一種延胡索總生物堿的分離純化方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了中藥延胡索中總生物堿類的分離純化方法及其純化物在抗胃潰瘍藥效學(xué)方面的應(yīng)用。本發(fā)明可以在延胡索中分離純化出較高純度的總生物堿富集物，解決了延胡索中總生物堿類與大量非生物堿類雜質(zhì)難以分離，總生物堿純度低，利用率低以及其治療胃潰瘍藥效低的問題。延胡索總生物堿的分離純化方法為：延胡索粗粉經(jīng)提取、大孔吸附樹脂純化得一次純化產(chǎn)物，再經(jīng)有機(jī)溶劑萃取得到高純度總生物堿富集物。本發(fā)明得到的總生物堿純度達(dá)90%以上，大大提高了生物利用度，作為治療抗?jié)兊挠行С煞?，用于治療胃潰瘍、口腔潰瘍等各種潰瘍疾病。
【專利說明】一種延胡索總生物堿的分離純化方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種中藥的制備方法，特別是涉及中藥延胡索總生物堿的高純度分離純化方法及其抗?jié)冾I(lǐng)域的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]胃潰瘍是我國(guó)人群中常見病、多發(fā)病之一。作為消化性潰瘍中的常見類型，胃潰瘍的發(fā)病率呈升高趨勢(shì)，是消化系統(tǒng)疾病的最常見疾病之一。研究證明，延胡索所含成分種類繁多(蔡梅超延胡索的化學(xué)成分及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究化工時(shí)刊2012，26 (3))，主要有效成分為總生物堿類，難溶于水，具有較強(qiáng)的活性，其中叔胺類成分約占65 %，季銨類成分約占30% (賀凱等延胡索化學(xué)成分、藥理作用及質(zhì)量控制研究進(jìn)展中草藥2007,38(12))，延胡索中的生物堿具有很強(qiáng)的抗炎鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、降壓和抗心律失常等作用(魯春梅延胡索化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展中國(guó)現(xiàn)代藥物應(yīng)用2011，5 (15):126~127)，除生物堿外，延胡索中尚含有大量淀粉，少量黏液質(zhì)、樹脂、揮發(fā)油等。臨床上延胡索多見于抗炎鎮(zhèn)痛的復(fù)方中，臨床治療止痛效果顯著，毒副作用小，可治療多種疾病，本發(fā)明通過體外抗?jié)冊(cè)囼?yàn)證明了其亦有明顯的抗?jié)冏饔?。而有關(guān)其有效成分總生物堿富集物純度達(dá)90%以上的高純制備方法、抗?jié)兓钚匝芯科駷橹股形匆妶?bào)道。
[0003]
【發(fā)明內(nèi)容】

本發(fā)明目的在于提供中藥延胡索總生物堿的分離純化方法。
[0004]本發(fā)明給出了一個(gè)能夠提高總生物堿純度的新方案，主要是純化延胡索中的總生物堿類活性成分，解決了總生物堿純度低，利用率低以及其治療胃潰瘍藥效低的問題。
[0005]本發(fā)明的延胡索總生物堿的分離純化方法為:一、將延胡索藥材粉碎過40-60目篩，用回流提取法對(duì)其進(jìn)行提取，然后將提取液進(jìn)行減壓濃縮；二、提取液稀釋成0.1~0.2g/mL的濃度，以mL/min的流速通過大孔吸附樹脂柱進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附；三、用4飛倍柱體積的蒸餾水清洗吸附后的樹脂柱除去水溶性雜質(zhì)，8~10倍柱體積的90%的乙醇洗脫總生物堿類有效成分，收集洗脫液并蒸干即得總生物堿一次純化產(chǎn)物富集物；四、用稀酸液溶解一次純化產(chǎn)物富集物，充分溶解均勻，先以有機(jī)溶劑萃取除雜，再加入堿化試劑調(diào)節(jié)PH，用有機(jī)溶劑萃取出總生物堿，收集有機(jī)溶劑層并回收有機(jī)溶劑、蒸干，即得高純度延胡索總生物堿富集物。
[0006]經(jīng)體外抗?jié)兗?xì)胞藥效實(shí)驗(yàn)，證明延胡索總生物堿可有效的治療潰瘍類疾病，且隨著純度的提高 ，其抗?jié)兯幮б灿辛嗣黠@的提高。
[0007]本發(fā)明優(yōu)化了萃取方法。根據(jù)延胡索總生物堿難溶于水，易溶于有機(jī)溶劑，萃取時(shí)用酸水溶解可使生物堿以鹽的形式存在于酸水中，使非生物堿類雜質(zhì)游離出來，此時(shí)萃取可將非生物堿類雜質(zhì)萃取出來，再向溶液中加入氨水堿化，使PH至擴(kuò)10，此時(shí)生物堿又重新游離出來，加入有機(jī)溶劑萃取可將生物堿類萃取出來，經(jīng)測(cè)定總生物堿純度>90%。
[0008]本發(fā)明得到的總生物堿純度達(dá)90%以上，大大提高了生物利用度，作為治療抗?jié)兊挠行С煞?，用于治療胃潰瘍、口腔潰瘍等各種潰瘍疾病。[0009]【具體實(shí)施方式】:
本發(fā)明提供以下技術(shù)措施，實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，并不是限制發(fā)明的權(quán)利范圍。
[0010]本發(fā)明的發(fā)明人根據(jù)臨床的需要將延胡索總生物堿富集物制備為各個(gè)劑型而可添加藥學(xué)上可接受的輔劑及載體供臨床選擇應(yīng)用。
[0011]實(shí)施例一
本實(shí)施方式的延胡索總生物堿制備方式為:一、將延胡索藥材粉碎過60目篩，用回流提取法對(duì)其進(jìn)行提取，然后將提取液進(jìn)行減壓濃縮；二、提取液稀釋成0.15 g/mL的濃度，以I mL/min的流速通過大孔吸附樹脂柱進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附；三、用5倍柱體積的蒸餾水清洗吸附后的樹脂柱除去水溶性雜質(zhì)，10倍柱體積的90%的乙醇洗脫總生物堿類有效成分,收集洗脫液并蒸干即得總生物堿一次純化產(chǎn)物富集物；四、用稀酸液溶解一次純化產(chǎn)物富集物，充分溶解均勻，先以有機(jī)溶劑萃取除雜，再加入堿化試劑調(diào)節(jié)PH，用有機(jī)溶劑萃取出總生物堿，收集有機(jī)溶劑層并回收有機(jī)溶劑、蒸干，即得高純度延胡索總生物堿富集物。
[0012]本實(shí)施方式的延胡索總生物堿純度達(dá)90%以上，體外抗?jié)兯幮э@著。
[0013]實(shí)施例二
本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】一不同的是步驟一中將延胡索粗粉過60目篩，加入6倍量的乙醇，回流提取法的提取溶劑為70%的乙醇，提取時(shí)間為1.5 h，提取次數(shù)為3次，其他步驟及參數(shù)與【具體實(shí)施方式】一相同。
[0014]實(shí)施例三
本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】一不同的是步驟二中將提取液稀釋以I mL/min的速度通過樹脂柱，其他步驟及參數(shù)與【具體實(shí)施方式】一相同。
[0015]實(shí)施例四
本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】一不同的是步驟三中用5倍柱體積的蒸餾水清洗吸附柱，用10倍柱體積的90%乙醇洗脫總生物堿，其他步驟及參數(shù)與【具體實(shí)施方式】一相同。
[0016]本實(shí)施方式的延胡索總生物堿純度為48%。
[0017]實(shí)施例五
本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】一不同的是步驟四中采用的稀酸溶液為0.1 mol/L鹽酸溶液，采用的除雜的有機(jī)溶劑為氯仿，與藥液的體積比為1:1，其他步驟及參數(shù)與【具體實(shí)施方式】一相同。
[0018]實(shí)施例六
本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】一不同的是步驟四中經(jīng)有機(jī)溶劑萃取除雜后的藥液，采用的堿化試劑是氨水，堿化藥液的PH為10,堿化時(shí)間為40 min,再用有機(jī)溶劑萃取的方法萃取延胡索總生物堿，其他步驟及參數(shù)與【具體實(shí)施方式】一相同。
[0019]實(shí)施例七
本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】一不同的是步驟四中采用的有機(jī)萃取溶劑為氯仿、乙酸乙酯或正丁醇，按照極性由小到大的順序分段綜合萃取，收集并合并有機(jī)溶劑層，其他步驟及參數(shù)與【具體實(shí)施方式】一相同。
[0020]實(shí)施例八
本實(shí)施方式的延胡索總生物堿制備方式為:一、將延胡索藥材粉碎過60目篩，用回流提取法對(duì)其進(jìn)行提取，然后將提取液進(jìn)行減壓濃縮；二、提取液稀釋成0.15 g/mL的濃度，以I mL/min的流速通過大孔吸附樹脂柱進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附；三、用5倍柱體積的蒸餾水清洗吸附后的樹脂柱除去水溶性雜質(zhì)，10倍柱體積的90%的乙醇洗脫總生物堿類有效成分，收集洗脫液并蒸干即得總生物堿一次純化產(chǎn)物富集物；四、用0.lmol/L的稀鹽酸溶解一次純化產(chǎn)物富集物，充分溶解均勻，生物堿以鹽的形式存在，先以等體積的氯仿萃取除去游離的非生物堿類雜質(zhì)，再加入氨水堿化調(diào)節(jié)PH為10堿化40 min，繼續(xù)按照氯仿、乙酸乙酯、正丁醇的順序以藥液等體積的有機(jī)溶劑分段萃取，收集并合并有機(jī)溶劑層，即得高純度延胡索總生物堿富集物。[0021]本實(shí)施方式的延胡索總生物堿純度為92%，大大提高了生物利用度。
[0022]藥效試驗(yàn):
體外細(xì)胞藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)
一、人胃粘膜上皮細(xì)胞GES-1細(xì)胞株用DMEM培養(yǎng)基加10%的小牛血清，在標(biāo)準(zhǔn)C02培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)2~3天，隔天換液，約90%滿瓶時(shí)傳代[8]。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、狀態(tài)良好的細(xì)胞，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100 UL(除空白調(diào)零孔外)。設(shè)空白調(diào)零孔(只加培養(yǎng)基，酶標(biāo)儀調(diào)零用)、空白對(duì)照孔、模型孔，和給藥試驗(yàn)孔(給藥試驗(yàn)孔分為六組)，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。置370C 5% C02培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)約12 h，待細(xì)胞貼壁完全，棄去舊培養(yǎng)液，PBS洗2次，用不完全培養(yǎng)基同步24 h，PBS洗2次。
[0023]細(xì)胞損傷模型的制備:模型控和給藥試驗(yàn)孔分別補(bǔ)加100 UL 8 %無水乙醇，培養(yǎng)
2h后吸棄培養(yǎng)基，PBS洗2次。經(jīng)MTT檢測(cè)使細(xì)胞抑制率達(dá)到30%左右。
[0024]二、MTT法測(cè)定細(xì)胞抑制率
空白對(duì)照孔和模型孔分別補(bǔ)加100 μ L培養(yǎng)基培養(yǎng)2 h后吸棄培養(yǎng)基，PBS洗2次?？瞻讓?duì)照孔和模型孔加入100 μ? 10 %空白血漿，給藥試驗(yàn)孔分別加延胡索一次純化生物堿富集物高、中、低劑量組，延胡索二次純化生物堿富集物高、中、低劑量組的供試品溶液經(jīng)大鼠灌胃給藥得到的含藥血漿100 μ L，濃度為10 %。各組細(xì)胞經(jīng)分別處理后于37 °C、5 %C02培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每孔補(bǔ)加20 μ L培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)3 h，每孔加入200 μ L/孔新鮮配置的含0.2 mg/mL MTT的無血清培養(yǎng)液于37 °C CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，吸棄上清液，加入DMSO 200 μ L,震蕩混勻后易溶解結(jié)晶，用酶標(biāo)儀于490nm波長(zhǎng)處讀取光密度值A(chǔ)49tl，測(cè)定OD值。按下式計(jì)算不同組細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率。MTT抑制率=(0D試驗(yàn)組/OD對(duì)照組一I) X100%。
[0025]表1不同組別含藥血漿對(duì)損傷GES-1細(xì)胞光密度及抑制率的影響
【權(quán)利要求】
1.延胡索總生物堿的分離純化方法，其特征在于包括下述工藝步驟: 1)將延胡索藥材粉碎過60目篩，用回流提取法對(duì)其進(jìn)行提取，然后將提取液進(jìn)行減壓濃縮； 2)提取液稀釋成0.15 g/mL的濃度，以1飛mL/min的流速通過大孔吸附樹脂柱進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附； 3)用5倍柱體積的蒸餾水清洗吸附后的樹脂柱除去水溶性雜質(zhì)，再用乙醇洗脫總生物堿類有效成分，收集洗脫液并蒸干即得總生物堿一次純化產(chǎn)物富集物； 4)用稀酸液溶解一次純化產(chǎn)物富集物，充分溶解均勻，先以有機(jī)溶劑萃取除雜，再加入堿化試劑調(diào)節(jié)PH，用有機(jī)溶劑萃取出總生物堿，收集有機(jī)溶劑層并回收有機(jī)溶劑、蒸干，SP得。
2.按照權(quán)利要求1所述的延胡索總生物堿的分離純化方法，其特征在于步驟一中的回流提取法提取溶劑為70%的乙醇。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2中延胡索總生物堿的分離純化方法，其特征在于向延胡索粗粉中加入6倍量的乙醇，提取時(shí)間為1.5 h，提取次數(shù)為3次。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的延胡索總生物堿的分離純化方法，其特征在于步驟二中將提取液以I ml/min的流速通過AB-8大孔吸附樹脂進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的延胡索總生物堿的分離純化方法，其特征是步驟三中以10倍柱體積90%的乙醇洗脫延胡索 總生物堿。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的延胡索總生物堿的分離純化方法，其特征為步驟四中采用的稀酸溶液為0.lmol/L鹽酸溶液。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的延胡索總生物堿的分離純化方法，其特征為步驟四中采用的有機(jī)溶劑為氯仿、乙酸乙酯或正丁醇。
8.根據(jù)權(quán)利要求1和5所述的延胡索總生物堿的分離純化方法，其特征為步驟四中萃取時(shí)采用的堿化試劑為氨水、三乙胺、碳酸鈉、氫氧化鈣溶液或氫氧化鈉溶液。
9.根據(jù)權(quán)利要求1和7所述的延胡索總生物堿的分離純化方法，其特征在于加入I倍體積的有機(jī)溶劑萃取。
10.根據(jù)權(quán)利要求1和8所述的延胡索總生物堿的分離純化方法，其特征在于堿化試劑調(diào)節(jié)PH至10，堿化時(shí)間為40 min。
【文檔編號(hào)】A61P1/02GK103623064SQ201310569458
【公開日】2014年3月12日 申請(qǐng)日期:2013年11月15日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月15日
【發(fā)明者】孟憲生, 李爽, 包永睿, 王帥 申請(qǐng)人:遼寧中醫(yī)藥大學(xué)