水凝膠的緊密度且因此其是基本參數(shù)。G'（彈性模量）在0. 07至90.0 rad/s以Pa測 定，力值為10%。從使用低功率UV燈輻照后膠凝的樣品獲得的數(shù)值與交聯(lián)百分比（通過 HPLC-MS分析計算）直接相關(guān)，假設(shè)在t 0的光聚合百分比是零。
[0163] 從圖（圖9)中將會看出，彈性模量G'（表示為Pa，在0,628rad/s)的趨勢與交聯(lián) 程度的趨勢成比例；因此輻照更長時間的溶液交聯(lián)更高，所以顯示更佳的彈性性質(zhì)，具有更 高的G'值。
[0164] 實施例22:對在由（9)制備的水凝膠的存在下的人成纖維細(xì)胞培養(yǎng)物細(xì)胞增殖的 評價。
[0165] 評價細(xì)胞增殖的標(biāo)準(zhǔn)方案涉及MTT試驗的應(yīng)用。簡言之，所述試驗定量測定培養(yǎng) 的細(xì)胞中琥珀酸脫氫酶活性的存在；僅存在于存活細(xì)胞的線粒體中的所述活性通常用作檢 查培養(yǎng)的細(xì)胞的代謝活性、生存力和由此的生長的標(biāo)志。該試驗基于琥珀酸脫氫酶使唑鑰 染料MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基）2,5二苯基四氮唑溴化物）從黃至藍(lán)的轉(zhuǎn)化。分光 光度計測量的藍(lán)色染料（甲If )的量與細(xì)胞培養(yǎng)物中存在的琥珀酸脫氫酶成比例，因此與 存活細(xì)胞的數(shù)量成比例。
[0166] 在以濃度20mg/mL或30mg/mL在溶液中的（9)的存在下（以增加的濃度（20、50、 100 y L))，或者在對照情況中僅為培養(yǎng)基，將混懸于適合的培養(yǎng)基中的人成纖維細(xì)胞（HF) 接種于24-孔多孔板中。將細(xì)胞（HF)用0. 5mg/mL MTT溶液在37°C孵育3小時。在孵育 的末尾，使用提取溶液（90%異丙醇、10% DMS0)從HF中提取染料，并在570nm的波長讀取 (0D、光密度）。
[0167] 24h 后在 570nm 檢測 0D 值（圖 10)。
[0168] 圖10顯示由此制備的HA衍生物的溶液是無毒的，甚至在逐漸增加的量的情況下 如此，并且保持了細(xì)胞生存力。
[0169] 實施例23:評價在如實施例19所述制備的海綿上的人成纖維細(xì)胞增殖。
[0170] 將人成纖維細(xì)胞（HF)混懸物接種于如實施例19所述制備的海綿上，并轉(zhuǎn)移至 24-孔板。接種后1小時，加入lmL培養(yǎng)基；在培養(yǎng)3和7天后進行MTT試驗（圖11)。
[0171] 對照由接種于24孔多空板的并僅用培養(yǎng)基處理的相同量的HF組成。
[0172] 從圖（圖11)中可以看出，接種于海綿的人成纖維細(xì)胞在3和7天培養(yǎng)后是活的、 能生存的和增殖的。它們的生存力是這樣的以致誘導(dǎo)比對照更高的增殖；在3天后增殖的 百分比更佳，而且在7天后也是相當(dāng)大的。這些結(jié)果清楚地證明了如本發(fā)明描述制備的海 綿不僅對細(xì)朐不具有仵何毒件，而目.實際h還促講細(xì)朐增葙。應(yīng)當(dāng)知曉的是，在接種于海綿 上并且隨后轉(zhuǎn)移至孔中的過程中，許多細(xì)胞損失了，所以在圖11中顯示的增殖數(shù)值甚至是 更令人驚訝的。
[0173] 實施例24:以1:1的w/w比例添加膠原蛋白的源自（9)的溶液的水凝膠的制備。
[0174] 將600mg如實施例9中所述得到HA酯衍生物溶于20mL鹽水中，得到30mg/mL的 濃度。溶液化完成后，在冰浴中通過逐漸加入〇. 05M HC1將pH調(diào)節(jié)至弱酸性值（pH ~ 4)。 然后加入預(yù)先制備的濃度60mg/ml的10mL來自馬腱的膠原蛋白的酸溶液。在完全混合后， 將該溶液經(jīng)〇. 2 y m過濾器微孔過濾，置于容器中，并在室溫用波長300-380nm的光束輻照 3至15分鐘。
[0175] 得到了在切割或操作后能保持其形狀的緊密的水凝膠。
[0176] 實施例25:從已知濃度的（9)的溶液以1:1的w/w比例加入膠原蛋白來制備海綿。
[0177] 將400.0 mg如實施例9中所述得到的HA酯衍生物溶于20mL Milli-Q水中，得到 濃度20mg/mL的溶液。在完全溶液化后，在冰浴中通過逐漸加入0. 05M HC1將pH調(diào)節(jié)至弱 酸性值（pH ~ 4)。然后加入預(yù)先制備的濃度40mg/ml的10mL來自馬腱的膠原蛋白的酸溶 液。在完全混合后，將該溶液經(jīng)〇. 2 y m過濾器微孔過濾，并傾入直徑5. Ocm的圓形玻璃盤 中。
[0178] 將該溶液冷凍干燥，并如實施例10中所述進行輻照。將得到的海綿浸入30mL鹽水 溶液中不發(fā)生溶解或碎裂，甚至在與該含水溶液長時間接觸（72-96h)后也不溶解或碎裂， 且具有與實施例20中描述的海綿類似的形狀記憶性質(zhì)。
[0179] 實施例26:從已知濃度的（9)的溶液以1:4的w/w比例加入膠原蛋白來制備海綿。
[0180] 將400.0 mg如實施例9中所述得到的HA酯衍生物溶于20mL Milli-Q水中，得到 濃度20mg/mL的溶液。在完全溶液化后，在冰浴中通過逐漸加入0. 05M HC1將pH調(diào)節(jié)至弱 酸性值（pH ~ 4)。然后加入預(yù)先制備的濃度160mg/ml的10mL來自馬腱的膠原蛋白的酸溶 液。在完全混合后，將該溶液經(jīng)〇. 2 y m過濾器微孔過濾，并傾入直徑5. Ocm的圓形玻璃盤 中。
[0181] 將該溶液冷凍干燥，并如實施例10中所述進行輻照。將得到的海綿浸入30mL鹽水 溶液中不發(fā)生溶解或碎裂，甚至在與該含水溶液長時間接觸（72-96h)后也不溶解或碎裂。
[0182] 所述海綿保持與實施例20中描述的海綿的形狀記憶性質(zhì)，甚至在機械應(yīng)力后保 持其結(jié)構(gòu)和彈性。由于本文描述并證實的因素，本申請人旨在要求均具有形狀記憶特性的 水凝膠和海綿，其由以下構(gòu)成：通過醚鍵鍵合于PEG的傘形酮或苯基乙基酮，以及得到的產(chǎn) 物，所述產(chǎn)物還通過酯或酰胺鍵鍵合于透明質(zhì)酸；其還旨在要求所述水凝膠的制備方法，其 包括將所述化合物溶液化，隨后輻照獲得的溶液，及海綿制備方法，其包括將所述起始化合 物溶液化，將得到的溶液冷凍干燥，隨后進行輻照。水凝膠和海綿均適合用于醫(yī)學(xué)、化妝品 和醫(yī)學(xué)護膚品領(lǐng)域，單獨使用或與藥理學(xué)和/或生物學(xué)活性物質(zhì)組合使用，或與細(xì)胞組合 使用。特別地，均適合用于以下特定的應(yīng)用：
[0183] -骨關(guān)節(jié)炎和軟骨損傷的關(guān)節(jié)內(nèi)治療，
[0184] -活性成分的釋放，
[0185] -用于醫(yī)藥應(yīng)用的對象的包衣，
[0186] -軟組織的填充，
[0187] _防止術(shù)后粘連，和填充術(shù)后的深的形成腔洞的損害。
【主權(quán)項】
1. 透明質(zhì)酸（HA)的光交聯(lián)的衍生物，其由HA、作為三甘醇的聚乙二醇（PEG)雙功能間 隔基和選自香豆素衍生物和苯基乙基酮的光反應(yīng)性的化合物構(gòu)成。2. 根據(jù)權(quán)利要求1的衍生物，其中所述香豆素衍生物選自傘形酮、七葉亭、東莨菪亭、 補骨脂素類、呋喃并香豆素類化合物和雙香豆素，且優(yōu)選是傘形酮。3. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任意一項的衍生物，其中光反應(yīng)性的化合物與雙功能間隔基之 間的鍵是醚鍵。4. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任意一項的衍生物，其中雙功能間隔基與HA之間的鍵是酯或 酰胺鍵。5. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任意一項的衍生物，其中HA具有40kDa至700kDa、優(yōu)選160至 220kDa的重量-平均MW。6. 形狀記憶水凝膠或形狀記憶海綿形式的根據(jù)前述權(quán)利要求中任意一項的衍生物。7. 根據(jù)權(quán)利要求6的衍生物，其還包含藥理學(xué)和/或生物學(xué)活性物質(zhì)、諸如營養(yǎng)因子、 抗生素、留體和非留體抗炎藥、蛋白質(zhì)、肽、激素、血小板提取物或者分化的和/或未分化的 細(xì)胞。8. 如權(quán)利要求6中所要求的衍生物，其還包含膠原蛋白、優(yōu)選天然膠原蛋白和/或水解 膠原蛋白。9. 包含透明質(zhì)酸（HA)、作為三甘醇的聚乙二醇（PEG)雙功能間隔基和選自香豆素衍生 物和苯基乙基酮的光反應(yīng)性的化合物的可交聯(lián)的等滲溶液，其中雙功能間隔基與HA之間 的鍵是酯或酰胺鍵，且其中光反應(yīng)性的化合物與雙功能間隔基之間的鍵是醚鍵。10. 形狀記憶水凝膠形式的根據(jù)權(quán)利要求1-8中任意一項的衍生物的制備方法，其包 括以下步驟： a. 形成三甘醇與香豆素衍生物或苯基乙基酮之間的醚鍵； b. 形成步驟a)中得到的產(chǎn)物和HA之間的酯或酰胺鍵，在酯鍵的情況中HA的最終衍生 程度為5至80mol%，在酰胺鍵的情況中HA的最終衍生程度為1至50mol% ; c. 將步驟b)中得到的產(chǎn)物溶液化，并通過波長300至450nm、優(yōu)選320至380nm的UV 光將得到的等滲含水溶液輻照1分鐘至24小時。11. 形狀記憶海綿形式的根據(jù)權(quán)利要求1-8中任意一項的衍生物的制備方法，其包括 以下步驟： a. 形成三甘醇與香豆素衍生物或苯基乙基酮之間的醚鍵； b. 形成步驟a)中得到的產(chǎn)物和HA之間的酯或酰胺鍵，在酯鍵的情況中HA的最終衍生 程度為5至80mol%，在酰胺鍵的情況中HA的最終衍生程度為1至50mol% ; b'）將步驟b)中得到的產(chǎn)物在等滲含水溶液中溶液化，并將由此得到的等滲含水溶液 冷凍干燥； c?通過波長300至450nm、優(yōu)選320至380nm的UV光將步驟b'）中得到的凍干產(chǎn)物輻 照1分鐘至24小時。12. 如權(quán)利要求10-11中任意一項所要求的衍生物的制備方法，其還包括在HA輻照步 驟之前添加膠原蛋白的步驟。13. 用于骨關(guān)節(jié)炎和軟骨損傷的關(guān)節(jié)內(nèi)治療的根據(jù)權(quán)利要求1-8的形狀記憶水凝膠形 式的透明質(zhì)酸的光交聯(lián)的衍生物。14. 用于活性成分的釋放、用于醫(yī)藥應(yīng)用的對象的包衣、軟組織的填充和防止術(shù)后粘連 的根據(jù)權(quán)利要求1-8的形狀記憶水凝膠形式的透明質(zhì)酸的光交聯(lián)的衍生物。15. 用于填充術(shù)后的深的形成腔洞的損害的如權(quán)利要求1-8中所要求的形狀記憶水凝 膠形式的透明質(zhì)酸的光交聯(lián)的衍生物。16. 用于骨關(guān)節(jié)炎和軟骨損傷的關(guān)節(jié)內(nèi)治療的根據(jù)權(quán)利要求1-8形狀記憶海綿形式的 透明質(zhì)酸的光交聯(lián)的衍生物。17. 用于活性成分的釋放、用于醫(yī)藥應(yīng)用的對象的包衣、軟組織的填充和防止術(shù)后粘連 的根據(jù)權(quán)利要求1-8的形狀記憶海綿形式的透明質(zhì)酸的光交聯(lián)的衍生物。18. 用于填充術(shù)后的深的形成腔洞的損害的如權(quán)利要求1-8中所要求的形狀記憶海綿 形式的透明質(zhì)酸的光交聯(lián)的衍生物。19. 醫(yī)學(xué)裝置，其包含至少一種根據(jù)權(quán)利要求1-8中任意一項的光交聯(lián)的衍生物。
【專利摘要】本發(fā)明公開了光交聯(lián)透明質(zhì)酸(HA)衍生物，其由HA、作為三甘醇的雙功能聚乙二醇(PEG)間隔基和選自香豆素衍生物和苯基乙基酮的光反應(yīng)性的化合物構(gòu)成。
【IPC分類】C08B37/08, A61L27/38, A61L27/20, A61K31/728, A61L27/36
【公開號】CN104968375
【申請?zhí)枴緾N201480007375
【發(fā)明人】M·坎皮西, 魯齊 O·德, R·本尼納托, G·博爾薩托
【申請人】菲迪亞制藥股份公司
【公開日】2015年10月7日
【申請日】2014年2月4日
【公告號】CA2900155A1, EP2953656A1, WO2014122580A1