30Q層析柱，將樣品上樣；(4)以0-100。/。的含有18-22mMTris-HCl和0.8-1.2MNaCl的溶液(pH8.5-9.0)進(jìn)行梯度洗脫；(5)收集洗脫峰。在本發(fā)明的實(shí)施例中，在通過上述提供的方法獲得hITF重組蛋白后，本發(fā)明人還對(duì)重組蛋白的生物學(xué)活性進(jìn)行了鑒定。采用細(xì)胞遷移試劑盒檢測(cè)了重組hITF對(duì)大鼠小腸隱窩上皮細(xì)胞(IEC-6)遷移的影響，結(jié)果表明重組ITF在10—〒M濃度時(shí)，即具有促進(jìn)細(xì)胞遷移的作用；在10—SM濃度時(shí)，其促進(jìn)細(xì)胞遷移的作用最為明顯。由此可見本發(fā)明制備的ITF具有高的生物學(xué)活性，僅需要低的劑量即可達(dá)到良好的生物學(xué)活性。在本發(fā)明的實(shí)施例中，為了檢測(cè)重組ITF是否具有天然蛋白的免疫原性，本發(fā)明人以重組ITF3次免疫兔子，獲得兔抗ITF抗血清。并從人體獲得天然ITF。經(jīng)檢測(cè)，應(yīng)用重組ITF免疫兔子制備的多克隆抗體可以與天然ITF特異的結(jié)合，從而有力地證實(shí)重組ITF具有與天然蛋白相同的免疫原性。本發(fā)明還提供了一種含有本發(fā)明的hITF的藥物組合物，所述的藥物組合物含有(i)有效量的所述的人小腸三葉因子蛋白；以及(ii)藥學(xué)上可接受的載體。在本發(fā)明的一種優(yōu)選方式中，所述藥物組合物為單元?jiǎng)┬?，每劑含?0-80mg/劑的所述的人小腸三葉因子蛋白。如本文所用，術(shù)語"藥學(xué)上可接受的"的成分是適用于人和/或動(dòng)物而無過度不良副反應(yīng)(如毒性、刺激和變態(tài)反應(yīng))的，即有合理的效益/風(fēng)險(xiǎn)比的物質(zhì)。如本文所用，術(shù)語"有效量"是指可對(duì)人和/或動(dòng)物產(chǎn)生功能或活性的且可被人和/或動(dòng)物所接受的量。如本文所用，術(shù)語"藥學(xué)上可接受的載體"指用于治療劑給藥的載體，包括各種賦形劑和稀釋劑。該術(shù)語指這樣一些藥劑載體它們本身并不是必要的活性成分，且施用后沒有過分的毒性。合適的載體是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟矢口的。在Remington'sPharmaceuticalSciences(MackPub.Co.，N丄1991)中可找到關(guān)于藥學(xué)上可接受的賦形劑的充分討論。在組合物中藥學(xué)上可接受的載體可含有液體，如水、鹽水、甘油和乙醇。另外，這些載體中還可能存在輔助性的物質(zhì)，如填充劑、崩解劑、潤滑劑、助流劑、泡騰劑、潤濕劑或乳化劑、矯味劑、pH緩沖物質(zhì)等。如本文所用，術(shù)語"單元?jiǎng)┬?是指為了服用方便，將本發(fā)明的藥物組合物制備成單次服用所需的劑型，包括但不限于各種固體劑(如片劑)、液體劑、膠囊劑、緩釋劑。所述的單元?jiǎng)┬椭泻袑?duì)于預(yù)防、治療、或改善腹瀉有效的本發(fā)明的蛋白。所用的藥物組合物的有效劑量可隨給藥的模式和待治療的疾病的嚴(yán)重程度而變化。然而，通常當(dāng)本發(fā)明的ITF蛋白每天以約0.5-50mg/kg動(dòng)物體重(優(yōu)選0.5-20mg/kg動(dòng)物體重；更優(yōu)選0.5-4mg/kg動(dòng)物體重；最優(yōu)選0.6-2mg/kg動(dòng)物體重)的劑量給予時(shí)，能得到令人滿意的效果，較佳地每天以2-3次分開的劑量給予，或以緩釋形式給藥。本發(fā)明的藥物組合物可通過口服以及靜脈內(nèi)、肌內(nèi)或皮下等途徑給藥。固態(tài)載體包括淀粉、乳糖、磷酸二鈣、微晶纖維素、蔗糖和白陶土，而液態(tài)載體包括無菌水、聚乙二醇、非離子型表面活性劑和食用油(如玉米油、花生油和芝麻油)，只要適合活性成分的特性和所需的特定給藥方式。在制備藥物組合物中通常使用的佐劑也可有利地被包括，例如調(diào)味劑、色素、防腐劑和抗氧化劑如維生素E、維生素C、BHT和BHA。從易于制備和給藥的立場(chǎng)看，優(yōu)選的藥物組合物是固態(tài)組合物，尤其是片劑和固體填充或液體填充的膠囊?？诜o藥是優(yōu)選的。適應(yīng)于注射的藥物形式包括無菌水溶液或分散液和無菌粉(用于臨時(shí)制備無菌注射溶液或分散液)。在所有情況中，這些形式必須是無菌的且必須是流體以易于注射器排出流體。在制造和儲(chǔ)存條件下必須是穩(wěn)定的，且必須能防止微生物(如細(xì)菌和真菌)的污染影響。載體可以是溶劑或分散介質(zhì)，其中含有如水、醇(如甘油、丙二醇和液態(tài)聚乙二醇)、它們的適當(dāng)混合物和植物油。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于(1)提供了一種生產(chǎn)和/或純化MTF蛋白的方法，采用所述的方法可獲得具有高的雙體比例的WTF蛋白，其活性大大高于現(xiàn)有技術(shù)中一般獲得的hITF蛋白，并且，所述的方法特別適合于大規(guī)模生產(chǎn)和/或純化MTF蛋白，可實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。(2)本發(fā)明的方法中，采用了基本鹽培養(yǎng)基，價(jià)格低廉，在大大降低發(fā)酵成本的基礎(chǔ)上，可穩(wěn)定地獲得高活性的hITF。(3)本發(fā)明采用SPXL陽離子交換層析和SOURCE30Q陰離子交換層析兩步法進(jìn)行hITF蛋白的純化，所述純化方法不僅適合于大規(guī)模純化、成本低廉，而且純化得率大大提高。(4)由于本發(fā)明獲得的hITF具有高的活性，因此僅需要低的劑量即可達(dá)到有效防治腹瀉的目的。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。實(shí)施例l質(zhì)粒構(gòu)建質(zhì)粒與菌株質(zhì)粒pPIC9為Invitrogen公司產(chǎn)品；菌株TGl為Sigma公司產(chǎn)a口卩o酶和試劑限制性內(nèi)切酶(J力oI，#"I)、T4DNA連接酶為TaKaRa公司產(chǎn)品；細(xì)胞總RNA抽提試劑盒Trizol、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑和PCR試劑均為GIBCOBRL公司產(chǎn)品；DNA凝膠回收試劑盒及質(zhì)粒純化試劑盒為上海華舜生物工程有限公司產(chǎn)品；pfu聚合酶購自上海生工生物工程公司；引物由上海生工生物工程公司合成并純化；DNAMarker為GeneRulerlOObpDNALadder及DL2000。其他試劑均為進(jìn)口分裝或國產(chǎn)分析純。1、人結(jié)腸粘膜總RNA提取經(jīng)結(jié)腸鏡活檢取腸粘膜，立即投入液氮中-80°C保存。將結(jié)腸粘膜置于勻漿器中，用Trizol試劑盒按一步法抽提總RNA。將所得RNA沉淀溶于適量DEPC(焦碳酸二乙酯)水中，-80°C保存。2、RT-PCR擴(kuò)增目的基因(l)引物設(shè)計(jì)根據(jù)GeneBank登錄號(hào)L15203所示的序列，設(shè)計(jì)引物如下上游引物P1(SEQIDNO:1):5，-TGCAGTCTCGAGAAAAGAGAGGAGTACGTGGGCCTGTC-3，，其中下劃線區(qū)為Z力ol酶切位點(diǎn)；下游引物P2(SEQIDNO:2):5，-TTGCGGCCGCAGTGCCTGGCAGCAATCACAG-3，，其中下劃線區(qū)為jV"I酵切位點(diǎn)。3、質(zhì)粒DNA抽提采用常規(guī)的堿裂解法抽提質(zhì)粒函A。4、真核表達(dá)載體的構(gòu)建以質(zhì)粒pPIC9為真核表達(dá)載體，將載體及目的基因片段均用X力oI、I進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物分別經(jīng)1%及2%瓊脂糖凝膠電泳后，回收目的基因片段。用T4DNA連接酶將兩者連接，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)的大腸桿菌TG1，得到重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9/hlTF，詳細(xì)的質(zhì)粒構(gòu)建見圖l。結(jié)果1、PCR擴(kuò)增hITF基因DNA序列分析取酶切鑒定正確的lml菌液送上?；瞪锛夹g(shù)有限公司用5，A0X1和3，A0X1通用引物測(cè)序。經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳顯示，在分子量約為280bp的位置可見與預(yù)期相符的特異性擴(kuò)增條帶，結(jié)果見圖2。2、陽性重組子的篩選與鑒定在氨芐青霉素抗性培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的菌落，經(jīng)培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，質(zhì)粒經(jīng)雙酶切、PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)可見hITF基因片段，表明重組入pPIC9中的片段為hITF基因片段，結(jié)果見圖3。3、測(cè)序結(jié)果目的基因的序列測(cè)序結(jié)果見圖4，從該結(jié)果可見，與文獻(xiàn)報(bào)道(Hauser,F.等，AhumanP-domainpeptidehomologouswithratintestinaltrefoilfactor,isexpressedalsointheulcer—associatedcelllineageandtheuterus.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90(15)，6961-6965(1993))中描述的完全一致。實(shí)施例2蛋白質(zhì)的表達(dá)和純化1.重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化抽取約10ug的重組質(zhì)粒，用^/I單酶切，乙醇沉淀回收線性化的質(zhì)粒，用電轉(zhuǎn)化儀(Bio-RadGenePulser)在l500V，20uF，200Q的條件下電擊轉(zhuǎn)化到GS115(Mut+A/")酵母感受態(tài)細(xì)胞中，電擊產(chǎn)物涂布在MD平板上(13.4g/LYNB，20g/L葡萄糖，4X10—4g/L生物素，15g/L瓊脂)，放于30。C培養(yǎng)2-3天，觀察轉(zhuǎn)化子生長(zhǎng)。2.轉(zhuǎn)化子鑒定和篩選根據(jù)Invitrogen公司提供的操作手冊(cè)，選擇通用引物5'A0X1和3'A0X1，以菌落PCR擴(kuò)增目的片段來篩選陽性轉(zhuǎn)化子，PCR擴(kuò)增條件，94°Clmin,55°Clmin，72。Clmin，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)。5'A0X1:5，-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3，(SEQIDNO:3);3'AOXl:5，-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3，(SEQIDNO:4)。從MD平板上挑取單菌落至YPD培養(yǎng)基中(10g/L酵母膏，20g/L蛋白胨，10g/L葡萄糖)，培養(yǎng)過夜后，按照2。/。接種量轉(zhuǎn)接至BMGY培養(yǎng)基中(10g/L酵母膏，20g/L蛋白胨，13.4g/LYNB，4Xl(T4g/L生物素，10g/L甘油，lOOmM磷酸鉀，pH6.0)，200rpm，30。C培養(yǎng)20h后，3000rpm離心5min，棄上清，加入新鮮的BMMY培養(yǎng)基(10g/L酵母膏，20g/L蛋白胨，13.4g/L含硫酸銨的酵母氮源培養(yǎng)基(yeastnitrogenbasewithammoniumsulfate(YNB))，4Xl(T4g/L生物素，5g/L甲醇，lOOmM磷酸鉀，pH6.0)重懸菌體，每隔24h補(bǔ)加0.5。/。甲醇誘導(dǎo)。定時(shí)取樣，離心收集上清進(jìn)行SDS-PAGE分析。3.在5L發(fā)酵罐中分泌表達(dá)目的蛋白質(zhì)采用基本鹽培養(yǎng)基(磷酸26.7ml/L，硫酸鈣0.93g/L，硫酸鉀18.2g/L，硫酸鎂14.9g/L，氫氧化鉀4.13g/L，甘油40.0g/L)發(fā)酵重組菌株，按照5%接種量將種子液按照10%接種量轉(zhuǎn)接至發(fā)酵罐中，維持溶氧30%，溫度28t:，發(fā)酵過程中用氨水調(diào)節(jié)維持pH6.0，發(fā)酵至大約20h時(shí)，發(fā)酵罐中初始甘油已經(jīng)消耗完，溶氧開始上升，當(dāng)溶氧穩(wěn)定在80%左右時(shí)，流加70%甘油，流加速度為13.2ml/h丄，持續(xù)流加4h。當(dāng)溶氧回升至最高點(diǎn)并且穩(wěn)定后開始流加甲醇。最初甲醇流加速度為3.6ml/h丄，持續(xù)流加3h,然后甲醇流加速度增加至7.2ml/h丄，穩(wěn)定此流加速度直至發(fā)酵結(jié)束。于基本鹽培養(yǎng)基中加入12ml/LPTM1微量元素溶液，其配制方法為PTM1TraceSalts(lL):6.0gCuS045H20，0.08gNa2I，3.0gMnS04，0.2gNaMo04'2H20，0.02gH3B03，0.5gCoCL2'61120，20.0gZnCl2，65.0gFeS04'7^0，0.2g生物素(Biotin)，5.0mlH2S04,過濾除菌，室溫保存。發(fā)酵結(jié)果整個(gè)發(fā)酵過程歷時(shí)5天，共獲得發(fā)酵液3450ml，離心收集上清，獲得草綠色，帶臭味的上清液2570ml，稱細(xì)胞濕重約1297.51克，平均細(xì)胞濕重為376.0893g/L。發(fā)酵過程中隨甲醇誘導(dǎo)時(shí)間增加，細(xì)胞濕重也不斷增加，96h左右細(xì)胞濕重達(dá)到最高峰，之后增加不明顯；目的蛋白表達(dá)也隨甲醇誘導(dǎo)時(shí)間增加而不斷增加，72h目的蛋白濃度最高，之后雜蛋白含量逐漸增多，檢測(cè)結(jié)果見圖5和圖6。因此可見，在甲醇誘導(dǎo)72h結(jié)束發(fā)酵最為合適。經(jīng)過發(fā)酵后，收集獲得發(fā)酵液2.5L，共獲得蛋白253mg，可見蛋白的得率非常高。4.重組hITF的純化取1000g發(fā)酵液進(jìn)行純化，首先離心收集上清，作為樣品。4.1第一種純化方法(1)以檸檬酸調(diào)整樣品PH至3.5，并以水調(diào)整樣品電導(dǎo)為4ms/cm。以25mMNaH2P04-檸檬酸緩沖液平衡SPHP(SPSepharoseHighPerformance)填充柱(購自Amersham公司)，以25ml/min速度上樣，以0-100。/。含lMNaCL的25mMNaH2P(V檸檬酸緩沖液洗脫，收集洗脫峰。(2)以NaOH調(diào)整SPHP洗脫峰至PH8.0，上樣至SephadexG-25純化柱，以PH8.0,25mMTris-CL洗脫柱子，收集洗脫峰。(3)采用MonoQ預(yù)裝柱，以PH8.0,25mMTris-CL平衡柱子，將上述洗脫峰上樣，流速為6ml/min，以0-100。/。含lMNaCL的25mMTris-CL緩沖液洗脫，收集洗脫峰。(4)以磷酸調(diào)整MonoQ洗脫峰至Ph6.0，上樣至SephacrylS-100純化柱，上樣流速為1.2ml/min，以PH6.0的Na2HPO4->^必204洗脫柱子，收集洗脫峰。采用Lowry法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量分析。該方法適合小規(guī)模地純化重組ITF。4.2第二種純化方法分兩步進(jìn)行純化，該方法適合大規(guī)模地純化重組ITF。l.SPXL陽離子交換層析(1)收集的培養(yǎng)上清樣品以甲酸調(diào)整PH至3.7，用水調(diào)整電導(dǎo)率為7ms/cm，離心收集上清。(2)以緩沖液A:20mM甲酸，pH3.7平衡SPXL陽離子交換層析柱(購自Amersham公司)后將樣品上柱。(3)以0100。/。的B液(lMNaC120mM甲酸pH3.7)進(jìn)行梯度洗脫。(4)收集洗脫峰(為目標(biāo)蛋白峰)。2.SOURCE30Q陰離子交換層析(1)以20mMTris溶液調(diào)整SPXL柱的洗脫峰樣品至pH8.8.(2)再以20mMTris-HClpH8.8的緩沖液稀釋上述樣品至電導(dǎo)率為7.2ms/cm.(3)以緩沖液A:20mMTris-HClpH8.8平衡SOURCE30Q陰離子交換層析柱(購自Amersham公司)后上樣。(4)以0-100。/。B液(20mMTris-HCl1MNaClpH8.8)進(jìn)行梯度洗脫。(5)收集洗脫峰。結(jié)果共獲得兩個(gè)洗脫峰，電泳鑒定均為目標(biāo)蛋白，但峰l有兩條條帶，由于獲得的目的蛋白的純度不同而形成兩條條帶)，峰2為單一條帶，可作為最終產(chǎn)品。重組hITF蛋白純化后，進(jìn)行SDS-PAGE電泳鑒定，結(jié)果見圖7。其中，泳道l表示發(fā)酵液上清；泳道2表示純化后蛋白(僅一條條帶(即峰2產(chǎn)物))；泳道3表示ITF標(biāo)準(zhǔn)品；泳道4表示Marker。電泳結(jié)果純化顯示，所得目的蛋白的位置與hITF標(biāo)準(zhǔn)品一致，證實(shí)是MTF，而且沒有其他雜蛋白。經(jīng)過本發(fā)明人的計(jì)算，采用前述方法l進(jìn)行純化，純化得率為35-45%;采用前述方法2進(jìn)行計(jì)算，純化得率為55-65%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于一般水平。5.重組hlTF質(zhì)譜鑒定蛋白質(zhì)分子量鑒定結(jié)果見圖8。由圖可見，雙體分子量為13159.6211，單體分子量為6583.5210，并且由圖可知雙體含量占總數(shù)的約81.5%。由于雙體為hITF的活性形式，因此本發(fā)明獲得的hITF具有很高的活性。而本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)制備的hITF中，一般雙體含量占總數(shù)的80%以下。對(duì)蛋白質(zhì)性質(zhì)鑒定證實(shí)，本發(fā)明人所獲得的雙體蛋白是人小腸三葉因子的雙硫鍵連接的二聚體可溶性結(jié)構(gòu)(solutionstructureofthedisulphide-linkeddimmerofhumanintestinaltrefoilfactor(Tff3))，置信區(qū)間為99.985%，NCBI氨基酸序列登錄號(hào)1PE32;而nr的登錄號(hào)為gil47168540。實(shí)施例3hITF的生物學(xué)活性鑒定6.1方法采用大鼠小腸上皮細(xì)胞(IEC-6，購自中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞保藏中心)和細(xì)胞遷移試劑盒(Corning，US)，觀察不同濃度的重組ITF對(duì)細(xì)胞遷移的影響。以無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞24小時(shí)，造成細(xì)胞饑餓后，以胰酶消化后制備細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度為0.5-lX10"ml，24孔板的每個(gè)內(nèi)置孔板末(底部為孔徑0.8um的膜，上皮細(xì)胞可從孔中穿過)中加入300ul細(xì)胞懸液，同時(shí)加入生理鹽水或10一M、10—"M和1(^M的重組ITF，內(nèi)置孔板外加入500ul含5。/。胎牛血清的培養(yǎng)基，培養(yǎng)14小時(shí)后，吸出內(nèi)置孔內(nèi)的細(xì)胞懸液，將膜底部外側(cè)的細(xì)胞洗脫下來，進(jìn)行熒光染色后，采用熒光酶標(biāo)儀和波長(zhǎng)480/520檢測(cè)。6.2結(jié)果結(jié)果見圖9，由結(jié)果可見蛋白干預(yù)組細(xì)胞遷移數(shù)量明顯多于對(duì)照組。實(shí)施例4hITF保護(hù)腸粘膜的作用1.方法選取5-6周齡(體重180-220克)的健康雄性SD大鼠，在禁食48小時(shí)后于戊巴比妥鈉麻醉下，用直徑2mm硅膠管從肛門插入腸道深約8cm，模型組注入溶于50。/。乙醇0.25ml的TNBS150mg/kg，一次性灌腸制備腸炎模型。于灌腸后24小時(shí)處死動(dòng)物獲取結(jié)腸組織標(biāo)本進(jìn)行大體評(píng)分、病理評(píng)分并檢測(cè)腸粘膜中MPO(髓過氧化物酶)含量。WTF預(yù)防性保護(hù)實(shí)驗(yàn)于造模前l(fā)小時(shí)給予不同劑量hITF灌胃。MTF治療性保護(hù)實(shí)驗(yàn)于造模后6小時(shí)給予不同劑量hlTF灌胃。實(shí)驗(yàn)分組對(duì)照組(NS組)以生理鹽水代替WTF灌胃；lmg/kg組給予蛋白量按lmg/kg計(jì)算；20mg/kg:給予蛋白量按20mg/kg計(jì)算。大體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表l。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>2.結(jié)果lmg/kg組和20mg/kg組在大體評(píng)分、病理評(píng)分以及MPO含量3個(gè)方面，均與對(duì)照組有明顯差異(PO.01);而lmg/kg組和20mg/kg組在3個(gè)方面均無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)果表明hITF在較小劑量即可發(fā)揮保護(hù)腸粘膜的作用，而且增加給藥劑量，不能明顯增加其作用。(見表3、圖IO)不同實(shí)驗(yàn)組的大體評(píng)分、病理評(píng)分以及MP0含量(均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差)見表3。<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>實(shí)施例ShITF促進(jìn)腸粘膜損傷后愈合的作用1.大體標(biāo)本觀察造模后24小時(shí)，對(duì)照組出現(xiàn)粘液膿血便，腸粘膜充血水腫，伴出血、潰瘍，部分標(biāo)本潰瘍長(zhǎng)度〉2cm，腸壁增厚，并與周圍組織黏連，不易分離；灌服ITF的實(shí)驗(yàn)組則僅少量粘液膿血便，腸粘膜充血水腫，有小潰瘍，無腸壁增厚，與周圍組織無黏連，同對(duì)照組相比，腸粘膜損傷程度明顯較輕。WTF促進(jìn)腸粘膜損傷后愈合的作用大體評(píng)分結(jié)果見表4。<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>注Pl表示同對(duì)照組相比較的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果，*表示同對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P2表示1mg/kglTF組和20mg/kglTF組相比較的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果2.病理組織學(xué)觀察對(duì)照組大多數(shù)標(biāo)本全層粘膜壞死，腺體完全破壞，大量中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤，粘膜下層出血，肌層組織發(fā)生蜂窩織炎和組織壞死，少數(shù)標(biāo)本粘膜層充血水腫，出血，部分壞死，腺體結(jié)構(gòu)部分破壞，粘膜下層出血，大量炎細(xì)胞浸潤；灌服ITF的實(shí)驗(yàn)組標(biāo)本僅淺層粘膜壞死，脫落，表淺糜爛形成，殘留粘膜底層及腺管，腺體結(jié)構(gòu)尚存，局部腺上皮增生，粘膜下層充血水腫，中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤，粘膜組織損傷程度明顯比對(duì)照組輕。hlTF預(yù)防性保護(hù)腸粘膜的作用病理評(píng)分結(jié)果見表5。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>注Pl表示同對(duì)照組相比較的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果，*表示同對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P2表示1mg/kghlTF組和20mg/kghlTF組相比較的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果3.MPO活性對(duì)照組的標(biāo)本中組織MPO活性單位明顯高于給予hITF的實(shí)驗(yàn)組，而且給予hITF的實(shí)驗(yàn)組同對(duì)照組相比均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但是兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組之間沒有顯著差異。不同實(shí)驗(yàn)組的MP0活性(均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差)見表6。<table>tableseeoriginaldocumentpage25</table注Pl表示同對(duì)照組相比較的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果，*表示同對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P2表示lmg/kgMTF組和20mg/kghlTF組相比較的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果WTFlmg/kg組和hlTF20mg/kg組在大體評(píng)分、病理評(píng)分以及MP0活性3個(gè)方面，均與對(duì)照組有明顯差異(PO.01);雖然大體觀察和病理組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)MTF20mg/kg組的腸粘膜損傷程度較ITFlmg/kg組輕，但是統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，兩組大體評(píng)分和病理評(píng)分并無明顯差異；而且兩組的MPO活性也無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異?？梢姡蛣┝康膆ITF即具有預(yù)防性保護(hù)腸粘膜的作用。實(shí)施例6重組hITF的免疫原性在本實(shí)施例中，為了檢測(cè)重組ITF是否具有天然蛋白的免疫原性，本發(fā)明人以上述制備獲得的重組hITF3次免疫兔子后，獲得兔抗hITF抗血清。通過消化內(nèi)鏡獲得人小腸粘膜，組織勻漿并超聲粉碎后，取上清，采用常規(guī)方法從中分離出天然hITF。采用常規(guī)的蛋白印跡法(WesternBlotting)檢測(cè)兔抗重組hITF抗血清是否可以與天然hITF相結(jié)合。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，應(yīng)用重組hITF免疫兔子制備的多克隆抗體可以與天然hITF特異的結(jié)合，證實(shí)重組hITF具有與天然蛋白相同的免疫原性。實(shí)施例7藥物組合物本發(fā)明的藥物組合物每劑含有(i)5-80mg的人小腸三葉因子蛋白；和(ii)藥學(xué)上可接受的載體。所述的藥學(xué)上可接受的載體包括請(qǐng)?zhí)峁┮恍┚唧w的可用于制備成藥的載體(如液體形式的載體，如水、鹽水、甘油和乙醇。或還含有如填充劑、崩解劑、潤滑劑、助流劑、泡騰劑、潤濕劑或乳化劑、矯味劑、pH緩沖物質(zhì)等)。所述的藥物組合物的幾種配方如表7所示。表7<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>綜上，本發(fā)明利用畢赤酵母外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)，采用廉價(jià)的基本鹽培養(yǎng)基實(shí)現(xiàn)了hITF的大量、高效表達(dá)，并鑒定了重組蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性及免疫原性，為工業(yè)化、大規(guī)模生產(chǎn)hITF打下了基礎(chǔ)。并且，本發(fā)明還對(duì)hITF的用藥劑量進(jìn)行了研究，提供了hITF的藥物組合物，為腹瀉的治療提供了新的途徑。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。序列表<110>上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院<120〉治療腹瀉的藥物及其制備方法<130>062596<160>4<170〉Patentlnversion3.3<210〉1<211>38<212>DNA<213〉人工序列<220><221〉misc一feature<223>引物<400〉1tgcagtctcgagaaaag柳ggagtacgtgggcctgtc38<210>2<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc一feature<223>引物<400>2ttgcggccgcagtgcctggcagcaatcacag31〈210〉3<211>21<212>DNA<213>人工序列<220〉<221>misc一feature<223>引物<400〉3gactggttccaattgacaagc<210>4<211>21〈212>DNA<213〉人工序列<220><221〉misc—feature<223〉引物<400>4gcaaatggcattctgacatcc權(quán)利要求1.一種制備人小腸三葉因子蛋白的方法，其特征在于，包括以下步驟(1)將攜帶人小腸三葉因子基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到畢赤酵母中；(2)將(1)獲得的畢赤酵母置于基本鹽培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，獲得發(fā)酵液；(3)從發(fā)酵液中分離出人小腸三葉因子蛋白。2.如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述的人小腸三葉因子蛋白中，雙體形式的人小腸三葉因子蛋白的量占總的人小腸三葉因子蛋白的量大于80%。3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的基本鹽培養(yǎng)基含有-磷酸22-32ml/L，硫酸牽丐0.8-1.1g/L，硫酸鉀15-21g/L，硫酸鎂12-17g/L，氫氧化鉀3-6g/L，甘油30.0-50.0g/L。4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的基本鹽培養(yǎng)基中添加10-15ml/LPTM1微量元素溶液。5.如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，步驟(3)包括以SPXL陽離子交換層析和SOURCE30Q陰離子交換層析兩步法從發(fā)酵液中純化人小腸三葉因子蛋白。6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述的SPXL陽離子交換層析包括步驟(1)將發(fā)酵液調(diào)整PH至3.5-4.0，調(diào)整電導(dǎo)率為6-8ms/cm，離心收集上清；(2)以18-22mM甲酸溶液(pH3.5-4.0)平衡SPXL陽離子交換層析柱，將(l)中獲得的上清上柱；(3)以0100。/。的含有0.8-1.2MNaCl和18-22mM甲酸的溶液(pH3.5-4.0)進(jìn)行梯度洗脫；(4)收集洗脫峰樣品。7.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述的SOURCE30Q陰離子交換層析包括步驟(1)以18-22mMTris-HCl調(diào)整SPXL陽離子交換層析的洗脫峰樣品至pH8.5-9.0;(2)以18-22mMTris-HCl(pH8.5-9.0)的緩沖液稀釋(l)的樣品至電導(dǎo)率為7.0-7.5ms/cm;(3)以18-22mMTris-HCl(pH8.5-9.0)平衡SOURCE30Q陰離子交換層析柱，將(2)的樣品上樣；(4)以0-100。/。的含有18-22mMTris-HCl和0.8-1.2MNaCl的溶液(pH8.5-9.0)進(jìn)行梯度洗脫；(5)收集洗脫峰。8.—種采用權(quán)利要求1所述的方法獲得的人小腸三葉因子蛋白。9.權(quán)利要求8所述的人小腸三葉因子蛋白的用途，其特征在于，用于制備治療腹瀉、胃炎、腸炎、消化性潰瘍、或炎癥性腸病的藥物。10.—種藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物含有(i)有效量的權(quán)利要求8所述的人小腸三葉因子蛋白；以及(ii)藥學(xué)上可接受的載體。全文摘要本發(fā)明屬于生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，公開了一種制備高活性的人小腸三葉因子蛋白的方法以及用所述的方法獲得的人小腸三葉因子蛋白。本發(fā)明還公開了所述的人小腸三葉因子蛋白在制備治療腹瀉的藥物中的用途。采用本發(fā)明的方法不僅可獲得具有高的雙體比例的ITF蛋白，而且大大降低了生產(chǎn)ITF的成本。文檔編號(hào)A61P1/12GK101100690SQ20061002871公開日2008年1月9日申請(qǐng)日期2006年7月7日優(yōu)先權(quán)日2006年7月7日發(fā)明者偉劉,莎周,晟楊,許春娣,鐘雪梅申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院